一种干细胞冻存保护剂及其使用方法
阅读说明：本技术 一种干细胞冻存保护剂及其使用方法 (Stem cell cryopreservation protective agent and application method thereof ) 是由 于兵 朱梦梅 汪超 胡以平 于 2021-08-10 设计创作，主要内容包括：本发明专利公开了一种干细胞冻存保护剂及其使用方法,具体涉及干细胞的技术领域。该干细胞冻存保护剂,包含如下浓度的组分：甘油：15-30％(v/v),蔗糖：0.25-0.5Mol,非必需氨基酸混合液：1×,N-乙酰-L半胱氨酸：1-5mM。本发明的干细胞冻存保护剂的成分明确,不含生物毒性物质,无异种动物蛋白或血液制品,无异种抗原,发生超敏反应的概率较低,具有较高的生物安全性和广泛的临床应用前景。该干细胞冻存保护剂不仅原料价格低廉,且操作方便,易于推广,可实现低成本大量冻存干细胞。(The invention discloses a stem cell cryopreservation protective agent and a using method thereof, and particularly relates to the technical field of stem cells. The stem cell cryopreservation protective agent comprises the following components in concentration: glycerol: 15-30% (v/v), sucrose: 0.25-0.5Mol, non-essential amino acid mixture: 1 ×, N-acetyl-L cysteine: 1-5 mM. The stem cell cryopreservation protective agent disclosed by the invention is definite in components, free of biological toxic substances, free of xenogenic animal protein or blood products, free of xenogenic antigens, low in probability of generating hypersensitivity, high in biological safety and wide in clinical application prospect. The stem cell cryopreservation protective agent has the advantages of low raw material price, convenient operation, easy popularization and capability of realizing low cost and mass cryopreservation of stem cells.)
技术领域
本发明涉及干细胞的技术领域，特别涉及一种化学成份明确的干细胞冻存保护剂及其使用方法。
背景技术
干细胞具有自我更新和分化为多种成熟细胞的能力。同时还能分泌细胞因子和生长因子等生物活性物质，通过旁分泌信号传导机制的方式刺激组织器官的损伤修复或再生，是组织损伤(如肝损伤、难愈性创面)细胞移植治疗、药物筛选或组织工程的种子细胞来源。某些干细胞，如间充质干细胞，亦具有免疫调节的功能，可用于自身免疫性疾病、肿瘤等治疗，甚至可以进行同种异体移植治疗。干细胞的研究与应用已成为生物医药领域最前沿、最热门的研究热点之一。
目前，干细胞的来源主要还是从供体器官中分离获得。其来源与数量并不能满足临床治疗的时机与需求。如能保证充足数量干细胞的储备，可随时解决临床治疗过程中对干细胞需求的时机与数量。干细胞的储备方法也就是干细胞的长期冷冻保存，然而，在细胞冻存过程中，细胞内形成的冰晶会对细胞形成不可逆的损伤，对细胞的活性与功能有着明显不利的影响。而细胞冻存保护剂的使用可减少细胞在隆温过程中冰晶的形成，发挥保护细胞活性与功能的作用。
目前，常用的细胞冻存保护剂主要有两类，一类为渗透性保护剂，如二甲基亚砜(DMSO)、甘油、丙二醇、乙二醇。这类保护剂大多数是小分子物质，易于穿透细胞膜进入细胞内，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤。同时，细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。另一类为非渗透性保护剂，如聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白等。它们发挥作用的机制可能是：作为大分子物质的非渗透性保护剂可以优先与溶液中的水分子相结合，降低溶液中自由水的含量，从而冰点降低并减少冰晶的形成；同时，由于其分子量大，使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤。
二甲基亚砜(DMSO)是最为常用的细胞冻存保护剂，但DMSO在常温下为细胞毒性物质，在临床使用时难以保证冻存的细胞在复苏时能够被洗脱干净。而当前最常用的冷冻技术是将细胞置于含10％DMSO的冻存液中，然后通过一系列的程序隆温后再储存于液氮中。细胞在低温冻存过程中会导致氧自由基ROS等产生过多积累在细胞内，从而在复苏过程中会对其形成氧化应激损伤，故急需一种能够安全可靠的干细胞冻存保护剂。
发明内容
本发明意在提供一种成分明确、安全性高、价格低廉、使用方便且冻存效果好的干细胞冻存保护剂及其制备方法，从而提供解决了现有的干细胞冻存保护剂成本高昂和易造成患者不良反应的问题。
为了达到上述目的，本发明提供一种化学成份明确的干细胞冻存保护剂，包含如下浓度的组分：
甘油：15-30％(v/v)，
蔗糖：0.25-0.5Mol，
非必需氨基酸混合液：1×，
N-乙酰-L半胱氨酸：1-5mM。
进一步的，所述干细胞冻存保护剂的溶剂为DMEM、DMEM/F12、以及RPMI-1640基础培养液。
本发明提供的一种干细胞冻存保护剂的使用方法，包括如下步骤：
S1、将贴壁生长的细胞制备成单细胞悬液，计数细胞数量；
S3、将S1中的单细胞悬液离心收集，单细胞悬液需500g并离心5分钟，去除上清并保留细胞沉淀；
S5、将上述的干细胞冻存保护剂重悬细胞，并将细胞密度控制在1×105-5×106/mL；
S7、将S5中重悬的细胞分装于冻存管内，直接放置于-80℃冰箱；
S9、24小时后，将S7中冻存的细胞移至液氮中长期保存。
进一步的，所述的冻存保护剂可用于冻存所有细胞。
与现有技术相比，本方案的有益效果：
1、本方案可使干细胞冻存保护剂的原料制备中不含血清和白蛋白等动物蛋白或血液制品，无人畜共患疾病传播的风险，也无异种蛋白或抗原致敏的风险；
2、本方案提供的干细胞冻存保护剂中添加的原料成份明确，且不含有对人体具有毒性的DMSO，安全性较高；
3、本方案提供的干细胞冻存保护剂在细胞冻存过程中，不需要使用程序降温装置，可直接放置于-80℃冰箱，从而使细胞冻存的程序得以简化。
4、本方案提供的保护剂制造成本低廉，大剂量应用的可能性大，且冻存细胞的操作方法简便，易于推广应用。
附图说明
图1是实施例1中PI染色后的流式检测的散点图；
图2是实施例1中细胞存活率
骨髓间充质干细胞在液氮中保存1月，3月，6月以及12月后经37℃水浴快速解冻复苏后，PI染色，流式细胞仪检测细胞的存活率。A.PI染色后，流式检测的散点图；B.对各时间点PI染色阴性活细胞比例的统计结果，提示各时间点之间的细胞存活率无明显差异。
图2：骨髓间充质干细胞在液氮中保存1月，3月，6月以及12月后经37℃水浴快速解冻复苏，培养24小时后的形态图。
图3：CCK8检测骨髓间充质干细胞在液氮中保存1月，3月，6月以及12月后经37℃水浴快速解冻复苏后的增殖能力。
图4：EpCAM阳性的肝脏干细胞在液氮中保存1月，6月以及12月后经37℃水浴快速解冻复苏后，PI染色，流式细胞仪检测细胞的存活率。A.PI染色后，流式检测的散点图；B.对各时间点PI染色阴性活细胞比例的统计结果，提示各时间点之间的细胞存活率无明显差异。
图5：EpCAM阳性的肝脏干细胞在液氮中保存1月，6月以及12月后经37℃水浴快速解冻复苏，培养24小时后的形态图。
图6：CCK8检测EpCAM阳性的肝脏干细胞在液氮中保存1月，6月以及12月后经37℃水浴快速解冻复苏后的增殖能力。
图7：HT29结肠癌细胞在液氮中保存1月，6月以及12月后经37℃水浴快速解冻复苏后，PI染色，流式细胞仪检测细胞的存活率。A.PI染色后，流式检测的散点图；B.对各时间点PI染色阴性活细胞比例的统计结果，提示各时间点之间的细胞存活率无明显差异。
图8：HT29结肠癌细胞在液氮中保存1月，6月以及12月后经37℃水浴快速解冻复苏，培养24小时后的形态图。
图9：CCK8检测HT29结肠癌细胞在液氮中保存1月，6月以及12月后经37℃水浴快速解冻复苏后的增殖能力。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：
实施例1：
一种干细胞冻存保护剂，包含如下浓度的组分：15％甘油(v/v)、0.3Mol蔗糖、1×非必需氨基酸混合液和1mMN-乙酰-L半胱氨酸，将上述组分在添加至DMEM基础培养基中。将上述制备的干细胞冻存保护剂用于冻存骨髓间充质干细胞，
其具体实施步骤如下：
S1、将培养至80％融合密度的骨髓间充质干细胞用胰酶消化制备成单细胞悬液，用血球计数板计数细胞；
S3、提取S1的单细胞悬液，利用离心机将500g单细胞悬液离心5分钟，然后去除上清并保留细胞沉淀；
S5、将上述的干细胞冻存保护剂重悬细胞，将细胞密度控制在1×105-5×106/mL；
S7、向2ml冻存管内加入S5中1ml干细胞冻存保护剂重悬的细胞；直接将细胞置于-80℃冰箱；
S9、24小时后，将S7中冻存的细胞转移至液氮长期保存。
如附图1所示，将S9的细胞在液氮保存1月、3月、6月以及12月后，分别将冻存的细胞取出放置在37℃水浴快速解冻，然后用PI染色，流式检测细胞活力，结果显示在液氮保存12个月后，细胞活力保持在94％以上，且与短时间内保存的细胞相比，无明显变化。
如附图2所示，细胞复苏24小时后，镜下观察显示液氮中保存1月、3月、6月以及12月后的细胞无明显形态上的差别。如附图3所示，CCK8检测结果提示液氮中保存1月、3月、6月以及12月后的细胞在增殖能力上也无明显差别。
实施例2：
一种干细胞冻存保护剂，包含如下浓度的组分：30％甘油(v/v)、0.5Mol蔗糖、1×非必需氨基酸混合液和5mMN-乙酰-L半胱氨酸，将上述组分在添加至DMEM/F12基础培养基中。将上述制备的干细胞冻存保护剂用于冻存EpCAM阳性的肝脏干细胞，
其具体实施步骤如下：
S1、将培养至80％融合密度的EpCAM阳性的肝脏干细胞用胰酶消化制备成单细胞悬液，用血球计数板计数细胞；
S3、提取S1的单细胞悬液，单细胞悬液需500g并离心5分钟，然后去除上清并保留细胞沉淀；
S5、将上述的干细胞冻存保护剂重悬细胞，将细胞密度控制在1×105-5×106/mL；
S7、向2ml冻存管内加入S5中1ml干细胞冻存保护剂重悬的细胞；直接将细胞置于-80℃冰箱；
S9、24小时后，将S7中冻存的细胞转移至液氮长期保存。
如附图4所示，将S9的细胞在液氮保存1月、6月以及12月后，分别将冻存的细胞取出放置在37℃水浴快速解冻，然后用PI染色，流式检测细胞活力，结果显示在液氮保存12个月后，细胞活力保持在96％以上，且与短时间内保存的细胞相比，无明显变化。
如附图5所示，细胞复苏24小时后，镜下观察显示液氮中保存1月、6月以及12月后的细胞无明显形态上的差别。如附图6所示，CCK8检测结果提示液氮中保存1月、3月、6月以及12月后的细胞在增殖能力上也无明显差别。
实施例3：
一种干细胞冻存保护剂，包含如下浓度的组分：20％甘油(v/v)、0.25Mol蔗糖、1×非必需氨基酸混合液和2.5mMN-乙酰-L半胱氨酸，将上述组分在添加至RPMI-1640基础培养基中。将上述制备的干细胞冻存保护剂用于HT29结肠癌细胞，
其具体实施步骤如下：
S1、将培养至70-80％融合密度的HT29结肠癌细胞用胰酶消化制备成单细胞悬液，用血球计数板计数细胞；
S3、提取S1的单细胞悬液，单细胞悬液需500g并离心5分钟，然后去除上清并保留细胞沉淀；
S5、将上述的干细胞冻存保护剂重悬细胞，将细胞密度控制在1×105-5×106/mL；
S7、向2ml冻存管内加入S5中1ml干细胞冻存保护剂重悬的细胞；直接将细胞置于-80℃冰箱；
S9、24小时后，将S7中冻存的细胞转移至液氮长期保存。
如附图7所示，将S9的细胞在液氮保存1月、6月以及12月后，分别将冻存的细胞取出放置在37℃水浴快速解冻，然后用PI染色，流式检测细胞活力，结果显示在液氮保存12个月后，细胞活力保持在96％以上，且与短时间内保存的细胞相比，无明显变化。
如附图8所示，细胞复苏24小时后，镜下观察显示液氮中保存1月、6月以及12月后的细胞无明显形态上的差别。如附图9所示，CCK8检测结果提示液氮中保存1月、3月、6月以及12月后的细胞在增殖能力上也无明显差别。
以上的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
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