一种提高棉花抗旱性的多肽类抗旱剂及其应用
阅读说明：本技术 一种提高棉花抗旱性的多肽类抗旱剂及其应用 (Polypeptide drought-resistant agent for improving cotton drought resistance and application thereof ) 是由 孔祥强 胡秋月 唐薇 罗振 卢合全 尹静 秦澜 于 2021-09-17 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种提高棉花抗旱性的多肽类抗旱剂及其应用。本发明的多肽类抗旱剂的核心成分是小分子多肽DRP-C,其氨基酸序列为RRVPNGPDPIHN。本发明首次以人工合成小分子多肽DRP-C作为棉花抗旱剂的核心成分,利用叶片喷施的方式,通过诱导棉花体内ABA合成基因表达的方式,提高棉花体内ABA含量,提高棉花抗旱能力。试验表明：施加DRP-C水溶液后,通过提高棉花本身ABA提高了棉花的抗旱性、干旱胁迫下的存活率,促进了干旱胁迫下棉花的生长。(The invention discloses a polypeptide drought-resistant agent for improving cotton drought resistance and application thereof. The core component of the polypeptide drought resistant agent is small molecular polypeptide DRP-C, and the amino acid sequence of the polypeptide drought resistant agent is RRVPNGPDPIHN. The artificially synthesized small molecular polypeptide DRP-C is used as a core component of the cotton drought-resistant agent for the first time, the ABA content in cotton is increased by using a leaf spraying mode and inducing ABA synthetic gene expression in cotton, and the drought-resistant capability of cotton is improved. The test shows that: after the DRP-C aqueous solution is applied, the drought resistance of the cotton and the survival rate under drought stress are improved by improving the ABA of the cotton, and the growth of the cotton under drought stress is promoted.)
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种提高棉花抗旱性的多肽类抗旱剂及其应用。
背景技术
我国淡水资源缺乏，总量约为28000亿立方米，人均水资源量仅为世界平均水平的1/4。我国有近一半陆地受到干旱和半干旱胁迫。干旱胁迫抑制植物生长，严重影响农作物产量。干旱胁迫下，植物一方面通过合成积累渗透保护物质等策略促进根系吸收水分，另一方面通过调控气孔关闭减少蒸腾，提高植物抗旱性，减轻干旱胁迫。植物激素ABA(脱落酸)和JA(茉莉酸)等在调节气孔开闭，提高植物抗旱性方面起着重要的作用。目前，已发现外源施加ABA、JA等激素和氯化镧、氯化钙等化学物质都可提高植物的抗旱性，过量表达ABA和JA等合成基因，提高植物内源ABA和JA含量也可提高植物的抗旱能力。但是由于ABA见光易分解并且价格较高，通过叶片或者根际浇灌ABA的方式效果欠佳，而采用ABA合成关键基因在目标作物中过量表达，提高转基因作物中ABA含量的方式，由于产生的作物是转基因的，涉及转基因安全评价问题。因此申请人研发了一种通过叶面喷施小分子多肽来提高植物抗旱性的方式来解决上述问题。
小分子多肽是一类具有类似激素功能的物质，越来越多研究发现：小分子多肽具有提高植物抵抗非生物胁迫(盐胁迫和干旱胁迫等)和生物胁迫(各种病害)、调控植物果实脱落、调控豆科植物根系根瘤菌形成以及调控植物吸收养分等功能。最近研究发现：多肽类物质可以诱导植物体内ABA合成基因NCED表达，提高植物地上部ABA含量，从而提高植物的抗旱能力。因此，寻找能够提高作物抗旱性的植物内源小分子多肽，进行人工合成并根源或叶源喷施到农作物，对增强农作物抗旱、提高产量具有重要意义。
发明内容
基于此，本发明提供了一种提高棉花抗旱性的多肽类抗旱剂及其应用。本发明首先筛选到抗旱活性较高的植物内源性小分子多肽DRP-C序列，将其加水配制成抗旱剂进行叶面喷施，可以提高植物抗旱能力，可以适用于棉花、小麦、玉米、花生、谷子或高粱等农作物，尤其适合于棉花抗旱。
本发明提供了一种提高棉花抗旱性的多肽类抗旱剂，其活性成分是具有12个氨基酸组成的小分子多肽DRP-C(Drought resistant polypeptide of cotton)，其氨基酸序列为RRVPNGPDPIHN。
该抗旱剂的配制方法：将DRP-C粉末配置成终浓度为5-20μM的DRP-C水溶液，优选10μM；或者先将DRP-C配制成10mM母液，低温(4℃)保存，使用时稀释成DRP-C 10μM的工作液，然后叶面喷施棉花等作物。
本发明还提供该多肽类抗旱剂的应用方法：用于室内种植的棉花，可直接利用自来水配制多肽类抗旱剂，该抗旱剂成分及终浓度为10μM DRP-C。室内培养作物土壤含水量达到60％时开始叶片喷施多肽类抗旱剂；用于大田种植的棉花，可先把抗旱剂配成200倍储存液，在田间直接稀释使用，也可在田间直接配制成10μM DRP-C的工作液，利用大型田间喷雾器或者无人机进行叶面喷施，喷施量10L/亩左右。
上述多肽类抗旱剂还可与其他叶面肥、抗旱剂等物质同时在大田中应用，施用方便，为提高农作物抗旱能力提供了有效的方法。优选的，该抗旱剂除了包含主要功能成分DRP-C外，还可以添加了低浓度的CaCl2和KCl，钙离子和钾离子在植物耐盐抗旱中发挥重要作用，在抗旱剂中添加这两类物质可有效促进抗旱相关基因表达，进一步提高作物抗旱能力。其添加低浓度的CaCl2和KC1的抗旱剂成分为：10μM DRP-C+2mM CaCl2+2mM KCl。
本发明具有如下有益效果：
1、本发明首次采用合成人工多肽DRP-C进行叶面喷施，通过提高植物体内ABA含量来提高作物的抗旱性。既解决了现有技术中“ABA见光易分解并且价格较高，直接施用效果欠佳”的问题；也解决了“转基因方式提高ABA含量需要安全性评价”的局限，为其产业化应用奠定了基础。
2、本发明合成的抗旱关键成分DRP-C多肽序列是经过本申请发明人精心设计的，经过证实该多肽可有效诱导作物体内ABA合成基因表达，并提高作物体内ABA含量，从而提高作物的抗旱能力。试验表明：施加本抗旱剂后，通过提高棉花本身ABA提高了棉花的抗旱性、干旱胁迫下的存活率，促进了干旱胁迫下棉花的生长。
3、该抗旱剂成分简单，用水稀释即可使用，配制、使用方便，安全性好，抗旱效果突出，可大面积应用于生产，缓解农作物干旱胁迫，减少干旱胁迫导致的经济损失。
附图说明
图1为试验例一叶片喷施多肽类抗旱剂处理对棉花ABA含量的影响的结果。注：CK为清水对照处，DRP-C为抗旱剂处理；
图2为试验例一叶片喷施多肽类抗旱剂处理6天后棉花生长情况。注：CK为清水对照，DRP-C为抗旱剂处理；
图3为试验例一叶片喷施多肽类抗旱剂对处理对棉花存活率的影响。注：CK为清水对照，DRP-C为抗旱剂处理；
图4为试验例二叶面喷施多肽类抗旱剂对大田棉花单株干重的影响结果。注：CK为清水对照，DRP-C为抗旱剂处理。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案及其所产生的技术效果做进一步的阐述，下述说明仅是为了解释本发明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。本发明所述方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。本发明所述试剂若无特殊说明均为市售试剂。
实施例一、DRP-C多肽氨基酸序列的确定及DRP-C多肽的合成
(1)确定DRP-C氨基酸序列
本申请发明人搜索了植物中小分子多肽的数据库，找到了大量小分子多肽，结合棉花中相关基因干旱胁迫诱导表达模式及序列特征，进行了生物信息学的相关分析和研究，最终确定了活性较高的适合棉花DRP-C序列为：RRVPNGPDPIHN。
(2)DRP-C多肽合成及保存
通过多肽合成生物公司利用固相合成方法合成需要的多肽DRP-C，并利用反向高效液相色谱和低温冷冻干燥方法进行纯化，获得纯度95％以上的DRP-C多肽粉末。DRP-C多肽粉末放置在-80℃长期保存。制备成抗旱剂工作液母液可在4℃保存1个月。
实施例二、抗旱剂配制及施用
将实施例一合成的DRP-C多肽用自来水配制成浓度为10mM DRP-C的母液，4℃保存备用。
对于室内土培获大田种植棉苗，配制1L抗旱剂的工作液流程为：首先取1容器加入0.5L自来水，加入10mM DRP-C溶液1ml并定容至1L，充分混匀，得到浓度10μM DRP-C水溶液。对于需求量大的工作液可根据以上方法成倍扩大。配制成的抗旱剂工作液，利用喷雾器直接均匀喷施到叶片上即可。
试验例一：施加本发明抗旱剂对棉花叶片ABA含量和干旱下成活率的影响
取直径10cm、高12cm的塑料盆，装满育苗基质；将充实饱满的K836号脱绒种子15粒，均匀撒播于基质中，播深2cm；塑料盆开口处用透明塑料薄膜覆盖，置温室中(24～30℃)发芽出苗。齐苗后揭掉塑料薄膜，待棉苗长出第一片真叶后，间苗至每盆含长势一致的棉苗5株，放入温室中，14小时光照，10小时黑暗，温度28℃，湿度50％，继续生长。每3天浇灌自来水1次，待棉苗长至3-4片真叶时，进行饱和灌溉，然后不再浇水。
该试验设置6个重复，每个重复分别5株棉苗，抗旱剂处理组和清水对照组分别30株棉苗。饱和灌溉后第3天叶片喷施抗旱剂DRP-C(10μM DRP-C水溶液)，作为处理；叶片喷施等体积清水为对照。处理1天后，取叶片测定叶片内ABA含量，发现喷施抗旱剂处理叶片中ABA含量显著高于清水对照(图1)；处理6天后，发现对照棉苗叶片出现萎蔫表型，但抗旱剂处理棉花叶片生长正常(图2)，然后利用自来水饱和灌溉，灌溉后第3天统计棉苗存活率，发现抗旱剂处理棉苗的存活率显著高于对照(如图3所示，抗旱剂处理组存活率为73％，清水对照组为37％)，说明抗旱剂处理显著增强了棉花的抗旱能力。
试验例二：叶面喷施抗旱剂对大田棉花抗旱性的影响
取充实饱满的棉花K836号种子于2020年5月2日播种于无棣大田。设置喷施抗旱剂(10μM DRP-C水溶液)和喷施清水对照处理，随机区组排列，重复3次。小区面积20m2，采用4行区，等行距种植，行距76cm，株距15cm。按照当地植棉习惯对棉花进行日常管理。在初花期，在土壤含水量为最大含水量60％左右棉株感受到干旱胁迫时，且连续1周无雨时期，于下午4点后，利用抗旱剂进行叶面喷施，以喷施清水为对照。喷施后不浇水，喷施2周后各取经对照组和DRP-C处理的棉花，测定棉株干重，发现抗旱剂处理棉苗的长势明显好于对照，并且干重显著高于对照(如图4)，说明抗旱剂处理增强了棉花的抗旱能力。
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