天女木兰枝叶提取物协同氟康唑在制备抗真菌药物中的应用
阅读说明：本技术 天女木兰枝叶提取物协同氟康唑在制备抗真菌药物中的应用 (Application of magnolia sieboldii branch and leaf extract and fluconazole in preparation of antifungal drugs ) 是由 贾琳 金永生 刘金春 章誉艺 黄璜 徐莉萍 于 2021-06-03 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种天女木兰枝叶提取物协同氟康唑在制备抗真菌药物中的应用,其中天女木兰枝叶提取物为天女木兰枝叶75%-85%乙醇提取物,真菌为白念珠菌。本发明提供的天女木兰枝叶75%-85%乙醇提取物可协同氟康唑抗耐药白念珠菌,为拓展天女木兰的临床应用以及治疗氟康唑耐药的白念珠菌提供了新思路,可为联合用药治疗真菌感染以及拓展天女木兰的临床应用提供参考。(The invention relates to an application of magnolia sieboldii branch and leaf extract and fluconazole in preparation of antifungal drugs, wherein the magnolia sieboldii branch and leaf extract is 75-85% ethanol extract of magnolia sieboldii branches and leaves, and fungi are candida albicans. The 75-85% ethanol extract of the branches and leaves of the magnolia sieboldii provided by the invention can cooperate with the fluconazole drug-resistant candida albicans, provides a new idea for expanding the clinical application of the magnolia sieboldii and treating the fluconazole drug-resistant candida albicans, and provides a reference for combined drug treatment of fungal infection and expanding the clinical application of the magnolia sieboldii.)
技术领域
本发明涉及抗真菌药物技术领域，具体涉及一种天女木兰枝叶提取物协同氟康唑在制备 抗真菌药物中的应用。
背景技术
真菌是广泛存在于自然界的一类真核生物，真菌可感染人体的不同部位。我们把真菌引 起的疾病统称为“真菌病”。以临床致病情况为标准可将真菌病分为浅部真菌病和深部真菌 病两大类。浅部真菌病在我国极为普遍，常见的有头癣、体癣、股癣、手足癣、花斑癣和甲 癣；深部真菌则主要侵犯内脏器官、骨骼及神经系统，也可侵犯皮肤、粘膜，较常见的有孢 子丝菌病、着色菌丝病、防线菌病及隐球菌病。而白念珠菌属则对皮肤、粘膜、指(趾)甲 和内脏均可侵犯。
目前临床上深部真菌感染的主要治疗药物是多烯类(两性霉素B)和氮唑类(氟康唑等)。 其中氮唑类的氟康唑(Fluconazole，FLC)因其良好的生物利用度和可靠的安全性，成为治 疗白念珠菌(Candida albicans)感染中使用最多的药物。但由于其对白念珠菌的作用主要是 抑菌而不是杀菌，因此在长期治疗和重复给药过程中容易引起对FLC耐药，这是临床治疗深 部真菌感染的一个棘手的问题。恢复耐药真菌对治疗药物的敏感度，提高耐药菌对FLC的敏 感性，是治疗深部耐药菌感染的一种有效的治疗途径。临床上应对真菌耐药性的措施主要是： 增加药物剂量、联合用药等手段。因此有必要寻找抗真菌药物增效剂或耐药逆转剂。
天女木兰(Magnolia sieboldii K.Koch)为木兰科木兰属植物，分布于中国辽宁、安徽、 浙江、江西、福建北部、广西，朝鲜、日本也有分布，其生长在海拔1600-2000米的山地。 有研究公开了天女木兰提取液作为抑菌剂的用途：天女木兰提取液具有抑制金黄葡萄球菌、 霉菌和酵母菌的作用。但尚未见报道天女木兰枝叶具有协同氟康唑抗耐药真菌的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种天女木兰枝叶提取物协同氟康唑在制备抗真菌药物中的应用， 解决了现有技术在长期治疗真菌感染和重复给药过程中容易引起的对氟康唑(FLC)耐药问 题，实现了恢复耐药真菌对治疗药物的敏感度、提高耐药菌对FLC的敏感性的效果。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种天女木兰枝叶提取物协同氟康唑在制备抗真菌药物中的应用。本发明 提供的天女木兰枝叶提取物可协同氟康唑抗耐药白念珠菌，为拓展天女木兰的临床应用以及 治疗氟康唑耐药的白念珠菌提供了新思路，为联合用药治疗真菌感染以及拓展天女木兰的临 床应用提供参考。
另外，根据本发明上述的天女木兰枝叶提取物协同氟康唑在制备抗真菌药物中的应用， 还可以具有如下的附加技术特征。
根据本发明，真菌为白念珠菌。
根据本发明，抗真菌药物中天女木兰枝叶提取物的浓度不低于7.81μg/mL。
根据本发明，天女木兰枝叶提取物为天女木兰枝叶乙醇提取物，优选为天女木兰枝叶 75％-85％乙醇提取物，进一步优选为天女木兰枝叶80％乙醇提取物。
根据本发明，天女木兰枝叶提取物的制备方法包括：将干燥的天女木兰枝叶粉碎，用体 积分数为75％-85％的乙醇水溶液加热回流提取1-2小时，过滤；滤渣再用体积分数为75％-85％ 的乙醇水溶液加热回流提取1-2小时，过滤；合并两次滤液，之后减压浓缩，回收乙醇，得 到天女木兰枝叶75％-85％乙醇提取物。
本发明还提供了一种抗真菌药物，药物以天女木兰枝叶75％-85％乙醇提取物和氟康唑为 活性成分，或是药物包含天女木兰枝叶75％-85％乙醇提取物和氟康唑。本发明提供的药物可 以恢复耐药真菌对治疗药物的敏感度、提高耐药菌对FLC的敏感性。
另外，根据本发明上述的天女木兰枝叶提取物协同氟康唑在制备抗真菌药物中的应用， 还可以具有如下的附加技术特征。
根据本发明，药物还包括药学上可接受的载体或辅料；药物为药学上可接受的任意剂型， 包括片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、混悬剂和溶液剂中的至少一种。
根据本发明，真菌为白念珠菌。
根据本发明，抗真菌药物中天女木兰枝叶提取物的浓度不低于7.81μg/mL；天女木兰枝 叶提取物为天女木兰枝叶乙醇提取物，优选为天女木兰枝叶75％-85％乙醇提取物，进一步优 选为天女木兰枝叶80％乙醇提取物。
根据本发明，天女木兰枝叶提取物的制备方法包括：将干燥的天女木兰枝叶粉碎，用体 积分数为75％-85％的乙醇水溶液加热回流提取1-2小时，过滤；滤渣再用体积分数为75％-85％ 的乙醇水溶液加热回流提取1-2小时，过滤；合并两次滤液，之后减压浓缩，回收乙醇，得 到天女木兰枝叶75％-85％乙醇提取物。
本发明提供的一个或多个技术方案，至少具有如下有益效果：
(1)本发明通过采用天女木兰枝叶提取物协同氟康唑，能恢复耐药真菌对治疗药物的敏 感度，提高耐药菌对FLC的敏感性。
(2)本发明对天女木兰枝叶进行了协同氟康唑抗真菌活性研究，考察其协同氟康唑抗耐 药白念珠菌的作用，为拓展天女木兰枝叶的临床应用，以及治疗氟康唑耐药的白念珠菌提供 了方法，为联合用药治疗耐药真菌感染以及拓展天女木兰的临床应用提供参考。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显， 或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅 用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保 护范围。
为了更好的理解上述技术方案，下面将结合具体的实施方式对上述技术方案进行详细的 说明。
本发明还提供了一种抗真菌药物，以天女木兰枝叶75％-85％乙醇提取物和氟康唑为活性 成分，或是包含天女木兰枝叶75％-85％乙醇提取物和氟康唑。天女木兰枝叶提取物协同氟康 唑，可以有效恢复耐药真菌白念珠菌对治疗药物的敏感度、提高耐药菌对氟康唑(FLC)的 敏感性。根据本发明的实施例，药物还包括药学上可接受的载体或辅料、稀释剂等；药物为 药学上可接受的任意剂型，包括片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、混悬剂和溶液剂中的至少 一种。根据本发明的实施例，真菌为白念珠菌，天女木兰枝叶提取物协同氟康唑，可以有效 恢复耐药真菌白念珠菌对治疗药物的敏感度、提高耐药菌对氟康唑(FLC)的敏感性。根据 本发明的实施例，为了获得更为理想的疗效，抗真菌药物中天女木兰枝叶提取物的浓度不低 于7.81μg/mL。根据本发明的实施例，天女木兰枝叶提取物为天女木兰枝叶乙醇提取物，优 选为天女木兰枝叶75％-85％乙醇提取物，进一步优选为天女木兰枝叶80％乙醇提取物。天女 木兰枝叶通过采用体积分数为75％-85％的乙醇水溶液进行提取，可以提取出对于协同抗菌的 有效成分，从而达到有效恢复耐药真菌白念珠菌对治疗药物的敏感度、提高耐药菌对氟康唑 (FLC)的敏感性的效果，采用体积分数为80％的乙醇水溶液进行提取效果更佳。在本发明 的一些实施例中，天女木兰枝叶提取物的制备方法包括：将干燥的天女木兰枝叶粉碎，用体 积分数为75％-85％的乙醇水溶液加热回流提取1-2小时，过滤；滤渣再用体积分数为75％-8 5％的乙醇水溶液加热回流提取1-2小时，过滤；合并两次滤液，之后减压浓缩，回收乙醇， 得到天女木兰枝叶75％-85％乙醇提取物。本发明对于减压浓缩时采用的仪器不受特别的限制， 可以为旋转蒸发仪。本发明通过采用两次回流提取的方式，能更为充分的提取出对于协同抗 菌的有效成分，从而达到更为有效恢复耐药真菌白念珠菌对治疗药物的敏感度、提高耐药菌 对氟康唑(FLC)的敏感性的效果。
为了更好的理解上述技术方案，下面将结合具体的实施方式对上述技术方案进行详细的 说明。
实施例
一、实验材料与方法
(一)实验材料
1、菌株
白念珠菌103(Candida albicans 103)由海军军医大学长海医院真菌室提供。本实施例中 所用菌种为长海赠送的临床分离耐药白色念珠菌株(该菌株已经在CN105503788A中公开， 时间20160420)。
菌株培养条件：所有实验用菌株均于沙堡葡萄糖琼脂培养基(SDA)划板活化，白念珠 菌103于30℃培养2周后，分别挑取单克隆再次划板活化，取第二次所得单克隆置SDA斜面，用上述方法培养后于4℃保存备用。
2、受试药物
名称：天女木兰枝叶提取物。
3、试剂
(1)RPMI 1640液体培养液
RPMI 1640(Gibco BRL)10g，NaHCO3 2.0g，吗啡啉丙磺酸(MOPS)(Sigma)34.5g(0.165M)，加三蒸水900ml溶解，1.0mol/L NaOH调pH至7.0(25℃)，三蒸水定容至 1000ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装后于4℃保存备用。
(2)沙堡葡萄糖琼脂固体培养基(SDA)
蛋白胨10g，葡萄糖40g，琼脂18g，加三蒸水900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，调整pH至7.0，以三蒸水定容至1000ml，高压灭菌(121℃，15min)后于4℃保存备 用。
(3)YEPD培养液
酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加三蒸水900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，三蒸水定容至1000ml，高压灭菌(121℃，15min)后于4℃保存备用。
(4)PBS缓冲液
NaCl 8.0g，KCl 0.4g，Na2HPO4 0.133g，KH2PO40.06g，NaHCO3 0.35g，加三蒸水定容至 1000ml，高压灭菌后4℃保存。
(5)抗真菌药物
氟康唑注射液，上海信谊金朱药业有限公司。黄芩素(Baicalein，BE)，上海历鼎生物 技术有限公司。
(6)溶剂
二甲基亚砜(Dimethyl Sdphoxide，DMSO)，中国医药集团上海化学试剂公司。
(7)药物母液配制：
氟康唑为水溶液。
4、仪器设备
Multiskan MK3型酶标检测仪(Labsystems)；
隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；
MJX型智能霉菌培养箱(宁波江南仪器厂)；
THZ～82A台式恒温振荡器(上海跃进医疗器械厂)；
SW.CT-IF型超净化工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；
倒置显微镜(Amersham Pharmacia)；
微量加样器(Finnpette)；
96孔细胞培养板(Nunclon)；
LightCycler Real Time PCR仪(Roche Diagnostics)；
Eppendorf5417R高速冷冻离心机(Eppendorf)；
Biofuge stratos高速冷冻离心机(Heraeus)；
激光共聚焦显微镜(Leica TCS sp2)；
Microcon YM-30滤器(Millipore，Bedford，MA)。
(二)实验方法
1、天女木兰枝叶提取物的制备
80％乙醇提取物：取干燥天女木兰枝叶粉碎，称取20g，用300ml的体积分数为80％的 乙醇水溶液加热回流提取1小时，滤过；滤渣再用300ml的体积分数为80％的乙醇水溶液加 热回流提取1小时，滤过。合并两次滤液，滤液用旋转蒸发仪减压浓缩，回收乙醇，得80％乙醇浸膏4.2g。提取物率为25.7％。
2、真菌悬液的配制
实验前，用接种圈从4℃保存的SDA培养基上挑取白念珠菌103，接种至1ml YEPD培养液，于30℃，200rpm振荡培养，活化16h，使真菌处于指数生长期后期。取该菌液至1mlYEPD培养液中，用上述方法再次活化，16h后，用血细胞计数板计数，以RPMI 1640培养 液调整菌液浓度至1×103-5×103CFU/ml。将丝状菌接种至SDA斜面，其中皮下组织真菌和 系统性真菌(申克氏孢子丝菌)30℃培养一周；浅表真菌(羊毛状小孢子菌)30℃培养两周。 各菌按以上方法活化两次后，加适量RPMI 1640培养液于SDA斜面，用吸管吹打菌落，使 真菌孢子游离于RPMI 1640培养液中，然后经四层无菌纱布过滤。培养液经血细胞计数板计 数后，加RPMI 1640培养液调整孢子浓度至1×103-5×103CFU/ml。
3、药敏反应板的制备
取无菌96孔板，于每排1号孔加RPMI 1640液体培养基100μl作空白对照；3-12号孔各 加新鲜配制的菌液100μl；2号孔分别加菌液160μl和受试化合物溶液40μl；12号孔不含药物， 只加菌液100μl作阳性生长对照。2-11号孔进行倍比稀释，使各孔的最终药物浓度分别为 250.0、125.0、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98和0.49μg/ml，各孔中DMSO含量均低于1％。每次配制药敏板的同时均制备一质控菌药敏板，各药敏板于30℃恒温箱培养。
4、最低抑菌浓度(MIC值)的判定
在30℃恒温箱中，念珠菌培养2周后，用酶标分析仪于620nm测各孔OD值。阳性对照孔的OD值控制在0.2左右，与阳性对照孔比，以OD值下降80％以上的最低浓度孔中的药 物浓度为MIC80(真菌生长80％被抑制时的药物浓度)。当药物的MIC80值超过测定浓度范 围时，按以下方法进行统计：MIC80值高于最高浓度64μg/ml时，计为“>64μg/ml”；MIC80值为最低浓度或在最低浓度以下时，不作区别，均计为“≤0.125μg/ml”。上述实验均平行 操作2至3次，当MIC80值能准确重复或只差一个浓度时才被接受，并以较高浓度作为MIC80值；当MIC80值相差两个浓度以上时，则需重新实验，直到符合要求为止。
参照1997年美国国家临床试验标准化委员会(NCCLS)提出的标准J(M27-A方案)：AmB的MIC的确定，与生长对照孔比较，生长100％完全抑制，培养基清亮所对应的最低药 物浓度为AmB的MIC；与生长对照孔比较≥80％生长抑制所对应的最低药物浓度为氟康唑MIC80。
5、棋盘式微量稀释法
棋盘式微量稀释法即合用的两种药物于96孔板上以二维棋盘的纵(A至H)横(2至11) 两方向分别进行二倍的倍比稀释。受试药物(天女木兰枝叶80％乙醇提取物)以及阳性药(黄 芩素)分别与抗真菌药物氟康唑合用后，使得氟康唑和阳性药(黄芩素)的终浓度为128.0、 64.0、32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5和0.25μg/ml，受试药物(天女木兰枝叶80％乙醇 提取物)以及的终浓度分别为250.0、125.0、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98和 0.49μg/ml。实验所用试剂、药物、实验操作步骤同上。
96孔板于30℃恒温培养箱培养24h后取出，读取MIC80值。抗菌活性结果见表1。
表1天女木兰枝叶提取物与氟康唑联用体外抗念珠菌活性的MIC80
*与8μg/ml氟康唑联合使用；FICI值≤0.5：协同作用，>0.5：无关作用。
由表1结果可见，天女木兰80％乙醇提取物具有很强的协同氟康唑抗真菌活性。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发 明的发明内容。