一种天女木兰细胞水的提取方法及其应用
阅读说明：本技术 一种天女木兰细胞水的提取方法及其应用 (Extraction method and application of Magnolia sieboldii cell water ) 是由 张文环 唐明慧 卢建仁 张兵 艾勇 何廷刚 于 2020-05-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种天女木兰细胞水的提取方法,选用天女木兰的叶、花或茎作为原料,不需添加任何溶剂,先在低温-真空(减压)条件下进行初步提取,得到初提细胞水和初提残渣,再利用初提细胞水的高渗透性,将其作为酶解溶剂,加入纤维素酶和果胶酶后,倒回初提残渣中并再次低温-真空(减压)提取得到天女木兰细胞水；工序简单,提取率高,能够保留天女木兰的有效成分。通过本发明方法得到的天女木兰细胞水,澄清透明,芬芳柔和,富含90多种挥发性活性成分；对人体安全性高,具有很好的抗氧化和抗炎效果；利用价值高,可以作为一种绿色天然的原料,应用于食品、保健品、药品及化妆品等领域。(The invention discloses a method for extracting magnolia sieboldii cell water, which comprises the steps of selecting leaves, flowers or stems of magnolia sieboldii as raw materials, performing primary extraction under the condition of low temperature-vacuum (reduced pressure) without adding any solvent to obtain primary extracted cell water and primary extracted residues, using the high permeability of the primary extracted cell water as an enzymolysis solvent, adding cellulase and pectinase, pouring the primary extracted cell water back into the primary extracted residues, and performing low temperature-vacuum (reduced pressure) extraction again to obtain magnolia sieboldii cell water; simple process, high extraction rate, and can retain effective components of Magnolia sieboldii. The magnolia sieboldii cell water obtained by the method is clear, transparent, fragrant and soft, and is rich in more than 90 volatile active ingredients; the product has high safety to human body, and has good antioxidant and anti-inflammatory effects; has high utilization value, can be used as a green and natural raw material and applied to the fields of food, health-care products, medicines, cosmetics and the like.)
技术领域
本发明涉及农产品处理技术领域，特别是涉及一种天女木兰细胞水的提取方及其应用。
背景技术
天女木兰，木兰科木兰属落叶小乔木，花瓣洁白、雄蕊紫色、香气迷人、形似天女而得名天女木兰。天女木兰的花、叶、茎均含芳香油。其在护肤方面具有强大的功效，可修复薄弱细胞，消解红血丝，增强肌肤耐受性，让肌肤远离刺痛、脱皮、红肿、粗糙等问题，从根源处改善肌肤过敏症状。天女木兰蕴含有天然抑菌因子，可以让皮肤远离粉刺、痤疮、青春痘等问题；还含有独特的天然消炎成分，持续消除肌肤炎症，修复受损细胞，还原肌肤活能，重塑丝滑肤感。天女木兰花朵和树枝上的厚朴酚，可以抑制黑素体从黑色素细胞转运到角质细胞以及抑制黑色素的形成，也具有抗氧化功效，是一种原生态美白的植物。天女木兰还含有的珍罕补水因子、高纯保湿成分，可以密集细化毛孔、调节水油平衡、增强肌肤活能，显著提升肌肤锁水、储水能力。
现阶段天女木兰的主要提取方法有蒸馏法、浸提法、超临界二氧化碳萃取法，蒸馏法耗费时间较长、且能耗较大，提取温度高导致挥发性活性成分的损失；浸提法需外加溶剂，限制了提取物的保存和使用；超临界二氧化碳萃取法对设备要求高、成本高，不适用于工业生产。因此，亟须开发一种能够保留天女木兰有效成分且高效便捷的天女木兰提取方法。
中国专利申请CN106562908A公开了一种玫瑰花细胞水的提取方法，具体是将玫瑰花在旋转蒸发仪中于58℃～62℃、0.08Mpa～0.10Mpa的条件下旋转干馏，玫瑰花中渗透出的细胞液一部分会蒸发出来被冷凝收集一部分保留在旋转蒸发瓶中需要过滤出来；重复上述步骤3次，收集全部的细胞水，得到干花。但是该方法提取率不高，单纯通过重复旋蒸无法充分提取出花朵中的芳香物质(得到的玫瑰干花与新鲜玫瑰花的香味相差不大，说明大部分芳香成分还留存在花朵中，无法被充分提取出来)，得到的玫瑰花细胞水中挥发性活性成分含量不高，芳香味不足。
中国专利申请CN109730948A公开了一种采用超声低温旋蒸法和酶法相结合制备牡丹鲜花细胞水的方法：首先通过压榨法得到榨汁和残渣1，再将残渣1旋蒸得到细胞水1和残渣2，最后将残渣2进行酶解后再旋蒸得到细胞水2。将榨汁、细胞水1和细胞水2混合后得到牡丹花细胞水。该方法具有较高的提取效率，但是具有如下缺陷：(1)采用压榨法，后与真空提取法得到的液体混合，这样会带入多糖、色素和刺激气味，导致防腐和脱色问题；(2)工艺后期配合其他植物一起蒸馏，解决防腐问题，但是容易改变原有的牡丹花细胞水成分和气味，后期生产也无法控制品质。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种天女木兰细胞水的提取方法，工序简单，提取率高，能够保留天女木兰的有效成分；提取得到的天女木兰细胞水富含挥发性活性成分，芬芳柔和，安全性高，利用价值高。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种天女木兰细胞水的提取方法，包括以下步骤：以天女木兰叶、天女木兰花或天女木兰茎中的一种或几种为原料，不加入溶剂，在温度30℃～65℃、压力-60kPa～-101kPa下初步提取，天女木兰细胞水形成蒸气并冷凝收集液体，提取1.5～3小时，得到初提细胞水和初提残渣，在初提细胞水中加入初始原料总重量为基准的0.2％～0.5％的纤维素酶和0～0.1％的果胶酶后再倒回初提残渣中，在温度35℃～55℃、压力-80kPa～-101kPa条件下再次提取4～7小时，收集得到天女木兰细胞水。
在低温真空条件下，细胞水和挥发性成分能够很好的渗出以及蒸发，同时在较低温度下能够保留挥发出来的细胞水的活性。优选的，所述初步提取的温度为35℃～50℃、压力为-80kPa～-101kPa。
本发明通过在初提细胞水中加入一定量的酶，再次投入容器中对初提残渣进行提取，具有如下有益优点：第一、初提细胞水表面张力低，渗透性好；第二、初提细胞水pH为3～7，无需额外调节pH，有利于提高酶活性；第三、酶解能够加速破壁；第四、低温-真空提取技术。通过四种效应的协同，能够在较低温度(35～55℃)下控制酶解速度，加快细胞液流出速度。再次提取步骤中，倒回容器内的初提细胞水被蒸除前的期间酶解速度快，通过初提液体的量与再次提取的工艺条件来控制酶解的时长(此时初提液体的多少就至关重要，多了会延长酶解时间，使酶解过度；少了会缩短酶解时间，酶解不充分)，避免了传统酶解法需要加入大量水而稀释提取液以及酶解过度带来刺激气味的问题。
因此，初步提取时间是关键参数之一，如果时间太短，初提细胞水量过少，加入酶后细胞水很难浸润初提残渣，酶解不能正常进行；而且再次提取时初提细胞水很快被蒸发出来，从而缩短了酶解时间；导致酶解不充分。如果初步提取时间过长，细胞水流出过多，增长了酶解时间，带来过度酶解的风险；同时也降低了后续提取效率。本发明要求条件下控制再次提取步骤中倒回容器内的初提细胞水在50～70min能够被蒸除。
关于初提天女木兰细胞水的渗透性，本发明通过实验发现，采用天女木兰细胞水浸提天女木兰残渣时，相比于采用纯水，能够多提取出50％以上的黄酮和多糖等活性成分。说明天女木兰细胞水具有较高的渗透性。
酶是大分子蛋白质，在要求加入量范围下，能够吸附在天女木兰残渣细胞表面，无法在低温真空条件下挥发出来，无需进行后续处理。优选的，纤维素酶的加入量为0.25％～0.4％，果胶酶加入量为0.02％～0.07％。
所述的天女木兰茎为连接叶子或花朵的枝条。
天女木兰的花、叶、茎都富含活性成分。优选的，本发明选用天女木兰叶为原料。在提取前，将天女木兰叶切割成宽度为1mm～10mm；将天女木兰茎切割成长度为1cm～5cm。
本发明选用新鲜的天女木兰植物原料，未霉变和未腐烂。新鲜的天女木兰叶绿色饱满、富含水分；新鲜的天女木兰花的花瓣鲜嫩多汁；新鲜的天女木兰茎富含水分，未经烤干或晒干。一般为提取当日采摘的，或者采摘后经过冷藏等保鲜手段还保持新鲜的。
在提取过程中进行搅拌，搅拌速度为1～150转/分钟。使受热均匀，防止局部高温，且有利于加快提取效率；而且再次提取步骤中通过搅拌可以使加入酶的初提细胞水与残渣混匀，充分浸润所有初提残渣，保证酶解的进行。
收集过程中进行冷凝，冷凝温度为-10℃～8℃。
通过本发明的方法提取得到的天女木兰细胞水，可应用于食品、保健品、药品及化妆品等领域。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
本发明通过低温-真空(减压)技术与酶解技术的有机结合来提取天女木兰细胞水，选用天女木兰的叶、花或茎作为原料，先在低温真空条件下进行初步提取，得到初提细胞水和初提残渣，再利用初提细胞水的高渗透性，将其作为酶解溶剂，加入纤维素酶和果胶酶后，倒回初提残渣中并再次低温-真空(减压)提取得到天女木兰细胞水。整个提取过程不需加入任何溶剂，提取得到的天女木兰细胞水100％来源于植物细胞；工序简单，提取率高，能够保留天女木兰的有效成分。相比于单一的低温-真空(减压)提取技术，细胞水的提取率更高且能提取出更多的挥发性活性成分；同时又避免了传统酶解法容易酶解过度使提取液具有杂味的问题。
通过本发明方法提取得到的天女木兰细胞水，无色澄清透明，气味芬芳柔和，富含90多种挥发性活性成分，对人体安全性高，具有很好的抗氧化和抗炎效果；利用价值高，可以作为一种绿色天然的原料，应用于食品、保健品、药品及化妆品等领域。
附图说明
图1为实施例1天女木兰细胞水安全性测试数据柱状图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
选用当日采摘的新鲜的天女木兰叶、天女木兰花、天女木兰茎(未腐烂和未霉变)，将天女木兰叶切割成宽度为3mm～5mm；将天女木兰茎切割成长度为1cm～2cm；进行提取实验。
实施例1：
称取50kg天女木兰叶投入150L低温提取设备，不加入任何溶剂，在40℃，压力-90kPa下初步提取，天女木兰细胞水形成蒸气并冷凝收集液体，提取2小时，得到初提细胞水和初提残渣，在初提细胞水中加入160g纤维素酶和25g果胶酶后再倒入初提残渣中，在40℃、压力-90kPa下再次提取6小时；全程搅拌为30转/分，冷凝温度为-8℃；收集得到41.6kg天女木兰细胞水，无色澄清透明，气味芬芳柔和。
实施例2：
称取50kg天女木兰叶投入150L低温提取设备，不加入任何溶剂，在30℃，压力-90kPa下初步提取，天女木兰细胞水形成蒸气并冷凝收集液体，提取2小时，得到初提细胞水和初提残渣，在初提细胞水中加入160g纤维素酶和25g果胶酶后再倒入初提残渣中，在35℃、压力-90kPa下再次提取6小时；全程搅拌为30转/分，冷凝温度为-8℃；收集得到37.7kg天女木兰细胞水，无色澄清透明，气味芬芳柔和。
实施例3：
称取50kg天女木兰叶投入150L低温提取设备，不加入任何溶剂，在40℃，压力-80kPa下初步提取，天女木兰细胞水形成蒸气并冷凝收集液体，提取2小时，得到初提细胞水和初提残渣，在初提细胞水中加入160g纤维素酶和25g果胶酶后再倒入初提残渣中，在40℃、压力-80kPa下再次提取6小时；全程搅拌为30转/分，冷凝温度为-8℃；收集得到35.3kg天女木兰细胞水，无色澄清透明，气味芬芳柔和。
实施例4：
称取50kg天女木兰叶投入150L低温提取设备，不加入任何溶剂，在40℃，压力-90kPa下初步提取，天女木兰细胞水形成蒸气并冷凝收集液体，提取2小时，得到初提细胞水和初提残渣，在初提细胞水中加入125g纤维素酶和15g果胶酶后再倒入初提残渣中，在40℃、压力-90kPa下再次提取6小时；全程搅拌为30转/分，冷凝温度为-8℃；收集得到39.2kg天女木兰细胞水，无色澄清透明，气味芬芳柔和。
实施例5：
称取50kg天女木兰叶投入150L低温提取设备，不加入任何溶剂，在55℃，压力-80kPa下初步提取，天女木兰细胞水形成蒸气并冷凝收集液体，提取1.5小时，得到初提细胞水和初提残渣，在初提细胞水中加入160g纤维素酶和25g果胶酶后再倒入初提残渣中，在50℃、压力-90kPa下再次提取4小时；全程搅拌为45转/分，冷凝温度为-8℃；收集得到36.2kg天女木兰细胞水，无色澄清透明，气味芬芳柔和。
实施例6：
称取50kg天女木兰花投入150L低温提取设备，不加入任何溶剂，在50℃，压力-85kPa下初步提取，天女木兰细胞水形成蒸气并冷凝收集液体，提取2.5小时，得到初提细胞水和初提残渣，在初提细胞水中加入125g纤维素酶和30g果胶酶后再倒入初提残渣中，在40℃、压力-95kPa下再次提取5小时；全程搅拌为45转/分，冷凝温度为-8℃；收集得到43.5kg天女木兰细胞水，澄清透明，气味香甜浓郁。
实施例7：
称取50kg天女木兰茎投入150L低温提取设备，不加入任何溶剂，在65℃，压力-70kPa下初步提取，天女木兰细胞水形成蒸气并冷凝收集液体，提取3小时，得到初提细胞水和初提残渣，在初提细胞水中加入185g纤维素酶和25g果胶酶后再倒入初提残渣中，在55℃、压力-80kPa下再次提取7小时；全程搅拌为60转/分，冷凝温度为-8℃；收集得到24.3kg天女木兰细胞水，无色澄清透明，气味清新怡人。
对比例1：
称取50kg天女木兰叶投入150L低温提取设备，不加入任何溶剂，在40℃、-90kPa下提取，天女木兰细胞水形成蒸气后冷凝收集液体，提取8小时，全程搅拌为30转/分，冷凝温度-8℃，得到31.3kg天女木兰细胞水，无色澄清透明，香味淡。
对比例2：
称取50kg天女木兰叶投入150L低温提取设备，与5kg水、160g纤维素酶和25g果胶酶混合后在40℃下搅拌8小时，搅拌速度为30转/分，提取结束后先离心机过滤，再采用0.22μm滤膜过滤，得到42.1kg天女木兰细胞水(含有额外添加的5kg水)，液体为黄色，香味淡混有刺激气味，异味重。
对比例3：
称取50kg天女木兰投入150L低温提取设备，与5kg水、160g纤维素酶和25g果胶酶混合后在40℃下搅拌50分钟，后在40℃、-90kPa下提取6小时，天女木兰细胞水形成蒸气后冷凝收集液体，全程搅拌为30转/分，冷凝温度-8℃，收集得到44.8kg天女木兰细胞水(含有额外添加的5kg水)，无色澄清透明，香味清淡混有杂味。
对比例4：
称取50kg天女木兰叶投入150L低温提取设备，不加入任何溶剂，在40℃，压力-90kPa下初步提取，天女木兰细胞水形成蒸气并冷凝收集液体，提取0.5小时，得到初提细胞水和初提残渣，在初提细胞水中加入160g纤维素酶和25g果胶酶后再倒入初提残渣中，在40℃、压力-90kPa下再次提取6小时；全程搅拌为30转/分，冷凝温度为-8℃；收集得到36.3kg天女木兰细胞水，无色澄清透明，香味清淡。
各项测试方法：
1、天女木兰细胞水挥发性活性成分分析：将实施例和对比例的天女木兰细胞水在80℃进样温度下进行顶空气质检测，分析细胞水中的挥发性物质。
(1)仪器信息：Agilent 7980A GC；MS:5975C；50/30μm CAR/PDMS/DVB萃取纤维头，美国SUPELCO公司。
(2)GC-MS条件：色谱柱为HP-INNOWAX毛细管柱子(30m×0.25mm×0.25μm)；载气为He，流速1mL/min，分离比5:1；进样温度为250℃；升温程序为起始温度为40℃，保持5min，以8℃/min，升至250℃，保持5min。
质谱条件：EI电离源，能量70eV；离子源温度230℃，四极杆温度150℃，接口温度250℃，扫描范围30-400m/z。
(3)样品前处理：将5mL样品、1g NaCl置于20ml顶空瓶中，拧紧瓶盖。于搅拌模式80℃下平衡5min后，用固相微萃取针80℃下萃取5min，然后于进样口解析5min。
测试结果如下：
表1：实施例1天女木兰细胞水的挥发性活性成分分析表
从上表看出，天女木兰细胞水中的挥发性成分主要有(-)-4-萜品醇(3.95％)、3-烯丙基-6-甲氧基苯酚-5-丁香酸(3.45％)、Α-毕橙茄醇(2.08％)、β-桉叶醇(1.89％)、芳樟醇(1.44％)、桉油烯醇(2.44％)，其中大多为精油组成成分，以及挥发性芳香物质。3-烯丙基-6-甲氧基苯酚-5-丁香酸具有抗细菌和真菌的作用；桉油烯醇具有平喘、祛痰的功效。
表2：实施例1～7和对比例1～4天女木兰细胞水的主要挥发性活性成分含量表
接表2：
通过实施例和对比例比较分析：对比例1采用单一的低温真空提取技术，提取不充分，得到的天女木兰细胞水挥发性活性成分少、含量低，香味淡。对比例2采用传统的纯酶解法会有酶解过度的问题，得到的天女木兰细胞水含有杂质及有色物质，异味重；而且需额外加入水作为酶解溶剂，稀释了提取液，香味淡，利用价值不高。对比例3先酶解，再采用低温-真空(减压)技术提取，同样会有酶解过度产生杂味的问题；而且采用水作为酶解溶剂，由于水的渗透性差，且外加的水会稀释提取液，导致了提取率较低、细胞水香味淡等缺陷。对比例4由于初提时间过短，初提细胞水太少，导致酶解程度过低，相对于实施例1提取率较低，并且活性成分含量较少导致香味较淡。
2、天女木兰细胞水抗氧化功效测试
采用DPPH自由基清除法，根据DPPH分子中存在的稳定氮自由基，其醇溶液呈深紫色，且在517nm附近有强吸收。当有自由基清除剂存在时，分子中的单电子因配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因此，可通过测定其最大吸收波长517nm处的吸光度的减少来定量分析自由基清除能力测定样品的抗氧化功效。对实施例1天女木兰细胞水进行抗氧化功效测试，测试结果见表3。
表3：实施例1天女木兰细胞水抗氧化功效测试数据
天女木兰细胞水浓度(％)
DPPH清除率(％)
20
12
40
17
50
20
60
25
80
34
100
46
由表3数据可以看出，天女木兰细胞水具有良好的抗氧化功效。
3、天女木兰细胞水抗炎功效测试
脂多糖是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分,它可以激活巨噬细胞释放多种炎性细胞因子，因此利用脂多糖(LPS)刺激小鼠单核-巨噬细胞建立体外炎症反应模型，样品进行干预，以及采用地塞米松为阳性对照，采用酶联免疫法(ELISA)测定炎症因子IL-6和TNF-α的水平变化，从而探讨样品的体外抗炎作用。将实施例1天女木兰细胞水原液配制成不同的浓度进行测试，测试结果见表4。
表4：实施例1天女木兰细胞水抗炎功效测试数据
天女木兰细胞水浓度
IL-6(pg/mL)
TNF-α(pg/mL)
100％
25
150
80％
29
150
40％
32
165
15％
38
170
10％
39
174
5％
42
176
空白
25
150
LPS刺激
50
260
地塞米松
45
206
从表4数据可知，5％浓度的天女木兰细胞水已具有优秀于地塞米松的抗炎功效，可使皮肤受LPS刺激后，IL-6表达因子下降明显；而80％浓度的天女木兰叶细胞水可使受LPS刺激后的皮肤的TNF-α表达因子下降到正常范围内。
4、天女木兰细胞水的保存条件测试
天女木兰细胞水中活性成分较多，为防止其中菌类繁殖导致产品质量下降，因此如何保存十分重要。向天女木兰细胞水中加入一定量防腐剂苯氧乙醇与不加入防腐剂的情况下，在室温、4℃，两种保存条件下的理化值和菌类繁殖情况进行了为期一个月的检测。实施例1天女木兰细胞水的测试结果见表5。
表5：实施例1天女木兰细胞水保存条件测试结果
由表5数据得知，室温不加防腐剂的天女木兰细胞水较容易生长细菌，4℃不加防腐剂的天女木兰细胞水，电导率稍增大，但微检在标准范围内，加入一定量防腐剂的天女木兰细胞水在室温、4℃下存放，理化数据稳定，微生物菌落总数达标。综上，4℃不加防腐剂、室温加防腐剂、4℃加防腐剂三种条件皆适合天女木兰细胞水的保存，为保险起见，建议4℃、室温下加入一定量防腐剂条件下保存较为稳妥。
5、天女木兰细胞水安全性测试
HaCaT细胞为人永生表皮细胞系，对HaCaT细胞的细胞毒性，可作为对皮肤安全性的参考数据。正常细胞代谢旺盛，其线粒体内的琥珀酸脱氢酶，可将四唑盐类物质还原为带颜色的结晶状物质，沉积在细胞周围，该变化可通过酶标仪读取OD值，通过OD值与空白对照组的比较，可以得知细胞的相对生长情况。以上述方法测试天女木兰细胞水的安全性。实施例1天女木兰细胞水的安全性测试结果见附图1。
由图1数据得出，天女木兰细胞水对人体表皮细胞基本无毒性。
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