一种用于鉴别牛种布鲁氏菌与其它种布鲁氏菌的试剂盒
阅读说明：本技术 一种用于鉴别牛种布鲁氏菌与其它种布鲁氏菌的试剂盒 (Kit for identifying Brucella melitensis and Brucella melitensis of other species ) 是由 王文龙 王姝懿 陆静 毛晓伟 呼和巴特尔 刘春霞 于 2021-07-28 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种用于鉴别牛种布鲁氏菌与其它种布鲁氏菌的试剂盒,该试剂盒包被有SEQ ID NO.2所示蛋白和布鲁氏菌BP26蛋白。本发明发现SEQ ID NO.2所述蛋白或其编码基因可用于区分牛种布鲁氏菌与其它种布鲁氏菌。本发明提供鉴别牛种布鲁氏菌与其它种布鲁氏菌感染血清的iELISA检测试剂,该试剂含有前述两种蛋白,或含有前述两种蛋白的N端或C端融合有His标签的重组蛋白。本发明提供的iELISA检测试剂能够快速鉴别家畜血清中牛种疫苗免疫或野毒与其它种(羊,猪,犬等)疫苗免疫或野毒的抗体,解决畜群中布鲁氏菌种型鉴定难的问题,为家畜布鲁氏菌病的病原鉴定、疫苗选择和畜群净化提供参考。(The invention provides a kit for identifying Brucella and other Brucella, which is coated with a protein shown in SEQ ID NO.2 and Brucella BP26 protein. The invention discovers that the protein described by SEQ ID NO.2 or the coding gene thereof can be used for distinguishing the Brucella melitensis from other Brucella melitensis. The invention provides an iELISA detection reagent for identifying bovine brucella and brucella infected serum of other species, which contains the two proteins, or recombinant protein containing His labels fused at the N end or the C end of the two proteins. The iELISA detection reagent provided by the invention can rapidly identify the antibodies of the bovine vaccine immunity or the wild virus and the vaccine immunity or the wild virus of other species (sheep, pigs, dogs and the like) in the livestock serum, solves the problem of difficult identification of the brucella species in the herd, and provides references for pathogen identification of brucella disease of livestock, vaccine selection and herd purification.)
技术领域
本发明涉及基因工程及免疫学领域，具体地说，涉及一种用于鉴别牛种布鲁氏菌与其它种布鲁氏菌的试剂盒。
背景技术
布鲁氏菌病(brucellosis)是由布鲁氏杆菌(brucella spp.)引起的全世界范围内广泛流行的人兽共患病，OIE归为乙类传染病。布鲁氏菌分六个经典种，牛种(B.abortus)、羊种(B.melitensis)、猪种(B.suis)、犬种(B.cains)、绵羊种(B.ovis)和森林鼠种布鲁氏菌(B.neotomae)，近年来又陆续发现了鲸种布鲁氏菌(B.ceti)和鳍种布鲁氏菌(B.pinnipedialis)，在人和啮齿类、蝙蝠等动物体内也发现了布鲁氏菌，其中羊种、牛种、猪种为家畜和人主要流行病原种类。布鲁氏菌病传染方式为接触患病动物、未消毒的肉制品、乳制品，也可经呼吸道、消化道及皮肤黏膜等组织器官侵入体内引起感染。
布鲁氏菌一旦进入宿主体内，细菌侵入血液和淋巴管，繁殖并被巨噬细胞吞噬。家畜感染布鲁氏菌病常见的症状有母畜流产、公畜睾丸肿大、严重者肝脏和脾脏等内脏肿大。家畜感染布鲁氏菌多以淘汰为主，为此，严重影响了畜牧业的健康发展，而且威胁到了人类的健康。不同种类的布鲁氏菌致病力不同，用于布鲁氏菌病免疫预防的疫苗种类也不同，在生产实践中对布鲁氏菌的鉴定对评估疾病危害，疫苗选择具有重要意义；而且现有常用布鲁氏菌病诊断方法无法区分免疫动物血清中的疫苗抗体和自然强毒菌株感染抗体，严重干扰畜群净化工作的开展，通过血清学鉴别诊断方法的应用结合不同种布鲁氏菌疫苗的使用有利于畜群净化。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于鉴别牛种布鲁氏菌与其它种布鲁氏菌的试剂盒。
本发明的另一目的是提供用于鉴别牛种布鲁氏菌与其它种布鲁氏菌感染血清的iELISA检测试剂盒。
本发明的再一目的是提供用于鉴别牛种布鲁氏菌与其它种布鲁氏菌的特征蛋白。
为了实现本发明目的，本发明针对市场上普遍使用的布鲁氏菌主流疫苗A19疫苗，对A19疫苗进行全基因组测序，与NCBI上已公布的多种布鲁氏菌全基因组进行比较基因组学分析及生物信息学分析。利用A19作为参照，与牛/羊/猪种疫苗或布鲁氏菌自然强毒株相比较，找到牛种布鲁氏菌的缺失基因NC_017250，将基因重组表达后，筛选出具有免疫原性的抗原蛋白，建立牛种布鲁氏菌与其它种布鲁氏菌感染的iELISA鉴别方法。
本实验室对A19疫苗进行了全基因组测序并首次提交到NCBI数据库，与NCBI上已公布的多种布鲁氏菌疫苗和野毒株全基因组序列进行了比较分析，筛选到的特异性基因NC_017250通过blast比对与超过240个不同种型的布鲁氏菌基因组序列进行了比对，完全具有普适性，而且对该基因在布鲁氏菌S2、A19、S19、rev.1、M28多株菌上进行了PCR验证，确定为牛种布鲁氏菌特异性缺失基因。
本发明首先提供一种蛋白，即牛种布鲁氏菌缺失的NC_017250抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。该NC_017250抗原蛋白由S2疫苗株基因NC_017250(SEQ ID NO.1)编码。
由于NC_017250基因是A19(牛种)缺失的，所以这个基因的获取需要从其他种布鲁菌PCR扩增获取，S2为猪种布鲁氏菌，含有完整的该基因，其他非牛种布鲁氏菌也具有完整的该基因，本发明仅作为示例选则S2菌进行相关研究。
第一方面，本发明提供的NC_017250基因编码的蛋白，其含有：
1)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
2)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质或多肽。
本发明提供的NC_017250基因，其具有：
1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或
2)SEQ ID NO.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸；或
3)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
NC_017250基因或其编码的蛋白能够作为鉴定标志物用于区分牛种布鲁氏菌和其他种布鲁氏菌。
含有所述NC_017250基因的生物材料属于本发明的保护范围，所述生物材料为载体、宿主细胞或表达盒。
第二方面，本发明提供了所述蛋白或NC_017250基因作为检测标志物在鉴别牛种布鲁氏菌与其他种布鲁氏菌中的应用。
本发明还提供了所述蛋白和布鲁氏菌BP26蛋白的组合在制备鉴定牛种布鲁氏菌与其它种布鲁氏菌感染的试剂盒或检测试剂中的应用；所述布鲁氏菌BP26蛋白的编码基因如SEQ ID NO.3所示。
第三方面，本发明提供了一种引物对组合在鉴定牛种布鲁氏菌与其它种布鲁氏菌中的应用，所述引物对组合含有用于检测NC_017250基因的引物对，和用于检测布鲁氏菌BP26蛋白编码基因的引物对。
进一步地，在用引物进行PCR检测时，如果PCR检测结果为两种抗原蛋白(NC_017250基因编码蛋白和布鲁氏菌BP26蛋白)的编码基因均有扩增条带，扩增条带分别为879bp和753bp，则待测样品含有非牛种布鲁氏菌。
第四方面，本发明提供一种试剂盒，该试剂盒含有所述蛋白和布鲁氏菌BP26蛋白，或者含有所述蛋白和布鲁氏菌BP26蛋白的N端或C端融合有His标签的重组蛋白。
本发明一种用于鉴定牛种布鲁氏菌与其它种布鲁氏菌的动物感染或疫苗免疫抗体检测试剂盒，其为iELISA检测试剂盒，其中SEQ ID NO.2所示蛋白的包被浓度为20μg/mL，布鲁氏菌BP26蛋白的包被浓度为5.53μg/mL，所述蛋白酶标二抗最佳稀释度为1：5000，BP26酶标二抗最佳稀释度为1∶7500。
SEQ ID NO.2所示蛋白iELISA判定点为0.390，BP26蛋白iELISA判定点为0.589。
本发明的iELISA检测试剂盒利用iELISA的方法，对待测血清进行检测，若SEQ IDNO.2所示蛋白和BP26蛋白这两种抗原蛋白检测均为阳性，则待测血清为非牛种布鲁氏菌感染的家畜血清；若SEQ ID NO.2所示蛋白检测为阴性，BP26蛋白检测为阳性，则待检血清为牛种布鲁氏菌感染家畜血清。两种抗原蛋白检测均为阴性，则待测血清为未感染布鲁氏菌的家畜血清。
实验表明，本发明建立的iELISA鉴别方法和基于该检测方法构建的iELISA试剂盒具有较好的重复性及较高的特异性和敏感性。
本发明提供的iELISA检测试剂能鉴别牛种布鲁氏菌及市场上普遍使用的牛种疫苗，牛种野毒或牛种疫苗都可鉴别。因此，能够在短时间内鉴别家畜血清中牛种布鲁氏菌与其它种布鲁氏菌感染抗体。
附图说明
图1为本发明实施例1中牛种布鲁氏菌缺失基因NC_017250的PCR检测结果；其中，M为DNA Marker DL2000；1为阴性对照；2为A19疫苗；3为S19疫苗；4为S2疫苗；5为M28疫苗；6为Rev.1疫苗。
图2为本发明实施例1中基因NC_017250及BP26的PCR扩增电泳图；其中，M为DNAMarker DL2000；1为NC_017250基因；2为BP26基因；3为空白对照。
图3为本发明实施例1中重组克隆质粒pMD-NC_017250双酶切鉴定结果；其中，M为DNA Marker DL2000；1-3为pMD-NC_017250质粒。
图4为本发明实施例1中重组克隆质粒pMD-BP26双酶切鉴定结果；其中，M为DNAMarker DL2000；1-3为pMD-BP26质粒。
图5为本发明实施例1中重组表达质粒pETNC_017250双酶切鉴定结果；其中，M1为DNA Marker DL2000；M2为DNA Marker DL10000；1-3为pETNC_017250质粒。
图6为本发明实施例1中重组表达质粒pETBP26双酶切鉴定结果；其中，M1为DNAMarker DL2000；M2为DNA Marker DL15000；1-3为pETBP26质粒。
图7为本发明实施例1中重组表达菌BL21(pETNC_017250)诱导表达SDS-PAGE电泳结果；其中，M为蛋白质marker；1～3为BL21(pETNC_017250)诱导前；4～5为BL21(pETNC_017250)诱导表达。
图8为本发明实施例1中重组蛋白表达形式的SDS-PAGE电泳检测结果；其中，M为蛋白质marker；1为BL21(pETNC_017250)全菌；2为BL21(pETNC_017250)菌体裂解物上清；3为BL21(pETNC_017250)菌体裂解物沉淀。
图9为本发明实施例1中纯化的重组蛋白SDS-PAGE电泳检测结果；其中，M为蛋白质marker；1为rNC_017250纯化蛋白稀释5倍；2为rNC_017250纯化蛋白稀释10倍。
图10为本发明实施例1中重组蛋白His标签Western-bloting检测结果；其中，M为蛋白质marker；1为rNC_017250。
图11为本发明实施例1中纯化重组蛋白rNC_017250与牛种和非牛种免疫血清反应检测结果；其中，M为蛋白质marker；1为rNC_017250与A19血清反应；2为rNC_017250与S2血清反应。
图12为本发明实施例1中纯化蛋白rBP26与S2免疫血清反应检测结果；其中，M为蛋白质marker；1为BL21；2为rBP26自然感染血清反应；3为rBP26与S2免疫血清反应。
图13为本发明实施例2中NC_017250抗原iELISA敏感性和特异性分析。
图14为本发明实施例2中BP26抗原iELISA敏感性和特异性分析。
图15为本发明实施例2中NC_017250抗原iELISA检测血清的ROC曲线图。
图16为本发明实施例2中BP26抗原iELISA检测清的ROC曲线图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如分子克隆实验手册，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1牛种布鲁氏菌缺失基因NC_017250以及布鲁氏菌BP26基因的克隆、原核表达
通过A19疫苗株全基因组测序，预测出的编码基因与已公布的布鲁氏菌基因组数据比对分析，找出与其他非牛种布鲁氏菌相比较牛种缺失基因，用PCR方法从S2基因组中扩增出缺失基因NC_017250(SEQ ID NO.1)，同时以布鲁氏菌BP26基因(SEQ ID NO.3)作为对照基因，克隆测序后，构建到原核表达载体pET30中，转化至E.coli BL21(DE3)，进行诱导表达，用western-bloting法验证NC_017250和BP26两个重组蛋白的免疫原性。
1、实验方法：
1.1引物设计
根据NC_017250和BP26基因序列，用Oligo6.0设计引物，分别在上游引物和下游引物中插入EcoRI、XhoI酶切位点，引物的合成由华大基因有限公司完成，引物序列见表1。
表1 NC_017250和BP26基因引物序列
1.2基因组DNA提取
按照Axygen核酸提取试剂盒步骤操作提取布鲁氏菌基因组DNA。
1.3 NC_017250基因PCR扩增
将A19疫苗株NC_017250基因与NCBI公布的其它种布鲁氏菌进行BLAST比对分析，然后进行PCR扩增和特有性验证。PCR扩增反应条件为：预变性95℃5min；变性94℃1min，退火55℃1min，延伸72℃1.5min，35个循环；再延伸72℃10min。PCR扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测。
1.4目的基因扩增
目的基因PCR扩增，进行凝胶琼脂糖电泳检测。具体反应条件如1.3描述。
1.5 PCR产物回收
按照Axygen PCR产物回收试剂盒说明书步骤操作，回收NC_017250和BP26基因PCR产物。
1.6 PCR回收产物与pMD19-TSimple载体的连接
取200μL离心管加1μL pMD19-T Simple Vector、4μL PCR回收产物、5μL SolutionⅠ，离心混匀，16℃过夜连接。
1.7重组质粒的转化
按照北京全式金(TransGen Biotech)生物技术有限公司Trans1-T1感受态细胞使用说明书操作步骤，将连接产物转化于Trans1-T1感受态细胞中，涂布于含抗生素(Amp)的固体LB培养基上，37℃培养过夜。
1.8重组克隆菌菌液PCR鉴定
挑取阳性菌落，接种到含抗生素(Amp)的液体LB培养基中培养过夜，培养物做PCR扩增鉴定。
1.9重组克隆质粒的双酶切鉴定
按照Axygen质粒提取试剂盒说明书提取重组质粒，用限制性内切酶XhoI和EcoRⅠ对重组质粒进行双酶切电泳检测。
1.10重组克隆菌测序
经PCR鉴定及质粒双酶切鉴定后的重组克隆菌，送到北京华大基因公司进行双向测序。
1.11目的基因与表达载体pET30a的回收
将测序正确的克隆菌株和含有pET30a质粒的菌接种于LB培养基中培养过夜，提取质粒，回收目的基因片段和pET30a片段。
1.12目的基因与表达载体pET30a的连接
取200μL离心管加入6μL回收的目的片段、2μL pET30a表达载体片段、1μL T4 DNA连接酶、1μL buffer，16℃连接过夜。
1.13重组质粒转化于感受态细胞
按照北京全式金(TransGen Biotech)生物技术有限公司BL21(DE3)感受态细胞使用说明书操作步骤，将连接产物转化于BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含抗生素(Kan)固体LB培养基上37℃培养过夜。
1.14重组表达菌菌液PCR鉴定
具体步骤见1.8。
1.15重组表达质粒的双酶切鉴定
具体步骤见1.9。
1.16重组表达菌诱导表达
1.16.1诱导表达的条件
将构建好的BL21(pETNC_017250)重组表达菌涂在LB-Kan固体培养基上培养12～16h，在6mL液体LB-Kan培养基里接种单菌落，37℃过夜培养。再按1∶100接种到20mL LB-Kan培养基中振荡(150r/min)培养至OD600＝0.6～1.0。根据本实验室前期所做的诱导表达条件优化实验，选择重组表达菌BL21(pETNC_017250)的最佳诱导时间约为4h，当OD600＝0.6～1.0时IPTG最终诱导浓度为0.5mol/L，最佳培养温度为37℃，进行SDS-PAGE电泳检测，另1mL测OD600。
1.16.2重组蛋白表达形式的检测
根据优化的最适诱导条件，菌液与培养基以1∶100比例扩培并诱导重组菌300mL，1,2000×g离心10min，用PBS洗涤沉淀，重悬沉淀后，在室温下加溶菌酶反应1h，几次反复冻融(-20℃)后，置于超声波破碎处理10min，1,2000×g离心10min，分别收集沉淀物和上清液，利用12％SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的可溶性。
1.17重组蛋白包涵体溶解及纯化
按照优化的最适条件，诱导500mL重组表达细菌，以1,2000×g离心10min。用PBS洗涤沉淀，重悬菌体沉淀，室温下加入溶菌酶反应1h，几次反复冻融(-20℃)后，置于超声波破碎处理10min，1,2000×g离心10min，弃上清并用8mol/L尿素溶解沉淀，1,2000×g离心10min，收集上清，0.45μm滤菌器过滤后，用Ni+柱(上海生工)对蛋白进行纯化。
1.18重组蛋白western blotting检测
重组蛋白SDS-PAGE电泳后，取出蛋白质凝胶，按顺序放置滤纸，PVDF膜，蛋白质凝胶和滤纸在夹子上，100V 60min转膜。转膜结束后，用TBST漂洗膜4min，重复3次，室温封闭1h。再把PVDF膜用TBST重复漂洗3～4次。将S2免疫牛血清(一抗)按1∶100稀释，将PVDF膜放在一抗稀释液中4℃孵育过夜。取PVDF膜再漂洗3～4遍，将辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG按1∶7500稀释，然后将PVDF膜在二抗稀释液中温孵育1h。用TBST漂洗PVDF膜3次，用ECL进行显色并成像分析。
2、实验结果
2.1 NC_017250基因PCR扩增
将NC_017250基因与NCBI数据库库里的基因序列BLAST比对。结果显示NC_017250基因存在于羊，猪，绵羊，犬，鲸和鳍种布鲁氏菌中，而不存在于牛种布鲁氏菌中(见表2)。
表2 NC_017250比对结果
NC_017250基因PCR扩增后进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1。结果表明，羊种和猪种布鲁氏菌核酸中扩增出约879bp条带，而在牛种布鲁氏菌核酸中均未扩增出预期大小的条带，说明NC_017250基因为牛种特异性缺失基因。
2.2目的基因扩增
NC_017250和BP26 PCR扩增后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图2。结果显示：NC_017250和BP26分别出现约879bp、753bp条带，与预期的目的条带大小相符。
2.3重组克隆菌PCR鉴定
目的片段与pMD19-T载体连接后转入感受态细胞，在固体培养基上培养12～16h，挑取3个菌落接种到LB液体培养基，培养12～16h，再以菌液为模板PCR扩增，并进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。NC_017250和BP26基因克隆菌分别扩增出了约879bp、753bp条带，均获得了预期大小的目的条带。
2.4重组克隆质粒的双酶切鉴定
经菌液PCR鉴定呈阳性的菌株提取质粒，用限制性内切酶(EcoRI、XhoI)进行双酶切，酶切产物电泳检测，结果见图3、图4。结果均出现了两个条带，分别为NC_017250(0.8kb、2.7kb)、BP26(0.7kb、2.7kb)，表明两个目的基因序列成功插入pMD19-T载体序列中。
2.5重组表达菌PCR鉴定
目的片段插入到pET30a载体后转化感受态菌体细胞，涂布在固体培养基上培养12～16h，挑取3个单菌落摇菌培养12～16h，以菌液为模板PCR扩增，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。NC_017250和BP26分别扩增出约879bp、753bp的条带，与预期的目的条带大小相符。
2.6重组表达质粒的双酶切鉴定
经PCR鉴定呈阳性的菌株提取质粒(按照Axygen质粒提取试剂盒说明书操作)用限制性内切酶(EcoRI、XhoI)进行双酶切，酶切产物电泳检测，结果见图5、图6。结果均出现两个条带，分别为NC_017250(0.8kb、5.4kb),BP26(0.7kb、5.4kb)，结果表明两个目的片段成功插入表达载体pET30a中。
2.7测序结果及分析
经PCR鉴定和双酶切鉴定呈阳性的克隆菌和重组表达菌菌液进行双向测序，为了确保测序结果的准确性，每个基因挑取3个独立的阳性菌株进行双向测序。双向测序得到的NC_017250序列与全基因组测序得到的NC_017250基因核苷酸序列比对同源性均为100％。双向测序得到的BP26序列与在NCBI公布的序列同源性为100％。说明NC_017250及BP26成功克隆至载体pMD19-T中，并成功构建重组表达载体。
2.8重组表达菌诱导表达
2.8.1重组表达菌诱导条件优化
根据本实验室前期所做的诱导表达条件优化实验，选择重组表达菌BL21(pETNC_017250)的最佳诱导时间约为4h，当OD600＝0.6～1.0时IPTG最终诱导浓度为0.5mmol/L，最佳培养温度为37℃。结果表明，重组表达菌在上述条件下可以大量表达，通过15％SDS-PAGE检测，与预期产物一致(图7)。
2.8.2最佳诱导条件下重组蛋白表达形式的检测
确定重组表达菌最佳表达条件后，按最佳条件大量诱导重组菌，低温1,2000×g收集菌体。用PBS洗涤数次后，加入溶菌酶放置1h并在-20℃反复冻融，分别收集离心沉淀物、上清液，电泳检测。结果显示，融合蛋白主要存在于沉淀中，说明重组蛋白主要以包涵体形式表达，见图8。
2.9重组蛋白包涵体溶解及蛋白纯化
按照最佳表达条件诱导培养重组菌，高速离心弃上清，收集菌体，洗涤并悬浮菌体沉淀，在室温下加入溶菌酶1h，几次重复冻融(-20℃)后，超声波破碎处理10min，1,2000×g离心10min，弃上清并用8mmol/L尿素溶解沉淀，高速离心并收集上清液。通过孔径为0.45μm的过滤器过滤后，将重组蛋白过Ni+柱纯化(上海生工)，从而得到纯化重组蛋白(图9)。
2.10重组蛋白Western-bloting检测
WB检测的重组蛋白rNC_017250与非牛种S2疫苗免疫的牛血清反应，特异性条带出现在40kDa。结果表明，重组蛋白可特异性结合1∶100倍稀释的S2抗体，其免疫原性较好。重组蛋白rNC_017250不与1∶100倍稀释的A19免疫牛血清反应。表明NC_017250基因不存在于A19疫苗株中，重组蛋白rNC_017250具有较好的免疫原性。BP26重组蛋白能够与牛种血清和非牛种血清的抗体发生特异性反应，具有较好的免疫原性。说明NC_017250基因是牛种缺失的，结果见图10、11、图12。
实施例2 iELISA鉴别家畜体内牛种与非牛种布鲁氏菌抗体的方法建立
1、实验方法
1.1抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定
按照棋盘滴定法，将实施例1中纯化好的两个重组蛋白用包被液进行稀释，NC_017250初始抗原浓度为0.5μg/μL,稀释梯度为1：6.25、1：12.5、1：25、1∶50四个梯度；BP26初始抗原浓度0.553μg/μL稀释梯度为1：25、1：50、1：100、1∶200四个梯度，每孔加100μL，4℃包被过夜，第二天弃掉孔内液体，用洗涤液洗三次，每次静置5min，洗涤结束后拍干酶标板孔内的液体。每孔加100μL封闭液，在37℃放置2h，用洗涤液洗三次，每次静置5min，洗涤结束后拍干酶标板孔内的液体。将已知阳性、阴性血清按1：50、1：100、1：200、1：400的四个梯度进行稀释，每孔加100μL稀释好的血清，37℃放置1h，用洗涤液洗三次，每次静置5min，洗涤结束后拍干酶标板孔内的液体。NC_017250抗原板中每孔加入1：5000稀释的HRP兔抗牛IgG100μL；BP26抗原板中每孔加1：7000稀释的驴抗绵羊IgG-HRP 100μL。37℃放置30min,用洗涤液洗三次，每次静置5min，洗涤结束后拍干酶标板孔内的液体。每孔加100μL TMB显色液，37℃显色10min。显色结束后，每孔加100μL终止液终止反应，并在酶标仪上读取OD450值。根据OD450值计算每组的P/N值，P/N＝实验组/对照组＝OD阳性血清/OD阴性血清，P/N值最大时所对应的抗原稀释度和血清稀释度为最佳稀释度。
1.2二抗最佳浓度的确定
根据1.1选择最适抗原包被浓度及血清稀释度。rNC_017250每孔加入HRP标记兔抗牛IgG，以1：2500、1：5000、1：7500、1：10000 4个梯度进行稀释；rBP26每孔加驴抗绵羊IgG-HRP按1：5000、1：7500、1：10000、1：15000四个梯度稀释。每孔加100μL，进行iELISA试验。根据OD450值计算每个二抗稀释度的P/N值，P/N值最大时所对应的二抗稀释度即为最佳二抗稀释度。
1.3重复性实验
对2份阳性血清和2份绵羊阴性血清进行iELISA检测，每个样品重复3次，计算每个样品标准差。
1.4判定点的确定
以重组蛋白rNC_017250抗原检测S2免疫血清22份和A19免疫血清20份，重组BP26(rBP26)抗原检测20份背景清楚的自然感染血清及30份S2免疫血清，通过SPSS软件ROC分析，确认两个重组抗原iELISA判定点。
1.5敏感性和特异性实验
rNC_017250和rBP26抗原检测20份背景清楚的自然感染血清及30份S2免疫血清，通过SPSS软件分析，确认两个重组抗原iELISA敏感性和特异性。
1.6田间实验
将待检的血清进行iELISA检测，比较两种抗原的阳性检出率。
2、实验结果
2.1最佳包被浓度和最佳血清稀释度的确定
将纯化好的rNC_017250和rBP26抗原按1.1记载的梯度稀释，已知阳性血清和阴性血清按四个梯度稀释，进行iELISA检测，根据iELISA显色后的颜色和OD450值可知阳性、阴性血清颜色和OD450值大小存在明显差异，检测结果见表3、表4。当rNC_017250抗原包被浓度为20μg/mL、血清稀释度为1：100时，P/N值最大；根据P/N值计算出PB26抗原最佳包被浓度为5.53μg/mL，血清最佳稀释度为1∶100，结果见表5、表6。
表3棋盘滴定测rNC_017250抗原OD450值
表4 rBP26抗原棋盘滴定OD450值
表5 rNC_017250抗原检测P/N值
表6 rBP26抗原对应的P/N值
2.2酶标二抗最佳稀释度的确定
根据iELISA显色反应的颜色及计算P/N值大小，确定rNC_017250酶标二抗最佳稀释度为1：5000，rBP26酶标二抗最佳稀释度为1∶7500，结果见表7、表8。
表7 rNC_017250最佳二抗稀释度
表8 rBP26酶标二抗最佳工作浓度的确定
2.3重复实验
选取2份阳性血清和阴性血清，用两种重组抗原iELISA检测，每个样品重复3次。rNC_017250结果表明，3次重复实验OD450值差异变化不显着，标准差均靠近0，表明该重组抗原建立的iELISA检测方法重复性较好，结果如表9。rBP26结果表明，3次重复OD450差异不明显，表明重组抗原建立的iELISA检测方法均具有较好的重复性，结果如表10。
表9 rNC_017250重组抗原重复试验OD450值及SD值
表10 rBP26重组抗原重复实验OD450值及SD值
2.4判定点的确定
rNC_017250和rBP26抗原用iELISA法检测血清，OD450值结果见表11、表12。利用SPSS软件根据OD450值进行ROC分析，确定重组抗原rNC_017250iELISA判定点为0.390，重组抗原rBP26 iELISA判定点为0.589，判定点分析见图13、图14。重组抗原rNC_017250ROC分析曲线下面积为0.989，重组抗原rBP26 ROC分析曲线下面积为0.965，2个重组抗原ROC分析曲线下面积均接近1，说明2个重组抗原iELISA检测法可靠性高，结果见图15、图16。
表11 rNC_017250判定点检测OD450值
表12 rBP26判定点OD450值
2.5特异性敏感性分析
rNC_017250重组抗原检测S2免疫血清22份和A19免疫血清20份，rBP26抗原检测20份背景清楚的布鲁氏菌自然感染血清及30份布鲁氏菌S2免疫血清，通过SPSS软件分析发现重组抗原rNC_017250iELISA敏感性为95.2％，特异性达90.5％，重组抗原rBP26 iELISA敏感性为90％、特异性为86.7％，具体结果见图13、图14。
2.6田间实验
对180份SAT及RBPT检测呈阳性的布鲁氏菌感染血清进行iELISA检测，以rNC_017250抗原检测出38个阳性，rBP26检测出176个阳性，说明180份血清中有38个为非牛种布鲁氏菌感染或存有非牛种疫苗的抗体。rNC_017250抗原iELISA检测方法检出阳性率为21.1％(38/180)，而rBP26抗原iELISA检测方法检出阳性率为97.8％(176/180)，说明在SAT及RBPT检测呈阳性的家畜中，存在牛种自然感染或牛种疫苗抗体。rNC_017250可用于布鲁氏菌牛种与其它种布鲁氏菌感染的鉴别，结果见表13。
表13田间实验结果
抗原
检测血清份数
阳性份数
阴性份数
阳性检出率
rNC_017250
180
38
142
21.1％
rBP26
180
176
4
97.8％
可见，本发明建立的iELISA鉴别检测方法能鉴别牛种与其它种布鲁氏菌感染的布鲁氏菌病，且该方法具有较好的重复性及较高的特异性和敏感性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 内蒙古农业大学
<120> 一种用于鉴别牛种布鲁氏菌与其它种布鲁氏菌的试剂盒
<130> KHP211117975.4
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 879
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
taccatgtgc cgctccggct ctttcgcatc aagcgggcgt cgcgctggcg cttgcggcat 60
ggcgctttgc ttgcggcgat gctcttccgt tttcaccacg atcatgaatt cataggcggc 120
gagaaggcgg caatagagat agccgggctt gccgtcgaga aacccgccac gcaatatata 180
catatagaga aagcgcaggc tgggccggaa aggcaaatta taggagagcg atttcagtgt 240
gcggcgcctg cgctccggtt cgccggatag aaggccgccc caatcgatgt ggcgttccag 300
gcgctttgag gcggccaggt ctgcctcgac ggaggaataa cggttgtgct tgtcatacca 360
ggcggccagc cccttgttgg aactgtaatg gatgaaatgg gcctgtaatt cgccgcccgg 420
cccaccgctt gcccgcgaat ggacggagcg ctcgaaatgc acacggtccg gccgcacgag 480
gcgggttatc caggtgggat aaaggctcgc atggcgtatc cagcgcccca tgaacatatt 540
cttgtaacgc gccttgaaga agacttcagg ccggtcggga tcggcggcta tcgccagcat 600
ttcatcacgc agatccggcg gggtgatttc gtcggcatcg ggtgtataga cccaggcatg 660
tctgaactcg atttcggtta atccatacat gcgctggcgg tcttcggtgt cataggcccg 720
ctggtagatg cgcgcgccag ccgctctggc aatctcgacc gtgcggtcgg tgctgaatga 780
atccagcacg acgatatcat cgcaccagtc gagcgaagcc agacatgccg gcaggttggc 840
ttcctcgttg agcgtcatga tgagcacgga aacggtcat 879
<210> 2
<211> 288
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Tyr His Val Pro Leu Arg Leu Phe Arg Ile Lys Arg Ala Ser Arg Trp
1 5 10 15
Arg Leu Arg His Gly Ala Leu Leu Ala Ala Met Leu Phe Arg Phe His
20 25 30
His Asp His Glu Phe Ile Gly Gly Glu Lys Ala Ala Ile Glu Ile Ala
35 40 45
Gly Leu Ala Val Glu Lys Pro Ala Thr Gln Tyr Ile His Ile Glu Lys
50 55 60
Ala Gln Ala Gly Pro Glu Arg Gln Ile Ile Gly Glu Arg Phe Gln Cys
65 70 75 80
Ala Ala Pro Ala Leu Arg Phe Ala Gly Lys Ala Ala Pro Ile Asp Val
85 90 95
Ala Phe Gln Ala Leu Gly Gly Gln Val Cys Leu Asp Gly Gly Ile Thr
100 105 110
Val Val Leu Val Ile Pro Gly Gly Gln Pro Leu Val Gly Thr Val Met
115 120 125
Asp Glu Met Gly Leu Phe Ala Ala Arg Pro Thr Ala Cys Pro Arg Met
130 135 140
Asp Gly Ala Leu Glu Met His Thr Val Arg Pro His Glu Ala Gly Tyr
145 150 155 160
Pro Gly Gly Ile Lys Ala Arg Met Ala Tyr Pro Ala Pro His Glu His
165 170 175
Ile Leu Val Thr Arg Leu Glu Glu Asp Phe Arg Pro Val Gly Ile Gly
180 185 190
Gly Tyr Arg Gln His Phe Ile Thr Gln Ile Arg Arg Gly Asp Phe Val
195 200 205
Gly Ile Gly Cys Ile Asp Pro Gly Met Ser Glu Leu Asp Phe Gly Ser
210 215 220
Ile His Ala Leu Ala Val Phe Gly Val Ile Gly Pro Leu Val Asp Ala
225 230 235 240
Arg Ala Ser Arg Ser Gly Asn Leu Asp Arg Ala Val Gly Ala Glu Ile
245 250 255
Gln His Asp Asp Ile Ile Ala Pro Val Glu Arg Ser Gln Thr Cys Arg
260 265 270
Gln Val Gly Phe Leu Val Glu Arg His Asp Glu His Gly Asn Gly His
275 280 285
<210> 3
<211> 753
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgaacactc gtgctagcaa ttttctcgca gcctcatttt ccacaatcat gctcgtcggc 60
gctttcagcc tgcccgcttt cgcacaggag aatcagatga cgacgcagcc cgcgcgcatc 120
gccgtcaccg gggaaggcat gatgacggcc tcgcccgata tggccattct caatctctcg 180
gtgctacgcc aggcaaagac cgcgcgcgaa gccatgaccg cgaataatga agccatgaca 240
aaagtgctcg atgccatgaa gaaggccggc atcgaagatc gcgatctcca gacaggcggc 300
atcaatatcc agccgattta tgtctatcct gacgacaaga acaacctgaa agagcctacc 360
atcaccggct attctgtatc caccagtctc acggttcgcg tgcgcgaact ggccaatgtt 420
ggaaaaattt tggatgaatc cgtcacgctc ggtgttaatc agggcggtga tttgaacctg 480
gtcaatgata atccctccgc cgtgatcaac gaggcgcgca agcgcgcagt ggccaatgcc 540
attgccaagg cgaagacgct tgccgacgct gcaggcgtgg ggcttggccg tgtggtggaa 600
atcagtgaac tgagccgccc gcccatgccg atgccaattg cgcgcggaca gttcagaacc 660
atgctagcag ccgcaccgga caattccgtg ccgattgccg caggcgaaaa cagctataac 720
gtatcggtca atgtcgtttt tgaaatcaag taa 753
<210> 4
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Asn Thr Arg Ala Ser Asn Phe Leu Ala Ala Ser Phe Ser Thr Ile
1 5 10 15
Met Leu Val Gly Ala Phe Ser Leu Pro Ala Phe Ala Gln Glu Asn Gln
20 25 30
Met Thr Thr Gln Pro Ala Arg Ile Ala Val Thr Gly Glu Gly Met Met
35 40 45
Thr Ala Ser Pro Asp Met Ala Ile Leu Asn Leu Ser Val Leu Arg Gln
50 55 60
Ala Lys Thr Ala Arg Glu Ala Met Thr Ala Asn Asn Glu Ala Met Thr
65 70 75 80
Lys Val Leu Asp Ala Met Lys Lys Ala Gly Ile Glu Asp Arg Asp Leu
85 90 95
Gln Thr Gly Gly Ile Asn Ile Gln Pro Ile Tyr Val Tyr Pro Asp Asp
100 105 110
Lys Asn Asn Leu Lys Glu Pro Thr Ile Thr Gly Tyr Ser Val Ser Thr
115 120 125
Ser Leu Thr Val Arg Val Arg Glu Leu Ala Asn Val Gly Lys Ile Leu
130 135 140
Asp Glu Ser Val Thr Leu Gly Val Asn Gln Gly Gly Asp Leu Asn Leu
145 150 155 160
Val Asn Asp Asn Pro Ser Ala Val Ile Asn Glu Ala Arg Lys Arg Ala
165 170 175
Val Ala Asn Ala Ile Ala Lys Ala Lys Thr Leu Ala Asp Ala Ala Gly
180 185 190
Val Gly Leu Gly Arg Val Val Glu Ile Ser Glu Leu Ser Arg Pro Pro
195 200 205
Met Pro Met Pro Ile Ala Arg Gly Gln Phe Arg Thr Met Leu Ala Ala
210 215 220
Ala Pro Asp Asn Ser Val Pro Ile Ala Ala Gly Glu Asn Ser Tyr Asn
225 230 235 240
Val Ser Val Asn Val Val Phe Glu Ile Lys
245 250