具体实施方式

：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：多溴联苯醚识别基因元件的获得

配置无机盐培养基，每升水中分别含有以下物质(g/L)：Na₂HPO₄·12H₂O 2.0、KH₂PO₄ 0.7、NH₄Cl 0.5、NaCl 0.3、MgSO₄·7H₂O 0.1、CaSO₄·2H₂O 0.05、FeCl₃·6H₂O 0.2×10^-3、NaMoO₄ 0.2×10^-3、MnCl₂·4H₂O 0.2×10^-3、CuCl₂·2H₂O 0.2×10^-3、ZnSO₄ 0.2×10^-3、H₃BO₃ 0.3×10^-3、CoCl₂·6H₂O 0.4×10^-3、蛋白胨0.2、酵母抽提物1.0、葡萄糖5.0。分别接种S.xenophagum疏水菌株C1(＝CCTCC AB 2015198＝KCTC 42740)和亲水株C2(＝CCTCC AB2015427＝KCTC 52051)到LB液体培养基中，置于转速200rpm/min的摇床中30℃培养至对数生长期，菌体OD₆₀₀值约为1.0。10,000×g离心10min，去上清，收集菌体。用无机盐培养基洗涤菌体两次后，用一定体积无机盐培养基重悬菌体，使菌体OD₆₀₀达到1.0左右。在1L体积的三角瓶中分别加入0(对照)和5mL的十溴联苯醚BDE-209母液(500μM，溶解于二氯甲烷中)，于黑暗中挥发干溶剂后，加入500mL无机盐培养基使BDE_209的终浓度分别达到0和5μM。按照体积分数2％的接种量把10mL的疏水菌株C1和亲水株C2菌悬液分别接种到培养基中，置于转速200rpm/min的摇床中30℃培养8h。10,000×g离心10min，去上清，收集菌体。利用RNA提取试剂盒(Takara RNAiso Plus Kit)分别提取菌体的总RNA，利用Epicentre Ribo-ZeroTM Magnetic Kit试剂盒去除rRNA。然后根据TruSeq RNA Sample Prep kit forIllumina试剂盒的操作方法对mRNA进行建库处理，最后利用广州基迪奥生物科技有限公司的Illumina Hiseq 2000平台进行mRNA表达量的测序分析。

根据基因表达的RPKM(Reads Per kb per Million reads)值，利用FDR(falsediscovery rate)<0.05且|log₂FC|>1来筛选差异表达基因。参考基因组信息为S.xenophagum C1基因组(NCBI登录号No.CP022745、CP022746、CP022747、CP022748、CP022749、CP022750和CP022751)。结果显示，在BDE-209暴露条件下，C1菌和C2菌的全基因组中的4428个基因中共有101个基因发生显著变化，其中显著上调的基因有29个，显著下调的基因有72个。29个显著上调的基因中，有17个基因在C1菌和C2菌中均上调，具有相同的表达模式。另外12个基因仅在C1菌中被上调表达，而在C2菌中无明显变化。基因注释表明12个在C1菌中特异上调的基因主要参与重金属抗性(chr1_1106-chr1_1109)、NO代谢(p2_0159-p2_0162)、卟啉代谢(chr1_2498-chr1_2500)以及小分子识别(chr1_2466)；17个在C1菌和C2菌中均上调的基因主要参与苯乙烯降解(chr1_1483)、异生物质响应(chr1_2605)、重金属响应(chr1_2170)以及未知功能(chr2_0630-chr2_0636)(图1A)。

生物传感器常用的生物识别元件(传感器蛋白)主要包括转录调节蛋白、双组分感知蛋白、甲基受体感受蛋白和周质结合蛋白等类型。根据这些分类对BDE_209响应显著上调的29个基因进行注释分析发现，有4个基因元件属于这些识别元件类别，分别是编码异生物质响应转录因子的chr1_2605(NCBI登录号No.ASY45241.1)、编码UrcA家族转录调节蛋白的chr1_2170(NCBI登录号No.ASY44883.1)、编码金属调节蛋白ArsR/SmtB家族转录因子的chr1_1106(NCBI登录号No.ASY43965.1)以及编码Cache结构域感受蛋白的chr1_2466(NCBI登录号No.ASY45126.1)。其中chr1_2605和chr1_2170基因在C1菌响应BDE-209过程中分别上调2.28和2.88倍；在C2菌响应BDE-209过程中分别上调2.01和2.43倍(图1B)。而基因元件chr1_1106和chr1_2466仅在C1菌响应BDE-209过程中上调表达，分别上调为3.25和2.03倍；而在C2菌响应BDE-209过程中无显著变化(图1C)。这4个基因元件作为候选的多溴联苯醚识别基因元件进行下一步的深入分析。

实施例2：多溴联苯醚识别元件的活性及特点分析

对上述获得的4个候选的多溴联苯醚识别基因元件进行活性分析。通过在生工生物工程(上海)股份有限公司合成基因的方法，在4个候选的识别元件基因的C端加上Promega公司提供的萤火虫荧光素酶小肽HiBiT的编码序列(5′-GTGAGCGGCTGGCGGCTGTTCAAGAAGATTAGC-3′)，合成包括各候选基因上游约500bp包括启动子序列的基因，并且在基因片段两端分别设计BamHI和XhoI酶切位点(chr1_1106合成基因5′和3′端分别含有EcoRI和XhoI酶切位点)。基因合成后，使用TaKaRa的BamHI和XhoI限制性内切酶在K缓冲液中37℃处理chr1_2605、chr1_2170和chr1_2466合成基因片段以及pET24a表达载体，使用TaKaRa的EcoRI和XhoI限制性内切酶在H缓冲液中37℃处理chr1_1106合成基因片段以及pET24a表达载体，利用北京全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司的重组酶进行相应基因片段与载体的连接。连接有重组片段的pET24a载体通过电击转化方法转化到C1菌的感受态细胞中，转化菌液最后涂布在含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基平板上，30℃静置培养24h。挑取在平板上长出来的单克隆子，利用通用引物T7(5′-TAATACGACTCACTATAGG-3′)和T7-TER(5′-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3′)进行菌落PCR，扩增产物电泳正确后送样进行测序分析。最终获得了序列正确的分别含有pET-1106-HiBiT、pET-2170-HiBiT、pET-2466-HiBiT和pET-2605-HiBiT报告载体的C1菌底盘细胞。

将4种报告载体的C1菌底盘细胞接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，置于转速200rpm/min的摇床中30℃培养过夜至菌体OD₆₀₀值约为1.0。10,000×g离心10min，去上清，收集菌体。用无机盐培养基洗涤菌体两次后，用一定体积无机盐培养基重悬菌体，使菌体OD₆₀₀达到1.0左右。在5mL体积的棕色玻璃瓶中分别加入0、5、10和20μL的BDE-209母液(50μM，溶解于二氯甲烷中)，于黑暗中挥发干溶剂后，加入200μL无机盐培养基使BDE_209的终浓度分别达到0、1.25、2.5和5μM。按照2％的接种量分别接种4μL的底盘细胞菌悬液到预添加有不同浓度BDE-209的200μL无机盐培养基中，置于转速200rpm/min的摇床中30℃培养8h至菌体细胞OD₆₀₀值达到0.4。分别取100μL底盘细胞样品进行蛋白定量分析以保证各样品的蛋白浓度基本一致。其余100μL底盘细胞样品添加100μL胞外非裂解缓冲液(含萤火虫荧光素酶大亚基LgBiT及荧光素酶发光底物furimazine，Promega公司)或胞内裂解缓冲液(含裂解液、萤火虫荧光素酶大亚基LgBiT及荧光素酶发光底物furimazine，Promega公司)，在化学发光仪上进行胞外或胞内荧光素酶活性分析。

分析结果表明，4种报告载体的C1菌底盘细胞均能检测到胞内荧光素酶活性，但是胞外荧光素酶活性仅在C1(pET-2170-HiBiT)和C1(pET-2466-HiBiT)中检测到，说明chr1_2170和chr1_2466基因元件编码蛋白位于细胞膜外，而chr1_1106和chr1_2605基因元件编码蛋白位于细胞质内。对不同浓度BDE-209诱导的荧光素酶活性分析发现，C1(pET-1106-HiBiT)和C1(pET-2605-HiBiT)的胞内荧光素酶活性都与BDE_209的浓度无线性关系，C1(pET-2170-HiBiT)的胞外及胞内荧光素酶活性也与BDE_209的浓度无线性关系；而只有C1(pET-2466-HiBiT)无论胞外荧光素酶活性还是胞内活性，均与BDE_209的浓度呈显著线性关系(图2)，说明Chr1_2466很可能是一种新的多溴联苯醚的识别感受蛋白。

通过生物信息学分析发现，chr1_2466基因元件编码蛋白Chr1_2466(NCBI登录号No.ASY45126.1)是一种Cache结构域的胞外感受蛋白，长154个氨基酸(其氨基酸序列如SEQID NO.3所示)，在N端含有24个氨基酸(MFPFSRTLTAMVCALALSAAPALA)的信号肽，说明Chr1_2466是一种细胞膜蛋白。该蛋白的等电点是5.59，分子量16.5KD。文献报道Cache结构域是一种胞外结构域蛋白，在小分子的识别中具有重要的作用。因此，实验设计通过凝胶阻滞实验验证Chr1_2466与多溴联苯醚的识别与结合特性。取在0和5μM的BDE-209无机盐培养基中培养8h的C1(pET-2466-HiBiT)菌体细胞，10,000×g离心10min，去上清，收集菌体。用无机盐培养基洗涤菌体两次后，用一定体积的裂解缓冲液(50mM Tris–HCl,pH 8.0,150mMNaCl,1mM EDTA,0.25％Triton X-100)重悬菌体，使菌体OD₆₀₀达到1.0左右。加入新鲜配制的溶解酶使其终浓度为0.5mg/mL，加入Merck公司的蛋白酶抑制剂以抑制蛋白降解，然后在25℃条件下缓慢摇动处理菌悬液20min。裂解液于4℃、10,000×g离心5min，去沉淀，取上清液在12％聚丙烯酰胺非变性凝胶中进行蛋白电泳，4℃、100V电泳1h。随后将蛋白胶置于转印槽中以180mA转印2h到硝酸纤维素膜上，然后把硝酸纤维素膜置于TBST缓冲液(20mMTris-HCl,pH 7.5,150mM NaCl,0.1％Tween 20)中，室温下缓慢摇动孵育30min。把硝酸纤维素转移到Promega公司的印迹缓冲液中，加入100nM的荧光素酶大亚基LgBiT蛋白，室温下缓慢摇动孵育1h。最后加入25μM的荧光素酶底物furimazine，室温孵育5min，把硝酸纤维素膜至于Bio-Rad公司的ChemiDoc XRS+成像系统中拍照分析。实验结果显示，在非变性条件下，Chr1_2466是一个四聚体蛋白，分子量约为66KD。由于BDE-209的水溶性非常低，极少部分溶解到水里的BDE-209与Chr1_2466结合，引起电泳凝胶上Chr1_2466蛋白条带的滞后与弥散。另外，从电泳图谱也可以看出，BDE-209可以显著诱导Chr1_2466基因编码蛋白的上调表达(图3)。这些结果证实了Chr1_2466是一种新的多溴联苯醚的识别感受蛋白。

实施例3：多溴联苯醚监测全细胞微生物传感器的构建及性能分析

合成引物2466U(5′-GGATCCGCGGCGAAGGCATCTATAT-3′)和引物2466D(5′-GCGTCTTCCATTTCGGGATAATAGCC-3′)，扩增chr1_2466基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)及其上游507bp序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)。合成引物LucU(5′-CGGCTATTATCCCGAAATGGAAGACGCCAAAAACA-3′)和引物LucD(5′-CTCGAGTTACACGGCGATCTTTCC-3′)，扩增萤火虫荧光素酶luc基因(NCBI登录号No.AB762768.1)完整序列。利用2466U(5′-GGATCCGCGGCGAAGGCATCTATAT-3′)和引物LucD(5′-CTCGAGTTACACGGCGATCTTTCC-3′)对扩增的chr1_2466和luc两个基因片段进行PCR融合，获得在两端分别含有BamHI和XhoI酶切位点的融合片段chr1_2466-luc。使用TaKaRa的BamHI和XhoI限制性内切酶在K缓冲液中37℃处理融合片段chr1_2466-luc以及pET24a表达载体，利用北京全式金生物技术(TransGenBiotech)有限公司的重组酶进行酶切片段与载体的连接。连接有重组片段的pET24a载体通过电击转化方法分别转化到C1菌和C2菌的感受态细胞中，转化菌液最后涂布在含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基平板上，30℃静置培养24h。挑取在平板上长出来的单克隆子，利用通用引物T7(5′-TAATACGACTCACTATAGG-3′)和T7-TER(5′-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3′)进行菌落PCR，扩增产物电泳正确后送样进行测序分析。最终获得了序列正确的含有pET-2466-Luc报告载体的C1底盘细胞和C2底盘细胞的微生物传感器。

将C1(pET-2466-Luc)底盘细胞接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，置于转速200rpm/min的摇床中30℃培养过夜至菌体OD₆₀₀值约为1.0。10,000×g离心10min，去上清，收集菌体。用无机盐培养基洗涤菌体两次后，用一定体积无机盐培养基重悬菌体，使菌体OD₆₀₀达到1.0左右。在5mL体积的棕色玻璃瓶中分别加入0、5、10、20、24、25、30、35和40μL的BDE-209母液(50μM，溶解于二氯甲烷中)，于黑暗中挥发干溶剂后，加入200μL无机盐培养基使BDE_209的终浓度分别达到0、1.25、2.5、5.0、6.0、6.25、7.50、8.75和10.0μM；在5mL体积的棕色玻璃瓶中分别加入0、0.4、2、5、10、20和50μL的BDE-209母液(5μM，溶解于二氯甲烷中)，于黑暗中挥发干溶剂后，加入200μL无机盐培养基使BDE_209的终浓度分别达到0、0.01、0.05、0.125、0.5和1.25μM；在5mL体积的棕色玻璃瓶中分别加入1μM的PCB-209、联苯醚、苯酚、BDE-1、BDE-47、BDE-99、BDE-153、BDE-183、BDE-209、氯化钾、氯化钠、氯化镁、氯化锌、氯化钙、氯化汞、三氯化锑、三氧化二锑、酒石酸锑钾、硫酸锰、硫酸镍、硫酸铬、氯化钴、硫酸镉、硝酸铜、砷酸钠、亚砷酸钠、硝酸铅、三氯化铁、硝酸铝，加入200μL无机盐培养基。按照2％的接种量分别接种4μL的C1(pET-2466-Luc)底盘细胞菌悬液到添加有不同浓度底物的200μL无机盐培养基中，置于转速200rpm/min的摇床中30℃培养8h至菌体细胞OD₆₀₀值达到0.4。分别取100μL底盘细胞样品进行蛋白定量分析以保证各样品的蛋白浓度基本一致。其余100μL底盘细胞样品添加荧光素酶发光底物furimazine，在化学发光仪上进行胞外荧光素酶活性分析。

对C1(pET-2466-Luc)全细胞微生物传感器的灵敏性分析结果表明，在受试浓度的BDE-209(0-10μM)中，6μM的BDE-209诱导获得了最大的荧光信号。随着BDE-209浓度增加至6.25μM以上，荧光信号急剧下降，说明高浓度的BDE-209对底盘细胞产生了毒性。另一方面也说明了C1(pET-2466-Luc)全细胞微生物传感器可以用于BDE-209的毒性监测，细胞毒性阈值是6.25μM。C1(pET-2466-Luc)全细胞微生物传感器的最低检测限是0.01μM，约9.59μg/L的BDE-209。通过对0.05到6.0μM之间的BDE-209浓度与荧光信号进行相关性分析发现，两者的相关性指数R²为0.98。对全细胞微生物传感器的特异性分析结果表明，C1(pET-2466-Luc)对多氯联苯、联苯醚、苯酚、金属离子以及无机盐均没有明显响应，可以把多溴联苯醚和联苯醚区分开。而在代表性的多溴联苯醚中，C1(pET-2466-Luc)对BDE-209的亲和性最高，随着多溴联苯醚的溴代程度下降其亲和性下降，对一溴代联苯醚的响应最低(图4)。这也说明了溴离子很可能是Chr1_2466感受蛋白结合多溴联苯醚的关键离子之一。

实施例4：不同细胞表面疏水性底盘细胞的传感性能比较

将实施例3构建的由不同细胞表面疏水性的底盘细胞构建的全细胞微生物传感器C1(pET-2466-Luc)和C2(pET-2466-Luc)分别接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，置于转速200rpm/min的摇床中30℃培养过夜至菌体OD₆₀₀值约为1.0。10,000×g离心10min，去上清，收集菌体。用无机盐培养基洗涤菌体两次后，用一定体积无机盐培养基重悬菌体，使菌体OD₆₀₀达到1.0左右。在5mL体积的棕色玻璃瓶中分别加入0和2.5μM的BDE-1、BDE-47、BDE-99、BDE-153、BDE-183和BDE-209，于黑暗中挥发干溶剂后，加入200μL无机盐培养基。按照2％的接种量分别接种4μL的C1(pET-2466-Luc)和C2(pET-2466-Luc)底盘细胞菌悬液到预添加有不同浓度多溴联苯醚的200μL无机盐培养基中，置于转速200rpm/min的摇床中30℃培养8h至菌体细胞OD₆₀₀值达到0.4。分别取100μL底盘细胞样品进行蛋白定量分析以保证各样品的蛋白浓度基本一致。其余100μL底盘细胞样品添加荧光素酶发光底物furimazine，在化学发光仪上进行胞外荧光素酶活性分析。

对不同浓度的多溴联苯醚诱导的荧光素酶活性分析发现，由亲水底盘细胞构建的全细胞微生物传感器C2(pET-2466-Luc)对不同浓度的多溴联苯醚均没有明显的响应，而由疏水底盘细胞构建的C1(pET-2466-Luc)全细胞微生物传感器对BDE-209及其低溴代同系物都具有特异性的响应(图5)。由于亲水的C2(pET-2466-Luc)对多溴联苯醚并没有明显的吸附性，其较低的细胞表面疏水性不利于底盘细胞接触和感知疏水性的多溴联苯醚。这个结果表明，疏水底盘细胞在疏水性有机污染物的监测方面具有明显的优势，并且可以显著提高疏水性有机污染物监测的灵敏性。

序列表

<110> 广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）

<120> 一种多溴联苯醚感受蛋白及其构建的全细胞微生物传感器

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 465

<212> DNA

<213> Sphingobium xenophagum C1

<400> 1

atgttcccat tttcgcgcac cctcacggct atggtctgcg ccctcgcgct ttccgccgcc 60

cccgccctgg ccgccccgca tgccgatgca gcacaggcgc aggccatgct cgaaaaagcc 120

gtggcgacca tcaagacggc cggtgccggg cctgcctttg ctgcgttcaa tcaaaaggac 180

ggggcattca acaccgggga actctatgtg ttcgttttcg acctgaacgg ggtctacgaa 240

gcctatggcg cgcatcccgg cttggtcggc cgcgatgtca gcgatctgac cgatgcggaa 300

ggcaaaccga tcgtgcgcga catgatagag attgcccgca ccagcggcca tggaaagatc 360

aattatgtct ggctcaaccg cgctgacaat cgggtcgaac gcaagatgtc gctgatcgaa 420

ctggtcgaca atcatgtcgt gggtgtcggc tattatcccg aatag 465

<210> 2

<211> 507

<212> DNA

<213> Sphingobium xenophagum C1

<400> 2

gcggcgaagg catctatatc gatcatgtcg ccatggacca ggactggcgc acgcatcatg 60

tccccctttt ttacggcttt caaagctatg tgtcgctgcc tgtcattctg cttgatggca 120

gcttctacgg cacgctgtgc gccattgatc ccaacccccg ttcggtcagc gcgccggcca 180

tcgtcgccgc catgcaggac tatgcccgat cgatcggtgc gatattgtcg gcgaaatgat 240

gctgttgttc agtcgatagt gccgggactt cgcctgactc gtttgcgtcc agcggggcca 300

aggtagattt ccgaccttga gcggtgcggc cgcgacaggc ctctccatgc atatggcctc 360

ataccaaagg tcgatttgat ctgcgtctaa atgcgcgggc gcggatcggg ttaattacgc 420

tctgtcatcg gcaatcggat cgggaccgaa ggtccgcctg catccggctt cagcgtttgt 480

tgtcgatgat cagaggagat ttggctc 507

<210> 3

<211> 154

<212> PRT

<213> Sphingobium xenophagum C1

<400> 3

Met Phe Pro Phe Ser Arg Thr Leu Thr Ala Met Val Cys Ala Leu Ala

1 5 10 15

Leu Ser Ala Ala Pro Ala Leu Ala Ala Pro His Ala Asp Ala Ala Gln

20 25 30

Ala Gln Ala Met Leu Glu Lys Ala Val Ala Thr Ile Lys Thr Ala Gly

35 40 45

Ala Gly Pro Ala Phe Ala Ala Phe Asn Gln Lys Asp Gly Ala Phe Asn

50 55 60

Thr Gly Glu Leu Tyr Val Phe Val Phe Asp Leu Asn Gly Val Tyr Glu

65 70 75 80

Ala Tyr Gly Ala His Pro Gly Leu Val Gly Arg Asp Val Ser Asp Leu

85 90 95

Thr Asp Ala Glu Gly Lys Pro Ile Val Arg Asp Met Ile Glu Ile Ala

100 105 110

Arg Thr Ser Gly His Gly Lys Ile Asn Tyr Val Trp Leu Asn Arg Ala

115 120 125

Asp Asn Arg Val Glu Arg Lys Met Ser Leu Ile Glu Leu Val Asp Asn

130 135 140

His Val Val Gly Val Gly Tyr Tyr Pro Glu

145 150