花青素合成相关蛋白AcMYB306及其编码基因与应用
阅读说明：本技术 花青素合成相关蛋白AcMYB306及其编码基因与应用 (Anthocyanin synthesis related protein AcMYB306 and coding gene and application thereof ) 是由 李晓杰 梁毅 焦棒棒 曹琳娇 于 2020-12-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了花青素合成相关蛋白AcMYB306及其编码基因与应用。本发明所提供的花青素合成相关蛋白AcMYB306为氨基酸序列是SEQ ID NO:2所示的蛋白质。实验证明,与野生型拟南芥相比,转AcMYB306基因拟南芥幼苗中的花青素含量显著提高。花青素合成相关蛋白AcMYB306及其编码基因在调控植物花青素合成中具有重要的理论意义和实用价值。本发明在农业领域具有重要的应用和市场前景。(The invention discloses an anthocyanin synthesis related protein AcMYB306, and a coding gene and application thereof. The anthocyanin synthesis related protein AcMYB306 provided by the invention is a protein with an amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 2. Experiments prove that compared with wild type arabidopsis, the anthocyanin content in the seedling of the AcMYB306 gene-transferred arabidopsis is obviously improved. The anthocyanin synthesis related protein AcMYB306 and the coding gene thereof have important theoretical significance and practical value in regulating and controlling plant anthocyanin synthesis. The invention has important application and market prospect in the agricultural field.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及花青素合成相关蛋白AcMYB306及其编码基因与应用。
背景技术
花青素属于生物类黄酮物质，而黄酮物质最主要的生理活性功能是自由基清除能力和抗氧化能力。研究证明，花青素是当今人类发现最有效的抗氧化剂，也是最强效的自由基清除剂，花青素的抗氧化性能比VE高50倍，比VC高20倍。花青素不仅使植物呈现五彩缤纷的颜色，而且具有保健功能。一定花青素浓度的提取物能有效预防不同阶段癌变发生，但花青素的个体作用并不确定。此外，随着科技的发展，人们对食品添加剂的安全性越来越重视，天然添加剂的开发利用已成为添加剂发展使用的总趋势。花青素在食品中不但可以作为营养强化剂，还可作为食品防腐剂代替苯甲酸等合成防腐剂，并且可作为食品着色剂应用于平常饮料和食品，符合人们对食品添加剂天然、安全、健康的总要求。因此，挖掘花青素合成相关基因具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的为提高植物的花青素含量。
本发明首先保护AcMYB306蛋白，可为如下1)或2)或3)或4)：
1)氨基酸序列是SEQ ID NO:2所示的蛋白质；
2)在SEQ ID NO:2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
3)将1)或2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的、来源于洋葱且与花青素合成相关的蛋白质；
4)与SEQ ID NO:2限定的氨基酸序列具有80％或80％以上同源性，来源于洋葱且与花青素合成相关的蛋白质。
其中，SEQ ID NO:2由261个氨基酸残基组成。
为了使1)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID NO:2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1.标签的序列
上述3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述3)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO:1自5’末端起第408至1193位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
本发明还保护编码所述AcMYB306蛋白的核酸分子。
所述编码AcMYB306蛋白的核酸分子可为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)所示的DNA分子：
(a1)编码区是SEQ ID NO:1自5’末端起第408至1193位所示的DNA分子；
(a2)核苷酸序列是SEQ ID NO:1所示的DNA分子；
(a3)与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同源性，来源于洋葱且编码所述AcMYB306蛋白的DNA分子；
(a4)在严格条件下与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列杂交，来源于洋葱且编码所述AcMYB306蛋白的DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，SEQ ID NO:1由1490个核苷酸组成，SEQ ID NO:1自5’末端起第408至1193位所示的核苷酸编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述AcMYB306蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述AcMYB306蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述AcMYB306蛋白，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的所述AcMYB306蛋白的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
本发明还保护含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。
所述含有上述任一所述核酸分子的重组载体可为在表达载体的多克隆位点插入SEQ ID NO:1自5’末端起第408至1193位所示的DNA分子得到的重组质粒。
所述重组载体具体可为重组质粒SUP1300-AcMYB306。重组质粒SUP1300-AcMYB306可为将超表达载体SUP1300的限制性内切酶SalI和KpnI酶切识别位点之间的DNA小片段替换为SEQ ID NO:1自5’末端起第408至1193位所示的DNA分子，得到的重组质粒。
所述含有上述任一所述核酸分子的重组微生物可为将含有上述任一所述核酸分子的重组载体导入出发微生物得到的重组菌。
所述出发微生物可为农杆菌或大肠杆菌。所述农杆菌具体可为根癌农杆菌。所述根癌农杆菌具体可为根癌农杆菌GV3101。
所述含有上述任一所述核酸分子的重组微生物具体可为将重组质粒SUP1300-AcMYB306导入根癌农杆菌GV3101，得到的重组农杆菌。
本发明还保护上述任一所述AcMYB306蛋白、上述任一所述核酸分子或含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物在调控花青素合成中的应用。
上述应用中，所述调控花青素合成可为提高花青素合成或降低花青素合成。
所述花青素合成可为植物花青素合成。
本发明还保护上述任一所述AcMYB306蛋白、上述任一所述核酸分子或含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物在培育花青素含量改变的转基因植物中的应用。
上述应用中，所述培育花青素含量改变的转基因植物可为培育花青素含量增加的转基因植物或培育花青素含量降低的转基因植物。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：提高受体植物中上述任一所述AcMYB306蛋白表达量和/或活性，得到转基因植物；与所述受体植物相比，所述转基因植物的花青素含量提高。
上述方法中，所述“提高受体植物中上述任一所述AcMYB306蛋白表达量和/或活性”可通过转基因、多拷贝、改变启动子、调控因子等本领域熟知的方法，达到提高受体植物中上述任一所述AcMYB306蛋白的表达量和/或活性的效果。
上述方法中，所述“提高受体植物中上述任一所述AcMYB306蛋白表达量和/或活性”具体可通过向受体植物中导入编码上述任一所述AcMYB306蛋白的核酸分子实现。
所述编码上述任一所述AcMYB306蛋白的核酸分子可为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)所示的DNA分子：
(a1)编码区是SEQ ID NO:1自5’末端起第408至1193位所示的DNA分子；
(a2)核苷酸序列是SEQ ID NO:1所示的DNA分子；
(a3)与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同源性，来源于洋葱且编码所述AcMYB306蛋白的DNA分子；
(a4)在严格条件下与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列杂交，来源于洋葱且编码所述AcMYB306蛋白的DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，SEQ ID NO:1由1490个核苷酸组成，SEQ ID NO:1自5’末端起第408至1193位所示的核苷酸编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
上述方法中，所述向受体植物中导入编码上述任一所述AcMYB306蛋白的核酸分子具体可通过向受体植物导入含有上述任一所述核酸分子的重组载体实现。
所述含有上述任一所述核酸分子的重组载体具体可为重组质粒SUP1300-AcMYB306。重组质粒SUP1300-AcMYB306可为将超表达载体SUP1300的限制性内切酶SalI和KpnI酶切识别位点之间的DNA小片段替换为SEQ ID NO:1自5’末端起第408至1193位所示的DNA分子，得到的重组质粒。
本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：增加植物中上述任一所述AcMYB306蛋白的表达量和/或活性，从而提高植物的花青素含量。
上述任一所述植物可为c1)至c9)中的任一种：c1)单子叶植物；c2)双子叶植物；c3)十字花科植物；c4)拟南芥；c5)野生型拟南芥Columbia-0亚型；c6)百合科植物；c7)洋葱；c8)红皮洋葱XiuQiu；c9)白皮洋葱Ring Master。
向野生型拟南芥中导入AcMYB306基因，得到转AcMYB306基因拟南芥。实验证明，与野生型拟南芥相比，转AcMYB306基因拟南芥幼苗中的花青素含量显著提高。由此可见，花青素合成相关蛋白AcMYB306可以调控植物花青素合成。本发明在农业领域具有重要的应用和市场前景。
附图说明
图1为实时荧光定量PCR检测红皮洋葱XiuQiu和白皮洋葱Ring Master中AcMYB306基因的相对表达量。
图2为半定量PCR检测转AcMYB306基因拟南芥中AcMYB306基因的表达量。
图3为转AcMYB306基因拟南芥的表型鉴定。
图4为转AcMYB306基因拟南芥的总花青素含量的测定。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第二版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
红皮洋葱XiuQiu和白皮洋葱Ring Master记载于如下文献中：Chunsha Zhang，Xiaojie Li，Zongxiang Zhan，Aisong Zeng，Guojun Chang，Yi Liang.TranscriptomeSequencing and Metabolism Analysis Reveals the role of Cyanidin Metabolism inDark-red Onion(Allium cepa L.)Bulb，Scientific Reports，2018，8(1)：14109.
野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Columbia-0亚型)记载于如下文献中：Kim H，Hyun Y，Park J，Park M，Kim M，Kim H，Lee M，Moon J，Lee I，Kim J.A geneticlink between cold responses and flowering time through FVE in Arabidopsisthaliana.Nature Genetics.2004,36:167-171.在下文中，野生型拟南芥(Arabidopsisthaliana)(Columbia-0亚型)简称野生型拟南芥。
超表达载体SUP1300记载于如下文献中：DEXH box RNA helicase-mediatedmitochondrial reactive oxygen species production in Arabidopsis mediatescrosstalk between abscisic acid and auxin signaling.[J].Plant Cell，2012，24(5)：1815-1833.在该文献中的名称为pCAMBIA1300重组超表达启动子super。
实施例1、AcMYB306基因的获得
本发明的发明人经过大量实验，从洋葱中分离获得了AcMYB306基因。AcMYB306基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
AcMYB306基因编码SEQ ID NO:2所示的AcMYB306蛋白；确切的说是SEQ ID NO:1自5’末端起第408至1193位所示的DNA分子编码SEQ ID NO:2所示的AcMYB306蛋白。
实时荧光定量PCR检测红皮洋葱XiuQiu和白皮洋葱Ring Master中AcMYB306基因的相对表达量。具体步骤如下：
1、分别提取红皮洋葱XiuQiu和白皮洋葱Ring Master的RNA，之后反转录，得到相应的cDNA。
2、分别以红皮洋葱XiuQiu和白皮洋葱Ring Master的cDNA为模板，实时荧光定量PCR检测AcMYB306基因的相对表达量(以AcActin基因作为内参)。
检测AcMYB306基因的引物为5’-GGAATACTCATCTGAAACGAAAGC-3’和5’-AGCAACCAAGTCTCCAGCATC-3’。
检测AcActin基因的引物为5’-GCCGAGCGTGAGATAGTCCG-3’和5’-CCTATCAGCAATGCCAGGAAAC-3’。
将白皮洋葱Ring Master中AcMYB306基因的相对表达量作为1，获得红皮洋葱XiuQiu中AcMYB306基因的相对表达量。
检测结果见图1(XiuQiu为红皮洋葱XiuQiu，Ring master为白皮洋葱RingMaster)。结果表明，红皮洋葱XiuQiu中AcMYB306基因的相对表达量显著高于白皮洋葱RingMaster。
已有文献(Transcriptome Sequencing and Metabolism Analysis Reveals therole of Cyanidin Metabolism in Dark-red Onion(Allium cepa L.)Bulb，ScientificReports，2018，8(1):14109)记载，红皮洋葱XiuQiu中花青素的含量约为白皮洋葱RingMaster的25倍。据此推测，AcMYB306基因可能于花青素合成相关。
实施例2、转AcMYB306基因拟南芥的获得和花青素含量的测定
一、重组质粒SUP1300-AcMYB306的构建和重组农杆菌的获得
1、提取红皮洋葱XiuQiu的RNA，之后反转录，得到红皮洋葱XiuQiu的cDNA。
2、以红皮洋葱XiuQiu的cDNA为模板，采用引物MYB306-SalI-F：5’-CGCGTCGACATGGTGAGATCGCCTTGCTGCGA-3’(下划线为限制性内切酶SalI的识别位点)和MYB306-KpnI-TAA-R：5’-CGGGGTACCTCAAAAGAAAACAGAATTATCAT-3’(下划线为限制性内切酶KpnI的识别位点)组成的引物对进行PCR扩增，得到约804bp的PCR扩增产物。
3、用限制性内切酶SalI和KpnI酶切步骤2得到的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶SalI和KpnI酶切超表达载体SUP1300，回收约10070kb的载体骨架。
5、将酶切产物和载体骨架进行连接，得到重组质粒SUP1300-AcMYB306。
将重组质粒SUP1300-AcMYB306进行测序。测序结果表明，重组质粒SUP1300-AcMYB306为将超表达载体SUP1300的限制性内切酶SalI和KpnI酶切识别位点之间的DNA小片段替换为SEQ ID NO:1自5’末端起第408至1193位所示的DNA分子，其它均不变，得到的重组质粒。
6、将重组质粒SUP1300-AcMYB306导入根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。
二、转AcMYB306基因拟南芥的获得
1、采用拟南芥花序浸花转化法(记载于如下文献中Clough，S.J.，and Bent，A.F..Floraldip：asimplified method for Agrobacterium-mediated transformationof Arabidopsis thaliana.Plant J.(1998)16，735-743.)，将重组农杆菌转至野生型拟南芥中，获得T1代转AcMYB306基因拟南芥种子。
2、将步骤1获得的T1代转AcMYB306基因拟南芥种子播种于含有30mg/L潮霉素的MS固体培养基上，能够正常生长的拟南芥(抗性苗)即为T1代转AcMYB306基因阳性苗，T1代转AcMYB306基因阳性苗收到的种子即为T2代转AcMYB306基因拟南芥种子。
3、将步骤2筛选出的不同株系的T2代转AcMYB306基因拟南芥种子播种于含有30mg/L潮霉素的MS固体培养基上进行筛选，如果某株系中能够正常生长的拟南芥(抗性苗)的数目与不能够正常生长的拟南芥(非抗性苗)的数目比例为3：1，则该株系为AcMYB306基因插入一个拷贝的株系，该株系中的抗性苗收到的种子即为T3代转AcMYB306基因拟南芥种子。
4、将步骤3筛选出的T3代转AcMYB306基因拟南芥种子再次播种于含有30mg/L潮霉素的MS固体培养基上进行筛选，均为抗性苗的即为T3代纯合转AcMYB306基因拟南芥。将其中1个T3代纯合转AcMYB306基因拟南芥株系命名为OEAcMYB306。
三、半定量PCR检测
待测拟南芥种子为OEAcMYB306的T3代种子或野生型拟南芥种子。
1、取待测拟南芥种子，用70％(v/v)乙醇水溶液浸泡30s，无菌水洗涤3次；然后铺于MS固体培养基上，4℃春化2天。
2、完成步骤1后，取所述待测拟南芥种子，22℃光暗交替培养(16h光照培养/8h暗培养)7天，得到待测拟南芥幼苗。
3、提取待测拟南芥幼苗的RNA，之后反转录，得到待测拟南芥的cDNA。
4、以待测拟南芥的cDNA为模板，半定量PCR检测AcMYB306基因的表达量(以AtActin2基因作为内参)。
检测AcMYB306基因的引物为MYB306-F：5’-GGAATACTCATCTGAAACGAAAGC-3’和MYB306-R：5’-AGCAACCAAGTCTCCAGCATC-3’。
检测AtActin2基因的引物为Primer-TF：5’-AGCACTTGCACCAAGCAGCATG-3’和Primer-TR：5’-ACGATTCCTGGACCTGCCTCATCTGCTCATACGGTCAGCGATA-3’。
检测结果见图2(M为DNA Marker，Col为野生型拟南芥)。结果表明，与野生型拟南芥幼苗相比，OEAcMYB306的T3代种子获得的幼苗中AcMYB306基因的表达量显著增加。
由此可见，OEAcMYB306的T3代种子获得的幼苗均为阳性苗。
四、转AcMYB306基因拟南芥的表型鉴定
待测拟南芥种子为OEAcMYB306的T3代种子或野生型拟南芥种子。
1、取待测拟南芥种子，用70％(v/v)乙醇水溶液浸泡30s，无菌水洗涤3次；然后铺于MS固体培养基上，4℃春化2天。
2、完成步骤1后，取所述待测拟南芥种子，22℃光暗交替培养(16h光照培养/8h暗培养)7天，得到待测拟南芥幼苗。
3、在显微镜下观察拟南芥幼苗的颜色。
结果见图3(Col为野生型拟南芥)。结果表明，野生型拟南芥幼苗的根和叶片均为绿色，OEAcMYB306的T3代种子获得的幼苗的根和部分叶片均为紫红色。
五、转AcMYB306基因拟南芥的总花青素含量的测定
待测拟南芥种子为OEAcMYB306的T3代种子或野生型拟南芥种子。
1、取待测拟南芥种子，用70％(v/v)乙醇水溶液浸泡30s，无菌水洗涤3次；然后铺于MS固体培养基上，4℃春化2天。
2、完成步骤1后，取所述待测拟南芥种子，22℃光暗交替培养(16h光照培养/8h暗培养)14天，得到待测拟南芥幼苗。
3、检测待测拟南芥幼苗的花青素含量。花青素含量的测定方法记载于如下文献中：A Radish Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factor，RsTT8 Acts a PositiveRegulator for Anthocyanin Biosynthesis.Front Plant Sci 8：1917。
检测结果见图4(Col为野生型拟南芥)。结果表明，与野生型拟南芥幼苗相比，OEAcMYB306的T3代种子获得的幼苗中花青素含量显著提高。
上述结果表明，过表达AcMYB306基因能显著提高野生型拟南芥的花青素含量，即AcMYB306蛋白可以促进花青素的合成。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
<110> 北京市农林科学院
<120> 花青素合成相关蛋白AcMYB306及其编码基因与应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1490
<212> DNA
<213> Allium cepa L.
<400> 1
gtccttggaa atctaatagg ttttgatttg taaatcttaa acatacagct actataaaca 60
gtattcatta actactctta taatagccca tgccttgttt tttctttcct ttttcccggt 120
gcattctcaa taaatacaca cggttctgcg cagcagcagt gctagcttta gatagaaaca 180
agttactttg taaatagaga tatttagttg acttttatgg tattatgagc aaaataattt 240
attgctcctt gctgtcatca tgcatgttga ctcttcgctc ctcttcaatt gtagtcaatg 300
cattcttttt cctataaatc tcactgcaaa ccatagcttt gtacatatac tgctacttca 360
atattcagtt acatatacac caaatataca taagtataca taagaaaatg gtgagatcgc 420
cttgctgcga taaagtaggt gtgaaaaaag gaccatggac tcctgaagaa gacatcactt 480
tggtttctta cattcaagaa catggtcctg gaaactggaa ggctgtccct gctaatactg 540
ggttattgag atgtagcaag agctgtaggc tcagatggac aaattattta aggccaggga 600
taaagcgtgg aaactttact gatcaagaag agaagcttat tattcatctt caagctcttt 660
tgggcaacag atgggctgca attgcttcat atcttccaga aagaacagac aacgacatca 720
agaactactg gaatactcat ctgaaacgaa agcttgagaa aaacaacaaa ggcagtaaca 780
acagcaacac aaactctaaa ggaagatggg aaaaaagatt acaaactgat atccacatgg 840
caaaacaagc tcttgaagac gctttatctt tagataacaa acaaatcact tgcgataaca 900
atgacaactt tgagataaag ccatccacta catacgcttc gagcgcagag aatatttcaa 960
ggcttttgga aggatggaag aagactagtc cgatgaactc gaagtatact gaatctagcg 1020
agagcaccag tcaaagtgtg aatgtggcat cagaggtttc tgagagtagc gagagcaagc 1080
catgttttga ggtccaaatg ccaatttcga tgctggagac ttggttgctt gacgatagtt 1140
ttggaggagg tatgtttgat atggcaatgg atgataattc tgttttcttt tgaggtggtg 1200
attttgtatt cgtgcaggtt ttaaatgcct gttttgatta gcaaaattgt acattaagaa 1260
gatagagatt agtattgtac aagtgttgct ggcttaatgt aaaaggctaa aatgctgttc 1320
gatttcatgt tttttcttta aatattcaag tgaggaagta tcttattaac ttgattgttg 1380
taaagatgta ggctgtgtta attgaaatag taagtcatgg atgctacaag aacaatatta 1440
acatggaatt atcagaagtg taaatcaaat actcagcatt tgcaactttt 1490
<210> 2
<211> 261
<212> PRT
<213> Allium cepa L.
<400> 2
Met Val Arg Ser Pro Cys Cys Asp Lys Val Gly Val Lys Lys Gly Pro
1 5 10 15
Trp Thr Pro Glu Glu Asp Ile Thr Leu Val Ser Tyr Ile Gln Glu His
20 25 30
Gly Pro Gly Asn Trp Lys Ala Val Pro Ala Asn Thr Gly Leu Leu Arg
35 40 45
Cys Ser Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Thr Asn Tyr Leu Arg Pro Gly
50 55 60
Ile Lys Arg Gly Asn Phe Thr Asp Gln Glu Glu Lys Leu Ile Ile His
65 70 75 80
Leu Gln Ala Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ala Ala Ile Ala Ser Tyr Leu
85 90 95
Pro Glu Arg Thr Asp Asn Asp Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Thr His Leu
100 105 110
Lys Arg Lys Leu Glu Lys Asn Asn Lys Gly Ser Asn Asn Ser Asn Thr
115 120 125
Asn Ser Lys Gly Arg Trp Glu Lys Arg Leu Gln Thr Asp Ile His Met
130 135 140
Ala Lys Gln Ala Leu Glu Asp Ala Leu Ser Leu Asp Asn Lys Gln Ile
145 150 155 160
Thr Cys Asp Asn Asn Asp Asn Phe Glu Ile Lys Pro Ser Thr Thr Tyr
165 170 175
Ala Ser Ser Ala Glu Asn Ile Ser Arg Leu Leu Glu Gly Trp Lys Lys
180 185 190
Thr Ser Pro Met Asn Ser Lys Tyr Thr Glu Ser Ser Glu Ser Thr Ser
195 200 205
Gln Ser Val Asn Val Ala Ser Glu Val Ser Glu Ser Ser Glu Ser Lys
210 215 220
Pro Cys Phe Glu Val Gln Met Pro Ile Ser Met Leu Glu Thr Trp Leu
225 230 235 240
Leu Asp Asp Ser Phe Gly Gly Gly Met Phe Asp Met Ala Met Asp Asp
245 250 255
Asn Ser Val Phe Phe
260