具体实施方式

除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。

一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

根据本发明的第一个方面，提供了GhTLP19蛋白在调控棉花抗黄萎病菌中的应用；

所述GhTLP19蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明通过对棉花内GhTLP19蛋白的研究，首次鉴定了棉花植物 GhTLP19蛋白在调控棉花响应黄萎病菌中的应用，为棉花抗病品质的遗传改良提供了有效的途径。

在一些优选地实施方式中，本发明还发现通过使棉花过表达GhTLP19 蛋白，能够显著增强棉花对黄萎病菌的耐受性，为培育抗黄萎病菌的棉花新品种提供了宝贵的基因资源。

根据本发明的第二个方面，提供了GhTLP19蛋白的编码基因或含有所述编码基因的生物材料在调控棉花抗黄萎病菌中的应用；

所述GhTLP19蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述GhTLP19蛋白的编码基因具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

其中，所述“具有”指的是所述GhTLP19蛋白的编码基因核苷酸序列可以是只如SEQID NO.2所示的核苷酸序列，也可以由SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列和其他核苷酸序列组成，例如编码用于蛋白纯化的标签、荧光蛋标记物和DNA的结合位点等功能单元的核苷酸序列，或者编码对基因转录和表达具有调节作用的元件，包括但不限于启动子、强启动子、增强子或转录因子结合位点等；所述“具有”还可以指如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列在GhTLP19蛋白的编码基因中是不连续的，但是可以产生如 SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的cDNA。

在一些优选地实施方式中，本发明还发现通过使棉花包含GhTLP19蛋白的编码基因或含有所述编码基因的生物材料，能够显著增强棉花对黄萎病菌的耐受性，为培育抗黄萎病菌的棉花新品种提供了宝贵的基因资源。

作为优选，所述生物材料包括基因表达盒、表达载体或宿主细胞。

根据本发明的第三个方面，本发明还提供了一种调控棉花抗黄萎病菌的方法，其特征在于，包括如下(a)和/或(b)：

(a)使棉花包含GhTLP19蛋白的编码基因或含有所述编码基因的生物材料；

(b)使棉花过表达GhTLP19蛋白；

所述GhTLP19蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述GhTLP19蛋白的编码基因具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

由于棉花未受到黄萎病菌侵染时GhTLP19蛋白的编码基因几乎不表达，因此使正常棉花包含GhTLP19蛋白的编码基因，即能够起到相应的预防作用，提高棉花对黄萎病菌的耐受性。

同时，由于本发明通过研究已经发现GhTLP19蛋白能够提高棉花对黄萎病的耐受能力，因此使棉花过表达GhTLP19蛋白也能够起到调控棉花抗黄萎病菌目的。

需要说明的是，本发明中的“和/或”指的是，可以单独使棉花包含 GhTLP19蛋白的编码基因或含有所述编码基因的生物材料，也可以在使棉花包含GhTLP19蛋白的编码基因或含有所述编码基因的生物材料的基础上，使棉花过表达GhTLP19蛋白。

在一些优选的实施方式中，通过将GhTLP19蛋白的编码基因转入棉花中以使棉花包含GhTLP19蛋白的编码基因和/或使棉花过表达GhTLP19蛋白。

通过转基因的方式使棉花包含GhTLP19蛋白的编码基因和/或使棉花过表达GhTLP19蛋白，工艺简单易行，周期短，调控效率高。

可选地，可以通过将携带有GhTLP19蛋白的编码基因的表达载体转入棉花中，例如通过Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔的常规生物技术方法转入棉花中，本发明对此不做限定。

在一些优选的实施方式中，将GhTLP19蛋白的编码基因构建至表达载体上，然后用得到的重组表达载体转化农杆菌，并用转化的农杆菌浸染受体棉花的胚性器官分割茎段，待培养出愈伤组织后继续分化培养得到转基因棉花株。

其中，表达载体指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。

优选使用pBI121作为本发明的表达载体。

作为优选，所述受体棉花的胚性器官包括下胚轴。

下面通过实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，实施例中的材料为根据现有方法制备而得，或直接从市场上购得。

实验材料：

本实验选取的棉花材料为中棉所36和中棉所24，种植于中国农业科学院棉花研究所棉花生物学国家重点实验室试验田(安阳白璧)，管理措施为正常大田管理。

实验试剂与耗材：

酶及试剂盒：GXL DNAPolymerase高保真酶、荧光定量试剂盒、RNA反转录试剂盒、胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒均购自宝生物工程大连有限公司；Ultra One Step Cloning Kit试剂盒购自Vazyme公司；质粒少量提取试剂盒购自Magen公司；限制性内切酶购自NEB公司；DNAMarker、植物总RNA提取试剂盒购自TIANGEN公司。

其他药品：琼脂糖为西班牙原装产品，蛋白胨、酵母提取物、氯仿、异戊醇、乙醇、异丙醇、氯化钠等为国产分析纯，氨苄青霉素等购自宝生物工程大连有限公司，大肠杆菌感受态细胞购自北京天根生化科技公司。

培养基：LB液体培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeast extract)5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L；LB固体培养基：胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L、酵母提取物(Yeastextract)5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L、琼脂粉 15g/L，定容至1L；

LB选择培养基：在LB铺平板前，待培养基高压灭菌冷却至55℃时加入相应浓度抗生素，摇匀后铺平板。

主要仪器：PCR扩增仪(BIO-RAD)，高速离心机(Hettich MIKRO 200R)、电泳设备(BIO-RAD)、凝胶成像系统(BIO-RAD)、荧光定量PCR 仪(ABI7500)、电热恒温培养箱(上海森信)、恒温培养振荡器(上海智城)、人工气候室。

实施例1：棉花基因GhTLP19的表达模式分析

在本实验室前期对棉花CCRI36被黄萎病菌侵染后的表达谱分析发现 GH_A05G1964(GhTLP19)在棉花未受到黄萎病菌侵染时几乎不表达，但是当受到黄萎病菌侵染后在根中的表达量显著性的上调表达，其在Dt亚组上的同源基因GH_D05G2004的表达趋势相近，但没GhTLP19的趋势显著，而其它4个基因的表达趋势没有变化(图1中的A)。

从-80℃冰箱中取出黄萎病菌V991的孢子液，然后在PDA(Days post anthesis)培养基上涂抹均匀，在25℃条件下倒置黑暗放置6天，挑取正常良好的菌丝转移至Czapek’s液体培养中，25℃摇床150rpm培养5天左右。用8层纱布对菌液进行过滤，然后用血球计数板统计孢子浓度，使用蒸馏水将其调至2×10⁷个/mL。将每个小苗根部吸10mL已经准备好的黄萎病菌孢子液。然后于营养钵中放于25℃的温室中，光照周期为16h光照/8h 黑暗。用清水处理对照。分别在侵染后0h、6h、12h、24h和48h时期对处理组和对照组得根进行取样并进行RNA的提取和cDNA的反转录，从 CottonFGD上获得GhTLP19的CDS序列，设计引物，进行荧光定量PCR 的进行。图1中的B为GhTLP19的表达模式图。

克隆过程：取处理组和对照组材料不同处理时期的根，迅速放入液氮中冷冻，在液氮中研磨，并保存于-80℃冰箱备用；植物总RNA提取：RNA 的提取采用TIANGEN公司RNA提取试剂盒进行；参照Toyobo的反转录试剂盒FSQ-201得说明书进行cDNA的合成；将反转录产物cDNA溶液稀释6倍作为PCR反应模板并进行荧光定量。荧光定量引物如下：

qrtGhTLP19-F：GCAGTCAAGGCAGTTGGTGGTA(SEQ ID NO.3)；

qrtGhTLP19-R：ATATTCCGGCGTGTTGAAGGCA(SEQ ID NO.4)。

PCR反应体系：

PCR反应程序：

棉花GhTLP19基因的克隆：从CottonFGD上获得GhTLP19的基因序列，设计引物，从上述步骤得到的陆地棉中棉所36的根cDNA中扩增 GhTLP19的CDS序列，其开放阅读框为735bp，编码244个氨基酸，蛋白的相对分子量为25.48kDa，等电点为4.601。

根据TaKaRaGXL DNAPolymerase高保真酶说明书，PCR 反应体系如下：

PCR扩增程序为：98℃3min；98℃10s；56℃15s；68℃1min，35 个循环；68℃10min。引物序列如下：

GhTLP19-F：ATGGCGATTTCCTTTGGG(SEQ ID NO.5)；

GhTLP19-R：TTAGCTGGTTGGACAAAATGTG(SEQ ID NO.6)。

随后对目的片段使用胶回收试剂盒进行切胶回收；将胶回收的产物根据Ultra One Step Cloning Kit试剂盒进行连接T载体构建和转化大肠杆菌；37℃过夜培养从氨苄抗性LB培养基上挑取单克隆后37℃摇菌培养；菌液PCR验证，挑取阳性克隆样品，送样至生工生物生物科技有限公司测序，测序正确的菌液中加入60％的甘油，-70℃保存。

实施例2：VIGS沉默GhTLP19降低棉花对黄萎病菌的耐受性

挑选饱满的中棉所36种子种植在人工气候室中，光周期和温度条件为：光照16h，28℃；黑暗8h，22℃。待幼苗子叶展平，第一片真叶露出(约10 天)后，进行VIGS菌液注射试验。

VIGS沉默载体的构建：将沉默载体pCLCrVA用SpeI和AscI两个酶进行双酶切，并将酶切产物进行胶回收。GhTLP19沉默片段从中棉所36根得cDNA里通过PCR进行扩增，所用引物为：

GhTLP19clcrv-F:CAAAATGGCATGCCTGCAGACTAGTTTGACTGCT ACGGCCATGTT(SEQ IDNO.7)；

GhTLP19clcrv-R:GAATTCACTAGACCTAGGGGCGCGCCCAGTATGG CCTGGTTCCCTG(SEQ IDNO.8)。

将克隆到得片段使用infusion方法构建入已酶切的pCLCrVA载体中，将测序正确的质粒转入农杆菌，并进行菌落PCR，条带正确的菌液甘油保存至80℃。

将载体CLCrV:GhTLP19、空载体CLCrV:00、CLCrVB转化入农杆菌 LBA4404感受态。使用含有相应抗性的LB培养基扩摇，待菌液摇至橘黄色，离心弃上清。用重悬液(10mMMgCl₂、10mM MES、200mM乙酰丁香酮)将活化的农杆菌的OD₆₀₀调至1.5。将CLCrV:GhTLP19与CLCrVB、 CLCrV:00与CLCrVB、CLCrV:GhPDS与CLCrVB按1:1比例混合，室温静置2小时，然后用1mL注射器渗透至CCRI36充分展开的棉花子叶中。过夜暗处理后，转移至25℃、16小时光/8小时暗光周期的温室中。当 CLCrV:GhPDS植株表现出表型时，取样鉴定目的基因的沉默效率。随后如实施例1所述进行黄萎病菌处理。用清水处理对照。每个处理至少调查30 个植株用来统计病情指数。在接菌20天后把主茎茎秆剖开进行菌丝含量的观察。同时取处理和对照的叶片进行总RNA的提取并反转录，利用qRT-PCR 方法进行叶片中黄萎病菌生物量的测定，所用引物如下：

V-qPCR-F：AACAACAGTCCGATGGATAATTC(SEQ ID NO.9)；

V-qPCR-R：GTACCGGGCTCGAGATCG(SEQ ID NO.10)。

侵染后，CLCrV:GhTLP19植株出现明显的坏死、发黄和脱落叶片，而对照植株表现出的这种现象较轻(图2)。此外，VIGS植株茎秆中菌丝的积累量明显高于对照组(图2)。CLCrV:GhTLP19植株的病情指数(Disease index,DI)明显高于对照组(图2)。由此表明，沉默GhTLP19可以降低棉花对黄萎病菌的耐受性。

实施例3：GhTLP19转基因棉花响应黄萎病菌侵染

将实施例1克隆得到的GhTLP19的CDS进行过表达和干涉载体的构建。

质粒提取步骤参照全式金的[email protected] MiniPrep Kit并作稍微改进。

1)取已经扩摇好的5mL大肠杆菌，10000×g离心1min，倒掉上清液。

2)加入250μL溶液RB(使用前将RNaseA加入RB中，2-8℃保存)，悬浮振荡混匀。

3)加入250μL溶液LB，轻柔地上下颠倒5次，使菌体完全裂解(5 分钟以内)。

4)加入350μL溶液NB，轻柔地上下颠倒5次，当完全形成沉淀后，在室温条件下放置2min。

5)12000×g离心5min，仅将上清液吸到离心柱。12000×g快离1min，弃废液。

6)加入650μL溶液WB(已加80ml无水酒精并混匀)，12000×g快离1分钟，弃废液。

7)重复步骤6)。

8)12000×g离心2min，然后室温静置30min。

9)将离心柱放到干净的EP管中，向离心柱的中央滴入已被预热的 ddH₂O(pH>7.0)30μL，65℃室温条件下放置15min。

10)10000×g离心2min，洗脱质粒，放于-20℃冰箱保存。

过表达和干涉载体的构建：

过表达载体的构建：提取的pBI121双元载体用BamHI和SacI进行双酶切，使用过表达和干涉(干涉载体为全长干涉，即将目的基因的CDS序列反向插入过表达载体中)GhTLP19基因带接头的引物从测序正确的T载上进行克隆。将酶切和克隆基因的产物使用[email protected] Gel Extraction Kit进行切胶回收，具体步骤如下：

1)将目的DNA从琼脂糖凝胶中进行切取，转移至离心管中并称重，按照100mg凝胶等于100μL计算。

2)向EP管中加入GSB(凝胶体积的3倍)，在55℃水浴锅中，每间断2分钟颠倒混合一次。

3)待已完全融化的凝胶溶液温度降到与室内温度一样时，转移至离心柱后并室温放置1min，离心机10000×g快离1min，倒掉废液。

4)离心柱中加入WB溶液650μL，离心机10000×g快离1min，倒掉废液。

5)离心机10000×g快离2min。

6)将离心柱转移到另一个离心管中，打开离心柱盖并静置15min，向离心柱的中央滴加已经预热的ddH₂O(pH>7.0)30μL，室温条件下放置15 min。

7)10000×g离心2min，将所得的胶回收产物放在-20℃冰箱保存。

使用II One Step Cloning Kit将回收的酶切和PCR产物进行无缝克隆连接，体系如下：

使用移液枪轻轻混匀后，PCR仪37℃反应30min，降至4℃后转移至冰上。

然后将重组产物进行大肠杆菌转化，具体步骤如下：

1)在冰上解冻DH5α克隆感受态细胞。

2)将所得的所有重组产物全部加入到从冰箱中取出的半融化状态的感受态细胞中，手指轻轻弹动离心管壁，于冰上放置30min。

3)在42℃水浴锅中静置45sec，随后放在冰上2min。

4)加入500μL空LB液体培养基(1g蛋白胨、0.5g酵母粉和1g NaCl 至100mL ddH₂O中)，200rpm摇床37℃摇菌45min。

5)将所有的菌液用灭过菌的黄枪头在已经37℃预热的含有卡那霉素抗性的固体LB(液体LB另加15g/L Agar)平板上轻轻涂匀，晾干。

6)37℃培养箱中倒置过夜培养。

7)第二天用白枪头挑选长势良好的单斑至300μL含有相应抗性的LB 培养液中，37℃摇床摇5h。

8)用康为世纪公司的酶进行PCR鉴定阳性单克隆，上游使用35S通用引物，下游为目的基因下游引物，具体PCR程序参照说明书。

9)凝胶电泳结果有条带的单克隆送到生工生物技术有限公司测序。将 OE-GhTLP19和Anti-GhTLP19性菌液保存在-80℃冰箱的甘油中。

转化农杆菌：将提取好的OE-GhTLP19和Anti-GhTLP19载体质粒利用冻融法转化根癌农杆菌LBA4404感受态细胞，具体转化过程如下：

1)将500ng质粒加入到GV3101感受态细胞中，并手指轻弹EP管壁，然后分别在冰上、液氮、37℃水浴和冰上中各5min；

2)加入700μL空的LB培养液，28℃摇床2.5h；

3)将100μL菌液用黄枪头在同时含有卡那霉素(50mg/L)和利福平 (50mg/L)的LB平板上涂匀，28℃培养箱倒置2天；

4)将菌落PCR得到的阳性克隆转移至含有相应抗性的50mL LB培养液中，于28℃摇床。

将活化好的农杆菌参照张朝军博士论文进行棉花的遗传转化，具体如下：

1)将阳性克隆转化到农杆菌感受态菌株LBA4404，农杆菌扩大培养，离心弃上清，加入侵染液(MGL和AS)，震荡使菌液悬浮，28℃摇床，200 rpm/min活化至少30min；

2)将受体棉花(CCRI24)种子用升汞杀菌，无菌水清洗后放入无菌苗培养基中，30℃培养6d；

3)将受体小苗下胚轴切成小茎段，用活化后的农杆菌侵染，并吹干；

4)将下胚轴平铺在放有滤纸的共培养培养基中，20℃暗培养1～2d；

5)下胚轴转入到2,4-D培养基中，放入光照培养室，20-30d左右继代一次；

6)愈伤组织长成米粒状颗粒，转入分化培养基中，进一步分化成胚状体；

7)将分化出的小苗继代到生根培养基中，直至长成生根良好健康的小苗；

8)将苗子转到水中，进行炼苗，一周左右后，种到温室。

将获得的转基因阳性株进行检测，所用引物如下：

35S：GACGCACAATCCCACTATCC(SEQ ID NO.11)；

jGhTLP19oe-R：AAAAGCGACCAGACCAACCA(SEQ ID NO.12)；

jGhTLP19anti-R：GGAATATTGCTGCACTGGCG(SEQ ID NO.13)。

转基因植株检测反应体系

PCR反应程序：

获得的转基因阳性植株内GhTLP19的表达量进行qRT-PCR检测，荧光定量过程参照实施例1。

随后将获得的阳性株进行和空载体对照植株进行黄萎病菌侵染，具体过程参照实施例1。随后参照实施例2进行剖杆实验和病情指数调查。结果显示过表达植株出现坏死、发黄和脱落叶片的程度比对照弱，而干涉植株的坏死、发黄和脱落叶片的程度比对照严重(图3)。将其茎秆从中间剖开观察茎秆中黄萎病菌菌丝含量，结果显示干涉植株茎秆中的菌丝含量最高，褐化最严重；过表达植株茎秆中的菌丝含量最低，褐化程度最轻(图3)。病情指数统计结果显示过表达植株的发病率低于对照组，而干涉植株的发病率显著性高于对照组。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院棉花研究所

<120> GhTLP19蛋白在调控棉花抗黄萎病菌中的应用及调控棉花抗黄萎病菌的方法

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 244

<212> PRT

<213> 棉花

<400> 1

Met Ala Ile Ser Phe Gly Ile Tyr Leu Leu Phe Leu Leu Asn Phe Phe

1 5 10 15

Ser Phe Gly Ala Ile Phe Ser Ser Ala Thr Ser Phe Thr Leu Glu Asn

20 25 30

Arg Cys Ser Phe Thr Val Trp Pro Gly Ser Leu Thr Ala Asn Gly Pro

35 40 45

Pro Leu Gly Asp Gly Gly Phe Ala Leu Ala Pro Gly Ser Ser Ser Arg

50 55 60

Leu His Pro Pro Pro Gly Trp Ser Gly Arg Phe Trp Gly Arg Thr Gly

65 70 75 80

Cys Asn Phe Asp Asn Ser Gly Ser Gly Lys Cys Val Thr Gly Asp Cys

85 90 95

Gly Gly Ala Leu Lys Cys Asn Gly Gly Gly Ile Pro Pro Val Ser Leu

100 105 110

Ile Glu Phe Thr Leu Asn Gly His Asp Asn Lys Asp Phe Tyr Asp Ile

115 120 125

Ser Leu Val Asp Gly Tyr Asn Met Ala Val Ala Val Lys Ala Val Gly

130 135 140

Gly Thr Gly Thr Cys Gln Tyr Ala Gly Cys Val Asn Asp Leu Asn Thr

145 150 155 160

Asn Cys Pro Ala Glu Leu Gln Met Met Asp Ser Gly Ser Val Val Ala

165 170 175

Cys Lys Ser Ala Cys Ala Ala Phe Asn Thr Pro Glu Tyr Cys Cys Thr

180 185 190

Gly Ala His Gly Thr Pro Gln Thr Cys Ser Pro Thr Met Tyr Ser Gln

195 200 205

Leu Phe Lys Asn Ala Cys Pro Thr Ala Tyr Ser Tyr Ala Tyr Asp Asp

210 215 220

Ala Thr Ser Thr Met Thr Cys Thr Gly Ala Asp Tyr Leu Ile Thr Phe

225 230 235 240

Cys Pro Thr Ser

<210> 2

<211> 735

<212> DNA

<213> 棉花

<400> 2

atggcgattt cctttgggat ttatcttctt tttctactga atttcttctc atttggggcg 60

atattttctt cagcaacaag ctttacactc gaaaatcgtt gtagtttcac agtatggcct 120

ggttccctga ccgcaaatgg ccctcccctt ggtgatggtg gttttgcatt ggctcctggt 180

tcatcatccc ggctccaccc tccacctggt tggtctggtc gcttttgggg tcgaactggc 240

tgcaatttcg acaactctgg ctcaggaaaa tgtgtaaccg gtgactgtgg tggcgcgtta 300

aagtgcaacg gcggtggcat cccacccgtt tccctgatcg agttcaccct taatggacat 360

gacaataagg acttttatga cattagtctc gtagatggtt acaacatggc cgtagcagtc 420

aaggcagttg gtggtacagg gacttgccaa tatgcaggtt gcgtcaatga cctcaacaca 480

aattgccccg ccgagttaca gatgatggac tcaggttctg tcgtcgcttg taaaagcgcc 540

tgtgctgcct tcaacacgcc ggaatattgc tgcactggcg cacatggtac gcctcagact 600

tgctcaccga caatgtactc acaattgttc aaaaatgcat gccctacggc ttacagttat 660

gcttacgatg acgccactag taccatgact tgcaccgggg cggattatct gatcacattt 720

tgtccaacca gctga 735

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcagtcaagg cagttggtgg ta 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atattccggc gtgttgaagg ca 22

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atggcgattt cctttggg 18

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttagctggtt ggacaaaatg tg 22

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

caaaatggca tgcctgcaga ctagtttgac tgctacggcc atgtt 45

<210> 8

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gaattcacta gacctagggg cgcgcccagt atggcctggt tccctg 46

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aacaacagtc cgatggataa ttc 23

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gtaccgggct cgagatcg 18

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gacgcacaat cccactatcc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

aaaagcgacc agaccaacca 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ggaatattgc tgcactggcg 20