一种便携式培养细胞的外泌体制备、富集、纯化收集系统
阅读说明：本技术 一种便携式培养细胞的外泌体制备、富集、纯化收集系统 (Portable exosome preparation, enrichment, purification collection system of cultured cells ) 是由 崔大祥 彭家伟 梁辉 周诚 于 2021-08-09 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种便携式培养细胞的外泌体制备、富集、纯化收集系统,包括生产系统、浓缩收集系统、循环流体系统。富集收集装置中超滤膜与超滤膜管形成锐角夹角,优选范围为30-5°,设置夹角,使得平行流过浓缩外管的包含外泌体的流体培养基经过超滤膜时,尽可能避免流体培养基滤液垂直经过超滤膜形成“死滤”,不仅起到超滤作用,同时也会冲带走超滤膜表面截留的外泌体,防止后续截留的外泌体在超滤膜上积累造成滤孔的堵塞,起到模拟切向流过滤效果。使后续生产容器中培养细胞产生的外泌体源源不断的在富集装置中富集、纯化,获得高浓度、高纯度的外泌体。并且各组成设备均可灵活拆卸定期更换,防止污染以及长期使用造成的培养物黏附堵塞。(The invention relates to a portable exosome preparation, enrichment, purification and collection system for cultured cells, which comprises a production system, a concentration and collection system and a circulating fluid system. Ultrafiltration membrane and ultrafiltration membrane tube form acute angle contained angle among the enrichment collection device, preferred scope is 30-5, set up the contained angle, when making the fluid medium that contains the exosome of concentrated outer tube of concurrent flow through the ultrafiltration membrane, avoid fluid medium filtrating perpendicular through the ultrafiltration membrane formation "dying to strain" as far as possible, not only play the ultrafiltration effect, also can wash away the exosome of intercepting on the ultrafiltration membrane surface simultaneously, prevent that the subsequent exosome of intercepting from accumulating on the ultrafiltration membrane and causing the jam of filtration pore, play the simulation tangential flow and strain the effect. The exosome source generated by culturing cells in the subsequent production container is continuously enriched and purified in the enrichment device, and the exosome with high concentration and high purity is obtained. And all the components can be flexibly disassembled and replaced regularly, so that the culture is prevented from being adhered and blocked due to pollution and long-term use.)
技术领域
本发明涉及一种便携式培养细胞的外泌体制备、富集、纯化收集系统。
技术背景
外泌体（EVs）是由脂质双分子层包绕形成的粒径在30-150 nm球状膜性囊泡，是细胞分泌的一种亚细胞结构，在细胞间信息传递过程中起到重要作用。目前收集外泌体的方法主要有超速离心法、超滤法、试剂盒提取等方法。而超速离心法受制于超速离心机价格昂贵，且耗时较长，难以普及应用。试剂盒提取法往往利用化学试剂或修饰的微米纳米材料捕获外泌体，进行纯化，因此会对外泌体表面结构造成一定的破坏。而超滤法是利用截留分子量或粒径尺寸不同，将较大尺寸的颗粒物进行截留，而小粒径或小分子量物质通过，达到提取目的。目前提取EVs的商业化超滤有超滤切向流过滤和中空纤维管两种形式，但依赖进口、价格昂贵且通量小，难以适用于实际规模化生产。
发明内容
针对以上不足，本发明目的在于提供一种便携式培养细胞的外泌体制备、富集、纯化收集系统，以适用于规模化生产。
本发明目的提供以下方案实现：一种便携式培养细胞的外泌体制备、富集、纯化收集系统，包括生产容器和收集容器，包括生产系统、富集收集系统和循环流体系统，其中，
所述的生产系统至少包括一个生产容器、搅拌器，生产容器内填充有培养基、3D培养所需的微载体及培养细胞，所述的生产容器设有填料口、出液口和回液口；所述的生产细胞黏附生长在微载体表面，在搅拌器搅拌作用下，使得微载体及表面生长的培养细胞悬浮于湍流培养基中，且湍流的刺激促进外泌体EVs的大量分泌；
所述的富集收集系统由可拆卸的超滤膜管、设在超滤膜管内沿流体流动方向与超滤膜管壁行成夹角设置的超滤膜、与超滤膜管密封连接的浓缩外管一、二和收集容器组成，富集收集系统中各组成均可灵活拆卸定期更换，防止污染以及长期使用造成的培养物黏附堵塞，其中，所述的超滤膜管通过两侧的螺旋接口一、二与浓缩外管一、二无缝连接，形成中空的浓缩容器，通过富集收集系统两侧连接口经流体管接入循环流体系统中；收集容器连接在进液方向的浓缩外管一的底部；
所述的循环流体系统包括流体管、滤膜、管件连头、蠕动泵和三通阀等，可根据实际所需，流体管通过连接器密封连接至所需的长度；在生产系统中产生的EVs经过滤膜过滤后，随培养基自生产容器的出液口进入循环流体系统，而微载体和培养细胞被阻截在生产容器中继续生产EVs，由蠕动泵将培养基和生产的EVs通过生产容器的出液口流向富集收集系统，同时，富集收集系统中的培养基经回液口重新回流到生产容器内部，最终形成EVs被富集、培养基可循环利用的动态循环流体系统。
本发明提供的便携式培养细胞的外泌体制备、富集、纯化收集系统装置，可成功应用于培养细胞EVs的富集、纯化收集。
在上述方案基础上，所述生产系中的生产容器容积为50 mL-60 L，可以是发酵罐、或实验室常见的玻璃培养容器等。
在上述方案基础上，所述的超滤膜孔径为30 -200 nm，以满足富集收集系统中的培养基自由通过而截留流体中的EVs，实现EVs的动态富集。
进一步的，所述的超滤膜与超滤膜管形成的夹角优选范围为30-5°，一定的夹角，使得平行流过浓缩外管的包含富集EVs的流体培养基经过超滤膜时，尽可能避免流体培养基滤液垂直经过超滤膜形成“死滤”，不仅起到超滤作用，同时也会冲带走超滤膜表面截留的EVs，防止后续截留的EVs在超滤膜上积累造成滤孔堵塞，起到模拟切向流过滤效果，使得后续生产容器中培养细胞产生的EVs源源不断的在富集收集系统中富集，可用于包括3D培养细胞在内的任何形式培养细胞产生EVs的富集收集。
所述富集收集系统不仅适用于3D培养细胞产生EVs的收集，也适用于任何形式培养细胞产生的EVs的富集收集。
较优的，设在出液口处的滤膜选择滤膜孔隙大小为0.22μm-0.45μm，实际中可根据微载体和培养细胞的粒径选择不同孔隙大小的滤膜。
在上述方案基础上，所述搅拌器为可更换式，以根据需要调节其尺寸、搅拌桨类型、转速来满足不同类型培养细胞悬浮培养产生EVs所需最佳生长环境。
本发明提供了一种所述的便携式培养细胞的外泌体制备、富集、纯化收集系统的纯化收集方法，将富集收集系统中得到的富集的含EVs的培养基自回液口重新回流到生产容器内部时， 将生产系统中的培养基换成PBS缓冲液， 使得富集的含EVs的培养基不断被稀释纯化，直至培养基被完全替换为止，打开收集容器，收集到纯化的。
本发明也提供了一种所述的便携式培养细胞的外泌体制备、富集、纯化收集系统的培养基的更换方法，在循环流体系统中，先将三通阀中的进口和垂直出口打开，三通阀的水平出口关闭，自生产容器的填料口加入新的培养基，从三通阀垂直出口排出旧培养基，实现新旧培养基的便捷更换。
本发明生产系统中，所述的培养细胞包含但不局限于脐带间充质干细胞贴壁黏附性生长细胞。
本发明生产系统中，所述微载体为满足细胞黏附性生长特性的无细胞毒性的微米材料，粒径为20-200μm。
有益效果
相对于目前超速离心法、切向流过滤和中空纤维管超滤法、试剂盒提取等方法。本发明超滤富集外泌体时，避免流体培养基滤液垂直经过超滤膜形成“死滤”，不仅起到超滤作用，同时也会冲带走超滤膜表面截留的外泌体，防止后续截留的外泌体在超滤膜上积累造成滤孔的堵塞，起到模拟切向流过滤效果。适用于培养细胞的外泌体边产生富集、纯化收集，获得高浓度、高纯度的外泌体。并且各组成设备均可灵活拆卸定期更换，防止污染以及长期使用造成的培养物黏附堵塞。
综上所述，该系统装置适用于可持续、成本低、高浓度、高纯度等生产外泌体特点，装置具备显著的经济和社会效益。
附图说明
图1为发明本系统的结构示意图；
图2为超滤富集收集装置结构示意图；
图3为本发明系统装置提取的外泌体透射电子显微镜图；
生产系统中，
22——生产容器；21——电机；
3——培养细胞；4——微载体；5——外泌体（EVs）；
6——填料口；7——搅拌器；
8——出液口；9——滤膜；24——生产系统的回液口；23——培养基；
循环液体系统中，
1——流体管；10——蠕动泵；11、12、13——三通阀；14——管道连接器；
富集系统中，
2——收集容器；15——单向阀；
16——富集系统的进口；
17——螺旋接口进液口；18——螺旋接口出液口；19——超滤膜；
20——富集系统的出口；
25——超滤膜管；
26——富集系统中培养基；27——富集的EVs；
28、29——浓缩外管一、二。
具体实施方式
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案:
实施例1
一种便携式培养细胞的外泌体制备、富集、纯化收集系统，包括生产系统、富集收集系统和循环流体系统，包括生产容器22，其中，
所述的生产系统包括一个生产容器22、搅拌器7，生产容器22内填充有培养基23、3D培养所需的微载体4及培养细胞3，所述的生产容器22设有填料口6、出液口8和回液口24；所述的生产细胞3黏附生长在微载体4表面，在搅拌器7搅拌作用下，使得微载体4及表面生长的培养细胞3浮于湍流培养基中，且湍流的刺激促进外泌体EVs5的大量分泌；
所述的富集收集系统由可拆卸的超滤膜管25、设在超滤膜管25内沿流体流动方向与超滤膜管壁行成夹角设置的超滤膜19、和与超滤膜管25密封连接的浓缩外管一、二28、29和收集容器2组成，通过两侧连接的进出接口16、20经流体管1接入循环系统中，所述的超滤膜管25通过两侧的螺旋接口一、二17、18与浓缩外管一、二28、29无缝连接，形成中空的浓缩容器；收集容器2连接在富集系统的进口16和螺旋接口进液口17段的浓缩外管一28的底部；
所述的循环流体系统包括流体管1、滤膜9、管件连头14、蠕动泵10和三通阀构成的循环系统，产生系统生产的EVs 5经过滤膜9过滤后，随培养基23自生产容器的出液口8进入循环流体系统，而微载体4和培养细胞3被阻截在生产容器22中继续生产EVs 5，由蠕动泵10将培养基23和生产的EVs 5通过出液口8向富集收集系统，同时，富集收集系统中的培养基26经回液口24重新回流到生产容器22内部，最终形成EVs被富集、培养基可循环利用的动态循环流体系统。
本发明中，富集收集装置中超滤膜19与超滤膜管25的截面形成一定的夹角，优选范围为30-5°，一定的夹角，使得平行流过浓缩外管的包含外泌体的流体培养基26经过超滤膜19时，尽可能避免流体培养基26滤液垂直经过超滤膜形成“死滤”，不仅起到超滤作用，同时也会冲带走超滤膜19表面截留的富集的EVs 27，防止后续截留的EVs在超滤膜19上积累造成滤孔的堵塞，起到模拟切向流过滤效果，使得后续生产容器22中培养细胞3产生的EVs5源源不断的在富集系统装置中富集， 随后将收集到的包含EVs的培养基从填料口6加入生产容器22中。
本发明各组件拆装方便，可根据使用要求进行拆装组合。
应用例1
采用上述本发明实施例便携式培养细胞的外泌体制备、富集、纯化收集系统富集、纯化EVs，其中，选择培养细胞为间充质干细胞(MSC)；微载体4 为Cytodex 1型，按下述步骤：
第一步：在生产容器22内部，利用3D培养技术将一定浓度的培养细胞3接种到微载体4表面进行培养，保持搅拌器7为40 rpm搅拌速率，连续培养5d，其中，培养基23如DMEM培养基最大体积由培养细胞3和容器体积决定，优选为50 mL-30 L。
第二步，如图1所示，打开三通阀进液口11和出液口12、关闭三通阀垂直出口13，在蠕动泵10和滤膜9的作用下使得培养基23和EVs 5自出液口8流向富集收集系统，而微载体4和培养细胞3被阻截在生产容器22中继续生产EVs，同时，富集系统中培养基26经回液口24重新回流到生产容器22内部，打开收集容器2，收集富集系统中富集的EVs 27 。
第三步，准备另一相同的培养装置， 将上步收集到的包括EVs的富集系统中培养基从填料口6加入生产容器22中，不同点在于：将培养基23换成PBS缓冲液， 使得富集的含EVs的培养基不断被稀释纯化，直至培养基被完全替换为止，此时打开收集容器2，收集到只含PBS液体的EVs。本发明系统装置提取的外泌体透射电子显微镜图如图3所示，本系统装置富集、纯化所得EVs大小、分散性较好，粒径在平均粒径33 nm左右。
应用例2
采用本发明系统得到纯化EVs，按下述步骤：
第一步：在生产容器22内部，利用3D培养技术将一定浓度的培养细胞3如间充质干细胞(MSC)接种到微载体4Cytodex 1型表面进行培养，保持搅拌器7为0 rpm进行3D静止培养，连续培养5d，其中，容器培养基23如DMEM培养基最大体积由培养细胞3和容器体积决定，优选为50 mL-30 L。
第二步，打开三通阀进液口11和水平出液口、关闭三通阀垂直出液口13，在蠕动泵10和滤膜9的作用下使得培养基23和EVs 5通过出液口8流向富集收集系统，而微载体4和培养细胞3被阻截在生产容器22中继续生产EVs，同时培养基26经回液口24重新回流到生产容器22内部，打开收集容器2，收集液体培养基中的富集的EVs 27。
第三步，准备另一相同的培养装置， 将上步收集到的包含EVs的培养基从填料口6加入生产容器22中，不同点在于将培养基23换成PBS缓冲液， 使得富集的含EVs的培养基不断被稀释纯化，直至培养基被完全替换为止，此时打开收集容器2，收集到只含PBS液体的EVs。即可得到收集到高浓度、高纯度的EVs。
本发明各组成设备均可灵活拆卸定期更换，防止污染以及长期使用造成的培养物黏附堵塞。
应用例3
本应用例与应用例1的区别在于，将相同浓度MSC接种到商业化的培养皿中进行2D细胞贴壁培养5 d，然后收集上层培养基，再由填料口6投入到本发明系统装置中，不断用PBS进行对培养基中的EVs进行富集、纯化、收集。
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