一种喹哪啶半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 一种喹哪啶半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法与应用 (Quinaldine hapten, artificial antigen and antibody as well as preparation method and application thereof ) 是由 罗林 梁洪玮 徐振林 孙远明 沈玉栋 肖治理 王弘 杨金易 雷红涛 于 2021-08-19 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种喹哪啶半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法与应用,本发明制备得到了一种半抗原1,利用半抗原1制备得到人工抗原1；以4-氨基喹哪啶为半抗原2,应用半抗原2偶联载体蛋白得到人工抗原2,并进一步制备得到用于检测喹哪啶的特异性抗体,应用人工抗原1作为包被原,该抗体对喹哪啶具有良好的灵敏度和特异性,半抑制浓度为1.78μg/mL,最低检测限为0.19μg/mL,对常见鱼类麻醉剂的交叉反应率均低于1.32％,建立了喹哪啶的免疫分析方法,实现了快速准确检测鱼类麻醉剂中喹哪啶的目的。(The invention provides a quinaldine hapten, an artificial antigen and an antibody, and a preparation method and application thereof, wherein the hapten 1 is prepared, and the artificial antigen 1 is prepared by utilizing the hapten 1; 4-aminoquinaldine is used as hapten 2, hapten 2 is used for coupling carrier protein to obtain artificial antigen 2, and a specific antibody for detecting quinaldine is further prepared, the artificial antigen 1 is used as a coating antigen, the antibody has good sensitivity and specificity to the quinaldine, the half inhibition concentration is 1.78 mu g/mL, the minimum detection limit is 0.19 mu g/mL, the cross reaction rate to common fish anesthetic is lower than 1.32%, an immunoassay method of the quinaldine is established, and the aim of quickly and accurately detecting the quinaldine in the fish anesthetic is achieved.)
技术领域
本发明涉及食品安全检测技术领域，更具体地，涉及一种喹哪啶半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法与应用。
背景技术
喹哪啶，是一种无色油状液体的喹啉类化合物，又称二甲基喹啉。它具有抗菌和解热特性，被广泛用作母体化合物来制备药物，尤其抗疟疾的药物，也用于杀菌剂，杀生物剂。喹哪啶可用于对鱼短时间麻醉操作，有助于鱼类运输。
但是若从食物中摄取过量的喹哪啶，会严重威胁人类健康。我国在渔用麻醉剂的批准使用和管理上还没有明确规定，为了防止在水产品上滥用喹哪啶，建立水产品中喹哪啶麻醉剂的检测方法迫在眉睫。
目前，喹哪啶的检测方法较少，主要有紫外分光光度法(Hunn J，Allen J.GenPharmacol-Vasc S，1975，6(1):15)、LC-MS/MS法(郑向华,孙婷,陈燕,林建忠,徐敦明,林立毅.固相萃取-液相色谱串联质谱法同时测定水产品中3种鱼用麻醉剂残留量[J].食品科技,2020,45(04):333-337.)和高效液相检测法(徐闪浪,黄和,高平,陈日檬,曾丹丹,陈营寿.高效液相色谱荧光法测定水产品中喹哪啶麻醉剂残留量[J].分析试验室,2020,39(09):1035-1039.)等。这些方法的检出限主要在0.2～15μg/kg，紫外分光光度法虽然操作简单，但是其灵敏度较低、抗干扰不足，难以满足水产品中喹哪啶痕量分析要求；LC-MS/MS法灵敏度高，定量准确，但是仪器设备要昂贵，普及率低，难以在基层一线检测中推广使用，不适宜进行大批量样品现场的快速筛查，因此，需发明一种针对喹哪啶的快速、简便的检测方法。而且，目前尚无可用于免疫检测的喹哪啶半抗原、抗原和抗体的相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术中喹哪啶检测方法的缺陷和不足，提供一种喹哪啶半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法与应用。
本发明的目的在于提供一种喹哪啶半抗原。
本发明的目的还在于提供喹哪啶半抗原在制备喹哪啶人工抗原中的应用。
本发明的目的还在于提供一种喹哪啶人工抗原：人工抗原1或人工抗原2。
本发明的目的还在于提供所述喹哪啶半抗原和/或人工抗原在制备喹哪啶人工抗体中的应用。
本发明的目的还在于提供一种喹哪啶的人工抗原组合。
本发明的目的还在于提供一种喹哪啶抗体。
本发明的目的还在于提供一种检测喹哪啶的试剂盒。
本发明的目的还在于提供一种检测喹哪啶的免疫分析方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种喹哪啶半抗原1，所述半抗原1的结构式如式(I)所示，
所述半抗原1采用系统命名法命名为2-甲基喹啉-4-氨基丁酸。
本发明所述半抗原1的制备方法，包括如下步骤：
将4-氨基喹哪啶和4-溴丁酸乙酯溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入K2CO370℃搅拌回流反应过夜，用乙酸乙酯萃取后干燥，加入氢氧化锂和一级水进行水解，再用乙酸乙酯萃取，取水相调酸后用正丁醇萃取干燥得喹哪啶半抗原。
优选地，所述4-氨基喹哪啶：4-溴丁酸乙酯：K2CO3的摩尔比＝1～2：2～3：1～2。
进一步优选地，所述4-氨基喹哪啶：4-溴丁酸乙酯：K2CO3的摩尔比＝1：2：1.45。
优选地，所述4-氨基喹哪啶：氢氧化锂的摩尔比：一级水＝1～2：3～4：50～60。
进一步优选地，所述4-氨基喹哪啶：氢氧化锂的摩尔比：一级水＝1：3.81：55.55。
优选地，所述调酸是将pH调至4～5。
进一步优选地，所述调酸是将pH调至5。
所述半抗原1在制备喹哪啶人工抗原中的应用也在本发明的保护范围之内。
4-氨基喹哪啶作为半抗原2在制备喹哪啶人工抗原中的应用。已知，4-氨基喹哪啶结构式如式(II)所示，本发明研究表明可利用4-氨基喹哪啶作为半抗原制备喹哪啶人工抗原；
一种喹哪啶人工抗原，包括人工抗原1或人工抗原2，人工抗原1的结构式如式(III)所示，
人工抗原2的结构式如式(IV)所示，
优选地，所述载体蛋白(protein)为牛血清白蛋白(BSA)、乳铁蛋白(LF)或鸡卵清白蛋白(OVA)。
本发明所述人工抗原1的制备方法，利用半抗原1，通过活泼酯法偶联载体蛋白。
作为上述方法的一个
具体实施方式
，人工抗原1的制备方法，包括如下步骤：
将载体蛋白溶于CBS中得载体蛋白溶液；将半抗原1溶于MES水溶液中，加入EDC和NHS室温避光搅拌反应，得半抗原1活化液；冰浴中将载体蛋白溶液加入半抗原1活化液中，搅拌均匀，室温避光偶联过夜；偶联混合物低温下透析数天，得到人工抗原1。
优选地，所述人工抗原1的制备方法，包括如下步骤：
(1)将载体蛋白溶解于pH＝9.6的CBS中，得载体蛋白溶液；
(2)将半抗原1溶解于0.1M MES水溶液中，得半抗原1溶液；
(3)将EDC和NHS加入到步骤(2)的半抗原1溶液中，室温避光反应4h，得活泼酯；所述EDC和NHS与半抗原1的摩尔比为1～2：1～2：1；
(4)将步骤(3)活泼酯滴加到步骤(1)的载体蛋白溶液中，室温避光偶联过夜；偶联混合物于4℃、PBS缓冲液透析3天，得到人工抗原1；所述半抗原1与载体蛋白的摩尔比为30～300：1。
进一步优选地，所述EDC和NHS与半抗原1的摩尔比为1.5：1.5：1。
进一步优选地，所述半抗原1与载体蛋白的摩尔比为300：1。
本发明所述人工抗原2的制备方法，利用4-氨基喹哪啶即半抗原2，通过戊二醛法偶联载体蛋白。
作为上述方法的一个具体实施方式，人工抗原2的制备方法，包括如下步骤：
将载体蛋白溶于PBS缓冲液中，然后加入戊二醛溶液，室温搅拌反应，用PBS缓冲液透析数小时得蛋白-戊二醛交联液；将半抗原2溶于甲醇中，然后加入到蛋白-戊二醛交联液中，低温搅拌反应过夜，反应结束后加入硼氢化钠水溶液，室温还原反应2h；偶联混合物低温下PBS缓冲液透析数天，得到人工抗原2。
优选地，所述人工抗原2的制备方法，包括如下步骤：
(1)将载体蛋白溶解于pH＝7.4的PBS缓冲液中，得载体蛋白溶液；
(2)将25％戊二醛溶液加入到步骤(1)的载体蛋白溶解液中；所述戊二醛溶液与载体蛋白溶液的体积比为2～10：1000，室温下搅拌反应4h，反应液用PBS缓冲液透析3次，一次3h，得蛋白-戊二醛交联液；
(3)将半抗原2溶于甲醇中，然后加入到步骤(2)的蛋白-戊二醛交联液中，4℃搅拌反应过夜；所述半抗原2与载体蛋白的摩尔比为30～300：1。
(4)取1mg/mL硼氢化钠水溶液，滴加到步骤(3)的反应液中；所述硼氢化钠与载体蛋白的质量比为1：100，室温下还原反应2h；将反应后的偶联混合物于4℃下，用PBS缓冲液透析3天，得到人工抗原2。
优选地，所述戊二醛溶液与载体蛋白溶液的体积比为3.75：1000
优选地，所述半抗原2与载体蛋白的摩尔比为100：1。
所述人工抗原1和/或人工抗原2在制备喹哪啶抗体中的应用也在本发明的保护范围之内。
优选地，所述人工抗原2在制备喹哪啶抗体中的应用。
一种喹哪啶人工抗原组合，包括人工抗原1和人工抗原2。
优选地，所述人工抗原组合包括作为免疫原的人工抗原2和作为包被原的人工抗原1。
进一步优选地，作为免疫原的人工抗原2是以载体蛋白为乳铁蛋白(LF)的人工抗原2(半抗原2-LF)，作为包被原的人工抗原1是以载体蛋白为鸡卵清白蛋白(OVA)的人工抗原1(半抗原1-OVA)。
所述人工抗原组合在制备喹哪啶抗体和/或检测喹哪啶中的应用也在本发明的保护范围之内。
优选地，是在检测喹哪啶的试剂盒或免疫分析方法中的应用。
一种喹哪啶抗体，利用人工抗原1或人工抗原2免疫动物制备得到。
优选地，所述抗体是利用人工抗原2免疫动物制备得到。
进一步优选地，所述抗体是利用以载体蛋白为乳铁蛋白(LF)的人工抗原2(半抗原2-LF)免疫动物制备得到。
优选地，所述抗体为多克隆抗体。
一种喹哪啶抗体的制备方法，利用人工抗原2免疫实验动物，使其机体产生特异地针对喹哪啶的抗体，所述抗体是能与喹哪啶发生特异性免疫反应的免疫球蛋白G。
作为上述方法的一个具体实施方式，喹哪啶抗体的制备方法包括如下步骤：
(1)利用人工抗原2配合弗式佐剂免疫实验动物；
(2)首次免疫时，人工抗原2用等体积的弗式完全佐剂乳化后免疫6-7周龄的Balb/c小鼠，乳化后每只小鼠的免疫剂量为0.1mL/只；
(3)加强免疫时，用相同剂量的人工抗原2与等体积的弗式不完全佐剂乳化后免疫Balb/c小鼠；
(4)加强免疫四次后，心脏取血分离获得血清即鼠源多克隆抗体。
优选地，以载体蛋白为乳铁蛋白(LF)的人工抗原2(半抗原2-LF)免疫实验动物。
喹哪啶抗体在检测喹哪啶中的应用也在本发明的保护范围之内。
优选地，是喹哪啶抗体在检测喹哪啶试剂盒中的应用
一种检测喹哪啶的试剂盒，包括作为包被原的喹哪啶人工抗原和以喹哪啶人工抗原免疫动物制备得到的抗体。
优选地，所述试剂盒，包括作为包被原的人工抗原1和以人工抗原2免疫动物制备得到的抗体。
优选地，所述试剂盒包括作为包被原的以载体蛋白为鸡卵清白蛋白(OVA)人工抗原1和以载体蛋白为乳铁蛋白(LF)的人工抗原2免疫动物制备得到的抗体。
优选地，所述试剂盒包括作为包被原的喹哪啶人工抗原包被的酶标板、喹哪啶标准品、喹哪啶人工抗原免疫动物得到的抗体、酶标二抗工作液、显色液、终止液、浓缩稀释液和浓缩洗涤液。
进一步优选地，所述包被原为人工抗原1；所述抗体为人工抗原2免疫动物得到的抗体。
进一步优选地，所述包被原为以载体蛋白为鸡卵清白蛋白(OVA)人工抗原1；所述抗体为以载体蛋白为乳铁蛋白(LF)的人工抗原2免疫动物制备得到的抗体。
一种检测喹哪啶的免疫分析方法，以人工抗原1为包被原，以人工抗原2为免疫原免疫动物制备得到的抗体为检测抗体进行检测。
优选地，所述免疫分析方法，以载体蛋白为鸡卵清白蛋白(OVA)的人工抗原1(半抗原1-OVA)为包被原，以载体蛋白为乳铁蛋白(LF)的人工抗原2(半抗原2-LF)为免疫原免疫动物制备得到的抗体为检测抗体进行检测。
作为上述方法的具体实施方式，包括如下步骤：
(1)利用人工抗原2免疫动物制备多克隆抗体；
(2)将人工抗原1作为包被原包被在微孔板上，然后将步骤(1)制备得到多克隆抗体加入微孔板中；
(3)加入喹哪啶待测样品，采用竞争ELISA测定喹哪啶的含量。
优选地，所述人工抗原2的载体蛋白为乳铁蛋白(LF)，即半抗原2-LF。
优选地，所述人工抗原1的载体蛋白为鸡卵清白蛋白(OVA)，即半抗原1-OVA。
优选地，偶联鸡卵清白蛋白(OVA)的人工抗原1(半抗原1-OVA)包被浓度为0.5μg/mL，喹哪啶抗体稀释倍数为2000倍。
所述免疫分析方法包括但不局限于酶免疫分析、免疫层析、免疫传感、免疫胶体金等。
本发明所述半抗原1即喹哪啶半抗原1；4-氨基喹哪啶即为半抗原2；所述人工抗原1即喹哪啶人工抗原1；所述人工抗原2即喹哪啶半抗原人工抗原2；所述抗体即喹哪啶抗体。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明制备得到了喹哪啶半抗原1，应用半抗原1偶联载体蛋白得到人工抗原1；以4-氨基喹哪啶为半抗原2，应用半抗原2偶联载体蛋白得到人工抗原2，并进一步制备得到用于检测喹哪啶的特异性抗体，应用人工抗原1作为人工包被原，该抗体对喹哪啶具有良好的灵敏度和特异性，半抑制浓度为1.78μg/mL，最低检测限为0.19μg/mL，对常见鱼类麻醉剂的交叉反应率均低于1.32％，说明该抗体对喹哪啶具有较好的特异性，可有效的排除其他鱼类麻醉剂的干扰，为建立鱼类麻醉剂喹哪啶的免疫检测方法提供了核心试剂。利用本发明的喹哪啶半抗原、人工抗原、抗体实现了快速准确检测鱼类麻醉剂中喹哪啶的目的。
附图说明
图1为本申请实施例1半抗原1的质谱鉴定图。
图2为本申请实施例2半抗原1、人工抗原1(半抗原1-OVA)、OVA紫外扫描图。
图3为本申请实施例3半抗原2、人工抗原2(半抗原2-LF)、LF紫外扫描图。
图4为本申请实施例6以人工抗原2(半抗原2-LF)为免疫原所制备的抗体对喹哪啶的抑制曲线。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1喹哪啶半抗原1的合成与鉴定
1、喹哪啶半抗原1的合成
将1.58g4-氨基喹哪啶与3.86g 4-溴丁酸乙酯溶于10mL N,N-二甲基甲酰胺中，加入2gK2CO3在70℃下回流反应过夜，用乙酸乙酯萃取，取有机相，旋蒸干，得油状物质，加入1.6g氢氧化锂和10mL一级水，搅拌至变清为止，加入分液漏斗，用乙酸乙酯萃取，取水相，加入浓盐酸调酸pH5再用正丁醇萃取，取有机相，旋蒸干，得棕色粉末即为喹哪啶半抗原1。
2、喹哪啶半抗原1的鉴定
半抗原1的ESI-MS鉴定结果：如图1所示，从图1可知，该半抗原1的MS：C16H15NO4：285.10，ESI-[M-H]-:：283.90。
半抗原1的结构式如式(I)所示：
半抗原1采用系统命名法命名为2-甲基喹啉-4-氨基丁酸。
实施例2喹哪啶人工抗原1的合成和鉴定
1、喹哪啶人工抗原1的合成
将实施例1制备半抗原1，通过活泼酯法偶联乳铁蛋白(LF)和鸡卵清蛋白(OVA)；所述乳铁蛋白为免疫抗原的载体蛋白，鸡卵清蛋白为包被抗原的载体蛋白。
取32.53mg实施例1制得的半抗原1溶于0.1M 2-(N-玛琳)乙磺酸(MES)水溶液中，搅拌加入7.3mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和4.3mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温避光搅拌反应4h，得半抗原1活化液；取20mg乳铁蛋白(LF)和20mg OVA分别溶解于5mL PH9.6的碳酸盐缓冲溶液(CBS)中后，冰浴中搅拌加入半抗原1活化液，搅拌均匀后，室温避光偶联过夜；偶联混合物于4℃下用PBS缓冲溶液透析3天，每天更换透析液2次，得到的人工抗原1(半抗原1-LF、半抗原1-OVA)，人工抗原1以1mg/mL的浓度分装，冻存于-20℃冰箱。
2、喹哪啶人工抗原1的鉴定
对载体蛋白(LF、OVA)、半抗原1、半抗原1-LF及半抗原1-OVA进行紫外扫描测定(190～400nm)，测定结果如图2所示，从图2可以看出人工抗原1(半抗原1-LF、半抗原1-OVA)的紫外吸收峰与半抗原1的紫外吸收峰相比有明显的蓝移，且人工抗原1同时具备半抗原、LF、OVA的特征吸收峰，说明人工抗原1偶联成功。
实施例3喹哪啶人工抗原2的合成和鉴定
1、喹哪啶人工抗原2的合成
喹哪啶人工抗原2的合成方法，包括以下步骤：
以市售的4-氨基喹哪啶为半抗原2，通过戊二醛法偶联乳铁蛋白(LF)和鸡卵清白蛋白(OVA)。
取20mg乳铁蛋白(LF)和20mg鸡卵清白蛋白(OVA)分别溶解于4mL0.01MPBS缓冲溶液中后，搅拌加入15μL25％戊二醛溶液，室温搅拌反应4h，反应液于4℃下用PBS缓冲溶液透析3次，3h更换一次透析液，得蛋白-戊二醛交联液；取20mg半抗原2溶解于600μL 0.1M MES水溶液中后滴加到蛋白-戊二醛交联液中(LF中加入300μL，OVA中加入600μL)，搅拌均匀后，4℃偶联过夜；取200μL 1mg/mL硼氢化钠水溶液滴加到上述反应液中，室温搅拌还原2h；反应结束后，偶联混合物于4℃下、PBS缓冲溶液透析3天，每天更换透析液2次，得到人工抗原2(半抗原2-LF、半抗原2-OVA)，人工抗原2以1mg/mL的浓度分装，冻存于-20℃冰箱。
2、喹哪啶人工抗原2的鉴定
对载体蛋白(LF、OVA)、半抗原2、半抗原2-LF及半抗原2-OVA进行紫外扫描测定(190～400nm)，测定结果如图3所示，人工抗原2(半抗原2-LF、半抗原2-OVA)的紫外吸收峰与半抗原2的紫外吸收峰相比有明显的蓝移，且人工抗原2同时具备半抗原、LF、OVA的特征吸收峰，说明人工抗原2偶联成功。
实施例4抗体的制备及鉴定
1.抗体的制备
将实施例2制备好的偶联乳铁蛋白(LF)的人工抗原1(半抗原1-LF)和实施例3制备好的偶联乳铁蛋白(LF)的人工抗原2(半抗原2-LF)与等量的免疫佐剂(第一次免疫用弗氏完全佐剂，以后加强免疫均用弗氏不完全佐剂)乳化均匀，免疫小鼠。将6～7周大的Balb/C小鼠分别采用背部皮下、各部位皮下、腹腔和脚部多种注射方式免疫，2周后第二次免疫，以后每间隔2周加强免疫一次。第四次加强免疫后1周小鼠尾部取血，并利用间接竞争ELISA测定血清效价。当效价不再上升时，采用腹腔注射加强免疫。3天后心脏采血，水浴0.5～1h，4℃、10000离心15min，取上清即为抗血清，抗血清即为喹哪啶多克隆抗体。
2.抗体的鉴定
分别用实施例2制备好的偶联鸡卵清蛋白(OVA)的人工抗原1(半抗原1-OVA)和实施例3制备好的偶联鸡卵清蛋白(OVA)的人工抗原2(半抗原2-OVA)作为包被原，经ELISA检测人工抗原免疫Balb/C小鼠所获得的抗血清效价和抑制率。
以碳酸盐缓冲液(CBS，pH＝9.6)作为包被抗原的稀释液，磷酸盐缓冲液(PBS，0.01M，pH＝7.4)作为抗血清和标准品的稀释液，磷酸吐温缓冲液(PBST，0.01M)作为辣根过氧化酶标记的羊抗鼠溶液的稀释液。将包被原稀释成1μg/mL，加入96孔酶标板中，每孔100μL，4℃孵育过夜。用PBST洗板2次后，每孔加入120μL 5％牛血清蛋白，37℃水浴箱孵育3h，甩干后37℃烘干1h。将抗血清分别稀释500、1000、2000、4000、8000、16000、32000、64000倍，喹哪啶标准品配制成浓度为1μg/mL的溶液。将上述溶液按一般间接竞争ELISA方法在已包被好对应包被原的96孔板中加样，37℃水浴箱孵育40min，PBST洗板5次，加入5000倍稀释辣根过氧化酶标记的羊抗鼠溶液100μL，37℃水浴箱孵育30min，PBST洗板5次，加入100μL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物显色液，再次37℃水浴箱孵育10min，加入10％浓硫酸终止反应，在酶标仪上读取数据。间接竞争ELISA测定结果如表1所示。
选择在450nm波长处，吸光值(OD)为1～1.5的抗血清稀释倍数为抗血清的效价，抑制率＝100-(OD抑制/OD效价)*100
表1间接竞争ELISA测定结果
综合抗血清的效价及抑制率选择效果最优的人工抗原组合，从表1可知以效价为4000，抑制率为38.46％的组合最优，即以载体蛋白为乳铁蛋白的人工抗原2(半抗原2-LF)作为免疫原，以载体蛋白为鸡卵清蛋白的人工抗原1(半抗原1-OVA)作为包被原进行免疫检测的结果最优。
实施例5包被浓度与抗体稀释倍数
使用棋盘检测法检测包被浓度与喹哪啶多克隆抗体浓度对喹哪啶检测的影响。以实施例2制备的偶联OVA的人工抗原1(半抗原1-OVA)作为包被原，以实施例4偶联LF的人工抗原2(半抗原2-LF)制得的喹哪啶抗体(Ab-半抗原2-LF)为抗体。
以碳酸盐缓冲液(CBS，pH＝9.6)作为包被抗原的稀释液，磷酸盐缓冲液(PBS，0.01M，pH＝7.4)作为喹哪啶抗体和标准品的稀释液，磷酸吐温缓冲液(PBST，0.01M)作为辣根过氧化酶标记的羊抗鼠溶液的稀释液。将人工抗原1分别稀释成2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625μg/mL，加入96孔酶标板中，每孔100μL，4℃孵育过夜。用PBST洗板2次后，每孔加入120μL 5％牛血清蛋白，37℃水浴箱孵育3h，甩干后37℃烘干1h。将喹哪啶抗体分别稀释1000、2000、4000、8000、16000、32000、64000倍，喹哪啶标准品配制成浓度为1μg/mL的溶液；将上述溶液按一般间接竞争ELISA方法在已包被好对应包被原的96孔板中加样，各稀释倍数的喹哪啶抗体和1μg/mL的喹哪啶标准品各50μL，37℃水浴箱孵育40min，PBST洗板5次，加入5000倍稀释辣根过氧化酶标记的羊抗鼠溶液100μL，37℃水浴箱孵育30min，PBST洗板5次，加入100μL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物显色液，再次37℃水浴箱孵育10min，加入10％浓硫酸终止反应，通过酶标分析仪测定吸光值(OD)。
选择在450nm波长处，吸光值为1～1.5时的包被浓度及抗体稀释倍数计算抑制率，检测结果如表2所示。
表2棋盘检测法测定结果
OD值
包被浓度
抗体稀释倍数
抑制率
1.187
2μg/mL
1:16000
34.67％
1.265
1μg/mL
1:4000
37.86％
1.342
0.5μg/mL
1:2000
43.34％
由表2可知，抑制率最高对应的包被原浓度为0.5μg/mL，喹哪啶多克隆抗体稀释倍数为2000。
实施例6抗体的灵敏度
根据实施例5确定的包被浓度，利用不同稀释倍数的抗血清(喹哪啶抗体)绘制酶联免疫分析(ELISA)标准曲线。以实施例2制备的偶联OVA的人工抗原1(半抗原1-OVA)作为包被原，以实施例4偶联LF的人工抗原2(半抗原2-LF)制得的喹哪啶抗体(Ab-半抗原2-LF)为抗体。
以碳酸盐缓冲液(CBS，pH＝9.6)作为包被抗原的稀释液，磷酸盐缓冲液(PBS，0.01M，pH＝7.4)作为喹哪啶抗体和标准品的稀释液，磷酸吐温缓冲液(PBST，0.01M)作为辣根过氧化酶标记的羊抗鼠溶液的稀释液。将人工抗原1分别稀释成2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625μg/mL，加入96孔酶标板中，每孔100μL，4℃孵育过夜。用PBST洗板2次后，每孔加入120μL 5％牛血清蛋白，37℃水浴箱孵育3h，甩干后37℃烘干1h。将喹哪啶抗体分别稀释1000、2000、4000、8000、16000、32000、64000倍，喹哪啶标准品配制成浓度为1μg/mL的溶液；将上述溶液按一般间接竞争ELISA方法在已包被好对应包被原的96孔板中加样，各稀释倍数的喹哪啶抗体和1μg/mL的喹哪啶标准品各50μL，37℃水浴箱孵育40min，PBST洗板5次，加入5000倍稀释辣根过氧化酶标记的羊抗鼠溶液100μL，37℃水浴箱孵育30min，PBST洗板5次，加入100μL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物显色液，再次37℃水浴箱孵育10min，加入10％浓硫酸终止反应，通过酶标分析仪测定吸光值(OD)。
以OD值为纵坐标，相应的标准品浓度对数值为横坐标，应用origin8.5软件四参数对函数进行曲线拟合：y＝(A-D)/[1+(X/C)B]+D其中，A和D分别代表药物浓度最小和最大的吸光值(OD)，C为中点浓度，当标准品浓度等于C时的OD值为(A+D)/2，正处于曲线的拐点处，半数抑制量浓度为IC50，B表示曲线的陡峭程度，称斜率因子；以IC10为检测限，以IC20～IC80为检测范围。以喹哪啶为标准品建立ELISA的标准曲线，结果如图4，相关标准曲线参数见表3。
表3抗血清(喹哪啶抗体)对喹哪啶的检测参数
IC<sub>50</sub>(μg/mL)
线性范围(μg/mL)
最低检测限(μg/mL)
相关系数
喹哪啶抗体
1.78502
0.43938～7.25183
0.1935
0.99073
结合图4和表3可知，以喹哪啶为标准品建立的标准曲线具备典型的S型曲线，说明利用本发明的抗体进行检测灵敏度良好，IC50为1.78μg/mL；最低检测限0.19μg/mL。
实施例7抗体的特异性
使用实施例4偶联LF的人工抗原2(半抗原2-LF)制得的喹哪啶抗体(Ab-半抗原2-LF，抗血清)对喹哪啶及其常见鱼类麻醉剂进行酶联免疫分析(ELISA)，通过拟合得到其相应的IC50并计算交叉反应率，结果如表3。
表4抗血清(喹哪啶抗体)对喹哪啶和常见鱼类麻醉剂的交叉反应率
竞争药物
IC<sub>50</sub>(μg/mL)
交叉反应率
喹哪啶
1.78502
100％
丁香酚
135.064
1.32％
鱼安定
148.164
1.20％
苯佐卡因
无
＜0.01％
普鲁卡因
无
＜0.01％
由表4可知，喹哪啶抗体对喹哪啶的交叉反应率为100％，IC50值为1.78μg/mL，对丁香酚的交叉反应率为1.32％，对鱼安定的交叉反应率为1.2％，对其他鱼类麻醉剂的交叉反应率均低于0.01％，说明本申请的抗体可特异性识别喹哪啶，因此该方法可以检测鱼类麻醉剂中喹哪啶的含量。
实施例8检测喹哪啶的试剂盒
一种检测喹哪啶的试剂盒，包括作为包被原的实施例2制备的偶联OVA的人工抗原1(半抗原1-OVA)包被的96孔透明聚苯乙烯酶标板、喹哪啶标准品、实施例4偶联LF的人工抗原2(半抗原2-LF)制得的喹哪啶抗体(Ab-半抗原2-LF)、辣根过氧化酶标记的羊抗鼠溶液、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物显色液、10％浓硫酸终止液、浓缩稀释液和浓缩洗涤液。
提取、浓缩样品中的喹哪啶，然后将喹哪啶样品、喹哪啶标准品和喹哪啶抗体加入已包被好包被原的96孔透明聚苯乙烯酶标板中，37℃水浴箱孵育40min，PBST洗板5次，加入5000倍稀释辣根过氧化酶标记的羊抗鼠溶液100μL，37℃水浴箱孵育30min，PBST洗板5次，加入100μL 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物显色液，再次37℃水浴箱孵育10min，加入10％浓硫酸终止反应。通过对比样品待测液及喹哪啶标准品的吸光值大小，定量分析样品中的喹哪啶含量。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种多靶点酪氨酸激酶抑制剂及其制备方法和用途