一种水母活性蛋白及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种水母活性蛋白及其制备方法和应用 (Jellyfish active protein and preparation method and application thereof ) 是由 阮仁全 王辉 徐蕾 丁卫平 于 2021-08-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种水母活性蛋白的制备方法,包括如下步骤：步骤一、胶原蛋白或胶原蛋白海绵的制备：从水母中提取胶原蛋白或胶原蛋白海绵；步骤二、将胶原蛋白或胶原蛋白海绵溶解于高浓度的尿素溶液中获得。本发明还公开了一种水母活性蛋白及其应用。本发明在提取出胶原蛋白海绵之后加入高浓度尿素变性,一方面可分离掉共沉淀下来的不可溶性的组织或细胞碎片和脂类物质。(The invention discloses a preparation method of jellyfish active protein, which comprises the following steps: step one, preparing collagen or collagen sponge: extracting collagen or collagen sponge from jellyfish; and step two, dissolving the collagen or the collagen sponge in a high-concentration urea solution to obtain the collagen or the collagen sponge. The invention also discloses an aequorin active protein and application thereof. According to the invention, high-concentration urea is added for denaturation after the collagen sponge is extracted, so that insoluble tissues or cell fragments and lipid substances which are precipitated in a coprecipitation mode can be separated.)
技术领域
本发明涉及水母活性蛋白制备技术领域，具体地说，是关于一种水母活性蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
胶原蛋白可以从多种生物中提取。用于组织工程应用的胶原蛋白优选来源是牛皮肤，肌腱以及猪皮肤。然而，牛来源的胶原蛋白具有被诸如牛海绵状脑病(俗称疯牛病)之类的疾病感染的风险。此外，出于宗教原因，哺乳动物胶原蛋白，尤其是猪源的胶原蛋白越来越被拒绝。海洋生物是胶原蛋白替代的天然来源，据推测，与哺乳动物相比，海洋生物更安全。提取胶原蛋白的另一种有吸引力的海洋来源是水母。全球水母种群的增加在生态环境中造成了重大问题，其在食品工业和医药业以外的组织工程中的潜在应用可能有助于减少其发展。胶原蛋白含量超过60％，在生物医学应用中，水母有可能成为胶原的重要来源。
为了分离天然组织胶原，目前最常用的两种方法分别是使用酸溶解法和胃蛋白酶提取法。也有使用尿素提取I型胶原蛋白，但该方法单纯使用只能获得低质量的胶原蛋白。在常用的分离程序中，也存在一些不能忽视的缺点：酸处理会在萃取过程中引起部分水解，这在很大程度上是不可控制的，产生的胶原蛋白是经过不同程度水解/降解的胶原蛋白肽和完整胶原蛋白的混合物；在胃蛋白酶处理和提取过程中因为在提取之前不能通过洗涤组织来完全去除组织自身的酶，因此提取的胶原蛋白也会不受控制的降解。此外海洋来源的胶原蛋白的变性温度低，通常在高于20℃环境中，胶原蛋白的三股螺旋解链，并逐步水解成大小不一的多肽片段。因此在水溶液中很难对水母胶原蛋白的品质进行控制。常规的胶原蛋白仅能以冻干的形式应用和长期保存。
发明内容
本发明通过研究发现，可以通过优化胃蛋白酶提取方法，即，将提取的胶原蛋白溶解于一定浓度的尿素中，可以获得具有特定生物学活性且热力学稳定的胶原蛋白。且所提取的水母蛋白仍具有多种生物学活性，如促进皮肤细胞贴壁生长、迁移，修复皮肤屏障，提高皮肤保湿性等生物学活性。因此，本发明的第一个目的是提供一种水母活性蛋白的制备方法。本发明的第二个目的是提供一种水母活性蛋白。本发明的第三个目的是提供一种水母活性蛋白的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
作为本发明的第一个方面，一种水母活性蛋白的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、胶原蛋白或胶原蛋白海绵的制备：从水母中提取胶原蛋白或胶原蛋白海绵；
步骤二、将胶原蛋白或胶原蛋白海绵溶解于高浓度的尿素溶液中获得。
根据本发明，所述高浓度的尿素溶液的浓度为7mol/L～9mol/L。
优选的，所述高浓度的尿素溶液的浓度为8mol/L。
根据本发明，步骤二是在胶原蛋白或胶原蛋白海绵中，加入高浓度尿素溶液定容并进行搅拌，溶解充分后，离心；最终收集上清溶液，制成蛋白溶液(即水母活性蛋白)，常温保存。
根据本发明，所述离心是采用17,000g转速离心20min。
根据本发明，步骤一的胶原蛋白或胶原蛋白海绵的制备，包括如下步骤：
A、水母除盐：将水母切成小块，用水浸泡，去除盐分；
B、除脂类物质：加入脱脂酶，浸泡，洗去脱脂酶；
C、尿素溶解去除可溶性杂质：加入低浓度尿素溶液浸没组织块，室温低速搅拌，溶解杂质，纯水冲洗组织块，除去尿素；
D、加入柠檬酸将C除杂后的物料进行均化后转移至搅拌罐，加入胃蛋白酶溶液进行酶消化，保持16℃中慢速搅拌消化12小时；
E、消化完毕后，离心分离未消化组织块，用碱液中和分离的上清液至中性，再离心20分钟，收集胶原蛋白凝胶沉淀；
F、用柠檬酸溶解胶原蛋白，然后将上清调至中性，继续离心收集凝胶沉淀；放入冷冻干燥机进行冻干，制成胶原蛋白海绵，其中，从柠檬酸溶解到离心收集凝胶沉淀的步骤重复≥N次，N为自然数。应当说明，操作时，根据所需获得的胶原蛋白的纯度情况，重复溶解到中和的步骤的具体次数。
根据本发明，B是在25℃浸泡4h。
根据本发明，C的尿素溶液的浓度为0.5mol/L～2mol/L。
根据本发明，C的尿素溶液的浓度为1mol/L～2mol/L，室温低速搅拌的时间为2h～4h。
根据本发明，C的尿素溶液为2mol/L。
根据本发明，D的柠檬酸的浓度为0.1～1.0mol/L；胃蛋白酶的浓度为2～20mg/g。
根据本发明，E采用17,000g转速离心30分钟分离未消化组织块。
根据本发明，E的碱液为氢氧化钠或氢氧化钾，用碱液中和分离上清液至pH为5.0～7.0。
根据本发明，F的柠檬酸用量为5～10倍沉淀体积，浓度为0.01～0.1mol/L。
根据本发明，F、用柠檬酸溶解胶原蛋白，然后将上清调至中性，继续离心收集凝胶沉淀，从溶解到中和的步骤重复一次或多次。
作为本发明的第二个方面，一种水母活性蛋白，采用上述所述的方法制备获得。
作为本发明的第三个发明，一种上述所述的水母活性蛋白在促进皮肤细胞贴壁生长、促进皮肤细胞迁移，修复皮肤屏障、提高皮肤保湿性等中的应用。
本发明的水母活性蛋白的制备方法的有益效果是：
1、在胃蛋白酶解前，样品经一定浓度尿素浸泡，萃取出可溶性蛋白或多肽成分，尽可能的灭活组织中自身的酶，防止非特异性降解。
2、在提取出胶原蛋白海绵之后加入高浓度尿素变性，一方面可分离掉共沉淀下来的不可溶性的组织或细胞碎片和脂类物质。胶原蛋白在尿素溶液中蛋白链稳定，常温下不易降解，其结构与基因工程来源的重组胶原蛋白类似，不具有三股螺旋结构，但是所提取的水母蛋白仍具有多种生物学活性，如促进皮肤细胞贴壁生长、迁移，修复皮肤屏障，提高皮肤保湿性等生物学活性。
附图说明
图1为不同提取方法得到的胶原蛋白。
图2为母胶原在不同温度下的热稳定性。
图3为水母活性蛋白细胞贴壁实验。
图4为水母活性蛋白促进皮肤细胞迁移。
图5为水母活性蛋白提高皮肤保湿度。
图6为水母活性蛋白降低皮肤水分散失。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
制备流程：漂洗，切片，脱脂，尿素浸泡，洗涤，胃蛋白酶解，离心收集上清，中和沉淀，离心收集沉淀，酸洗2次，冻干，尿素溶解。
实施例1尿素胃蛋白酶法
1、尿素溶液浸泡样品
水母皮(Rhopilema esculentum，海蜇属)购自于水产市场。将10kg腌制的水母切成小块，用自来水冲洗，然后在纯水中浸泡数小时，除盐。加入1克脱脂酶(购自于上海生工)，保持25℃浸泡4小时后，洗去脱脂酶。将组织块分成5份，各2kg，分别加入4升浓度为1mol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/L尿素溶液，保持室温低速搅拌2小时，为了保证后续的酶促反应，需要将尿素去除，此时用滤布过滤组织块。结果显示，3mol/L以上尿素浸泡后组织块有不同程度的融化，洗涤尿素时组织损失较多。1mol/L尿素浸泡后上清透明，2mol/L尿素浸泡后，上清呈浅黄色，说明2mol/L尿素会将组织中非胶原成分进行溶解分离，而胶原蛋白未被溶解(见SDS-PAGE电泳图1的泳道4)。这将有利于提高胶原蛋白的品质。后续用2mol/L尿素浸泡。
2、胶原蛋白海绵的制备
水母皮(Rhopilema esculentum，海蜇属)购自于水产市场。将10kg腌制的水母切成小块，用自来水冲洗几次，然后在纯水中浸泡数小时，直到盐度低于0.01。加入1克脱脂酶(购自于上海生工)，保持25℃浸泡4小时后，洗去脱脂酶。加入20升2mol/L尿素溶液，保持室温低速搅拌2小时后，用纯水冲洗组织块除去尿素。以下步骤均在20℃以下进行。加入15升0.5mol/L柠檬酸将物料进行均化后转移至搅拌罐，加入10mg/g胃蛋白酶(购自上海生工生物)溶液进行酶消化，保持16℃慢速搅拌消化12小时。消化完毕后，用17,000g转速离心30分钟分离未消化组织块，用氢氧化钠中和分离的上清液至pH 7.0，再以17,000g离心20分钟，收集胶原蛋白凝胶沉淀。再以8倍沉淀体积的0.05mol/L的柠檬酸溶液溶解胶原蛋白，然后将上清调至中性，继续离心收集凝胶沉淀。从柠檬酸溶解到离心收集凝胶沉淀的步骤重复。然后放入冷冻干燥机进行冻干，制成胶原蛋白海绵。应当说明，操作时，根据所需获得的胶原蛋白的纯度情况，来确定溶解到离心收集凝胶沉淀的步骤的具体重复次数。
3、尿素溶液浓度的确定，称取5份，各1克的胶原蛋白海绵，分别加入0、2、4、6、8mol/L尿素溶液定容至100mL进行搅拌，溶解充分后，以17,000g转速离心20分钟。最终收集上清溶液，制成10mg/mL蛋白溶液，16℃保温24小时，SDS-PAGE检测蛋白。结果显示，胶原蛋白海绵都可以被溶解，不含尿素的水溶液溶解后胶原蛋白呈凝胶状，而含尿素的胶原蛋白粘度显著降低，呈低粘度溶液状，说明尿素打开了胶原蛋白的三螺旋结构。SDS-PAGE电泳显示，2mol/L、4mol/L、6mol/L尿素中胶原蛋白出现不同程度的降解。8mol/L尿素中胶原蛋白保留了完整的a链。后续用8mol/L尿素溶解海绵，从而抑制蛋白水解。
4、水母活性蛋白制备，称取1克胶原蛋白海绵，加入8mol/L尿素溶液定容至100mL进行搅拌，溶解充分后，以17,000g转速离心20分钟。最终收集上清溶液，制成10mg/mL蛋白溶液，常温保存。
实施例2：胃蛋白酶法
将10kg腌制的水母切成小块，用自来水冲洗几次，然后在纯水中浸泡数小时，直到盐度低于0.01。加入1克脱脂酶，保持25℃浸泡4小时后，洗去脱脂酶。以下步骤均在20℃以下进行。加入0.5M柠檬酸将物料进行均化后转移至搅拌罐，加入10mg/g胃蛋白酶(购自上海生工生物)溶液进行酶消化，保持16℃慢速搅拌消化12小时。消化完毕后，用17,000g转速离心30分钟分离未消化组织块，用氢氧化钠中和分离的上清液至pH 7.0，再以17,000g离心20分钟，收集胶原蛋白凝胶沉淀。再用0.05％的柠檬酸溶解胶原蛋白，然后将上清调至中性，继续离心收集凝胶沉淀，从溶解到中和的步骤重复两次。用水溶胀洗涤后的胶原蛋白，放入冷冻干燥机进行冻干，制成胶原蛋白海绵。称取1克胶原蛋白海绵，加入0.05％柠檬酸钠溶液定容至100mL，将胶原蛋白海绵充分溶胀，制成10mg/mL胶原蛋白凝胶，4℃保存。
实施例3：酸提取法工艺
将10kg腌制的水母切成小块，用自来水冲洗几次，然后在纯水中浸泡数小时，直到盐度低于0.01。加入1克脱脂酶，保持25℃浸泡4小时后，洗去脱脂酶。以下步骤均在20℃以下进行。加入0.5M柠檬酸将物料进行均化后转移至搅拌罐，保持16℃中慢速搅拌消化12小时。消化完毕后，用17,000g转速离心30分钟分离未消化组织块，用氢氧化钠中和分离的上清液至pH 7.0，再以17,000g离心20分钟，收集胶原蛋白凝胶沉淀。再用0.05％的柠檬酸溶解胶原蛋白，然后将上清调至中性，继续离心收集凝胶沉淀，从溶解到中和的步骤重复两次。用水溶胀洗涤后的胶原蛋白，放入冷冻干燥机进行冻干，制成胶原蛋白海绵。称取1克胶原蛋白海绵，加入0.05％柠檬酸钠溶液定容至100mL，将胶原蛋白海绵充分溶胀，制成10mg/mL胶原蛋白凝胶，4℃保存。
实施例4：高浓度尿素提取法工艺
将10kg腌制的水母切成小块，用自来水冲洗几次，然后在纯水中浸泡数小时，直到盐度低于0.01。加入1克脱脂酶，保持25℃浸泡4小时后，洗去脱脂酶。以下步骤均在20℃以下进行。加入8M尿素将物料进行均化后转移至搅拌罐，保持16℃中慢速搅拌消化12小时。消化完毕后，用17,000g转速离心30分钟分离未消化组织块，加入氯化钠至终浓度10％，将蛋白沉淀，再以17,000g离心20分钟，收集胶原蛋白沉淀。再用0.05％的柠檬酸溶解胶原蛋白，再次用氯化钠沉淀，继续离心收集沉淀，从溶解到沉淀的步骤重复两次。用水溶胀洗涤后的胶原蛋白，放入冷冻干燥机进行冻干，制成胶原蛋白海绵。称取1克胶原蛋白海绵，加入0.05％柠檬酸钠溶液定容至100mL，将胶原蛋白海绵充分溶胀，制成10mg/mL胶原蛋白凝胶，4℃保存。
实施例5：尿素胃蛋白酶法(无尿素洗涤)
水母皮(Rhopilema esculentum，海蜇属)购自于水产市场。将10kg腌制的水母切成小块，用自来水冲洗几次，然后在纯水中浸泡数小时，直到盐度低于0.01。加入1克脱脂酶(购自于上海生工)，保持25℃浸泡4小时后，洗去脱脂酶。以下步骤均在20℃以下进行。加入15升0.5mol/L柠檬酸将物料进行均化后转移至搅拌罐，加入10mg/g胃蛋白酶(购自上海生工生物)溶液进行酶消化，保持16℃慢速搅拌消化12小时。消化完毕后，用17,000g转速离心30分钟分离未消化组织块，用氢氧化钠中和分离的上清液至pH 7.0，再以17,000g离心20分钟，收集胶原蛋白凝胶沉淀。再8倍沉淀体积的0.05mol/L的柠檬酸溶解胶原蛋白，然后将上清调至中性，继续离心收集凝胶沉淀。从柠檬酸溶解到离心收集凝胶沉淀的步骤重复。然后放入冷冻干燥机进行冻干，制成胶原蛋白海绵。应当说明，操作时，根据所需获得的胶原蛋白的纯度情况，来确定溶解到离心收集凝胶沉淀的步骤的具体重复次数。
称取1克胶原蛋白海绵，加入8mol/L尿素溶液定容至100mL进行搅拌，溶解充分后，以17,000g转速离心20分钟。最终收集上清溶液，制成10mg/mL蛋白溶液，常温保存。
实施例6：SDS-PAGE电泳实验和得率计算
将实施例1-实施例5制备获得的蛋白溶液进行SDS-PAGE电泳实验。
配制8％SDS-PAGE凝胶，通过电泳法检测蛋白分子量以及纯度。结果见图1。
结果显示：
实施例1的尿素胃蛋白酶法提取的胶原蛋白为a链，符合I型胶原蛋白特征，分子量为140KD左右，与实施例2的胃蛋白酶法提取的分子量相同。实施例1的尿素胃蛋白酶法提取的胶原蛋白其纯度比胃蛋白酶法高。
实施例5未用2mol/L尿素洗涤的样品杂带较多(见图1的条带7)。说明尿素预处理时可以将组织中一些可溶性蛋白去除，保证了后续产品的纯度。同时尿素溶解胶原蛋白后也可以去除了部分不溶解的杂质。单独使用高浓度尿素提取的胶原蛋白杂质多，纯度低，色素深，气味重，无法得到高质量产品。
胃蛋白酶法和尿素胃蛋白酶法提取的得率均比酸提取法提取的得率高。这是由于酸提取的胶原蛋白未切割掉端肽，分子量较大，在初步分离固液杂质时被分离。
实施例7：水母活性蛋白热稳定性研究
将实施例1和实施例2制备的样品分别放置在16℃，37℃，55℃，75℃环境中5小时，考察胶原蛋白的热稳定性。实验后，取40μL样品，加入10×上样缓冲液，用SDS-PAGE电泳进行检测。海洋来源的胶原蛋白通常具有较低的变性温度，在常温或高温环境下容易发生变性从而水解成大小不一的多肽。尽管尿素会将胶原蛋白的三股螺旋解链形成单股a链，但尿素可以有效保持a单链不再继续断裂成小片段。该完整的a链对维持蛋白一定的生物学功能具有重要作用。结果见图2。
结果显示，在16℃环境下两种实施例方法提取的胶原蛋白都未被降解成小片段。37℃环境中放置5小时后胃蛋白酶提取的胶原蛋白的全长数量开始减少，降解比例达50％。55℃环境下降解比例达80％。而在75℃环境下降解比例为100％。在尿素中溶解的胶原蛋白(实施例1)在不同温度下都表现出热稳定性，全长片段未发生断裂。
实施例8：细胞贴壁实验
将实施例1提取的样品按1:10(1mg/mL)，1:100(0.1mg/mL)，1:1000(0.01mg/mL)，1:10000(0.001mg/mL)四个比例稀释，以1％纤连蛋白(终浓度5μg/mL,美尔健生物提供)为阳性对照组，1％BSA(终浓度5μg/mL，购自于上海生工)，将待测样品包被在无TC处理的96孔板30分钟，用PBS洗涤两遍后，加1％BSA于37℃封闭30分钟。加入胚胎成纤维细胞，孵育1小时，轻轻吸取孔中培养基，用PBS轻轻漂洗未贴壁的细胞，用CCD8法检测贴壁在孔板底部活细胞的数量，结果见图3。
结果显示，水母活性蛋白能够有效促进成纤维细胞贴壁，在0.1mg/mL呈现最佳的贴壁活性，随着浓度的增加贴壁数量减少，形成了具有一定厚度的凝胶层，细胞被包裹在凝胶层中，而未沉淀至培养皿底部。
实施例9：细胞迁移实验
三股螺旋的胶原蛋白广泛用于创面的修复，这不仅是由于胶原蛋白具有促进细胞贴壁生长，同时胶原蛋白还具有促进细胞迁移的能力。为了验证实施例1提取的水母活性蛋白生物学活性，本发明测试实施例1提取的水母活性蛋白促进表皮形成细胞的迁移能力，测试浓度分别为0.01mg/mL(0.1％)，0.1mg/mL(1％)，1mg/mL(10％)。结果见图4。
结果显示，在0.01mg/mL的水母活性蛋白存在的情况下，经过24小时的细胞培养，细胞往划痕中心迁移，随着浓度的增加，细胞迁移的程度约明显，说明水母活性蛋白可促进细胞迁移，并具有浓度依赖性。
实施例10：皮肤保湿实验
取实施例1提取的水母活性蛋白样品用0.3％卡波姆配制成含量5％水母胶原凝胶，以0.3％卡波姆为对照组，纯水为空白组。本实验招募6名志愿者，在手臂处测试样品的保湿效果。将手臂洗净，后晾干，用记号笔在手臂处画出5cm×5cm区域作为测试框。测试人员进入检测室静坐半小时，检测室环境控制在25℃恒温和50％恒湿。各取约0.2克样品均匀涂抹于测试框中，让皮肤自然晾干10分钟，再用干净的手指将残留的样品再一次均匀涂抹至完全吸收，分别在30min、1h、2h、4h、6h后测试皮肤水分含量，皮肤保湿测试用德国CK仪器(探头CM 825)进行测试。结果见图5。
结果显示，与对照组相比，水母活性蛋白可有效保持皮肤水分，维持皮肤长时间湿润度。
实施例11：修复皮肤屏障
经皮水分散失(TEWL)表示通过人体角质层蒸发的水分，通常被用来评价皮肤的屏障功能，表皮屏障越完整，TEWL值就越低。角质层的完整性是屏障强度或屏障储水能力的一个指标，通过连续6次胶带剥离试验法测定的TEWL值进行评估。如果该方法测试后TEWL降至低值，则证明皮肤具有良好的屏障完整性。测试人员在检测室静坐半小时，检测室环境控制在25℃恒温和50％恒湿。使用仪器为德国CK仪器(探头TM Hex)。本实例中试验操作如下：第0小时，在两侧脸颊各做6次胶带剥离操作，测定基线TEWL值，。左边脸分别于涂抹水母活性蛋白溶液后1小时，5小时，10小时和24小时后测定TEWL值。右边脸以生理盐水为空白对照组，由图6可见。
6次胶带剥离试验的测量值显示，在使用水母活性蛋白24小时后TEWL值相对于对照组显著下降，表明本发明中提取的水母活性蛋白有效恢复皮肤屏障损伤，减少皮肤水分散失，提高皮肤锁水能力。