阅读说明：本技术 Tet酶活性测定方法及tet酶活性小分子激活剂或抑制剂的高通量筛选方法 (TET enzyme activity determination method and high-throughput screening method of TET enzyme activity small molecule activator or inhibitor ) 是由 江翱 刘倩 马海玲 孙睿 陈晶晶 侯策 曹振 宋东亮 于 2021-08-23 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种TET酶活性测定方法,其特征在于其步骤包括：将5mC DNA与待测TET酶混合后孵育；在反应体系中加入SDH和DCPIP进行反应；加入三氯乙酸终止反应；酶标仪测量反应液在600nm处的吸收峰值,峰值越高则代表酶活性越强。还公开了SDH和DCPIP联合在测定TET酶活性中的应用,以及TET酶活性小分子激活剂或抑制剂的高通量筛选方法。本发明提供了一种简便快速的TET酶活性测定方法,利用TET酶氧化反应产物琥珀酸盐在琥珀酸脱氢酶的催化下释放出还原氢,还原氢被DCPIP捕获生成DCPIPH2(蓝色),在波长600 nm处出现特异性的吸收峰。整个方法流程只需要4步操作、一管式反应、耗时1 h即可完成,具有成本低、通量大、适用范围广和准确性高的优点。(The invention provides a TET enzyme activity determination method, which is characterized by comprising the following steps: mixing 5mC DNA with TET enzyme to be detected and then incubating; adding SDH and DCPIP into a reaction system for reaction; adding trichloroacetic acid to terminate the reaction; the microplate reader measures the absorption peak value of the reaction solution at 600nm, and the higher the peak value is, the stronger the enzyme activity is. Also discloses application of the combination of SDH and DCPIP in the determination of TET enzyme activity, and a high-throughput screening method of a small molecule activator or inhibitor of the TET enzyme activity. The invention provides a simple and rapid TET enzyme activity determination method, which utilizes the TET enzyme oxidation reaction product succinate to release reducing hydrogen under the catalysis of succinate dehydrogenase, the reducing hydrogen is captured by DCPIP to generate DCPIPH2 (blue), and a specific absorption peak appears at the wavelength of 600 nm. The whole method flow can be completed only by 4 steps of operation, one-tube reaction and 1 h of consumed time, and has the advantages of low cost, high flux, wide application range and high accuracy.)

TET酶活性测定方法及TET酶活性小分子激活剂或抑制剂的高 通量筛选方法

技术领域

本发明专利涉及一种TET酶活性测定方法及TET酶活性小分子激活剂或抑制剂的高通量筛选方法，属于生物技术领域。

背景技术

胞嘧啶甲基化（5mC）是DNA上最常见的修饰碱基，占所有胞嘧啶的1%-8%，是DNA甲基化的主要形式。有些特定的胞嘧啶位点如细菌的Dam甲基化位点或真核生物的CpG岛中的胞嘧啶位点发生甲基化修饰的比例可高达近100%，因此5mC也被称为“第五种碱基”。DNA甲基化是调控基因表达的重要形式，主要介导基因的沉默。这种由DNA甲基化介导基因沉默的调控方式在生命体内时刻发生，是基因差异性表达的分子基础，也是决定胚胎发育、细胞功能性分化、个体生长、衰老和病变的关键途径。比如，细胞分化过程中维持细胞干性的基因会高度甲基化来抑制自身的表达，而促进细胞分化的组织特异性功能基因会去甲基化来增强自身的表达活性。这种有条不紊的甲基化/去甲基化稳态是保证细胞正常生理状态的基础。DNA 5mC双加氧酶家族TET（又称为DNA 5mC羟化酶）是DNA去甲基化的主要蛋白，能够介导5mC-5hmC-5fC-5caC的氧化。人的TET酶家族有3个成员，TET1、TET2和TET3，这三个蛋白在不同的生命周期行使着DNA去甲基化的功能。在许多疾病的病程中，都出现由于TET酶活性失调（表达量变化、基因重排、基因突变、蛋白定位改变等因素）而造成的疾病相关基因表达紊乱的现象，如肿瘤、白血病、自身免疫病、遗传性疾病等。因此，TET酶活性成为许多疾病诊断和治疗的重要靶标，针对TET酶的小分子增强剂和抑制剂药物也成为临床上治疗相关疾病的关键突破口。但是，TET酶活性的测定是DNA甲基化临床诊治和科学研究的一大难题。

由于TET酶介导的5mC氧化存在复杂的三重催化反应（5mC-5hmC-5fC-5caC），现有的酶活测定方法很难准确有效的测定TET酶的活性。现有的TET酶活性测定方法主要分为三种。第一种是基于液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）的检测方法，将TET酶氧化的m5C oligo回收后经核酸酶消解，并通过LC-MS分析底物m5C和氧化产物5hmC、5fC和5caC的占比，从而判断TET酶的活性。这种方法的优势是可以区分TET酶各个阶段的氧化产物，但是背景重、操作复杂、成本高、准确性差、难以用于高通量分析。第二种方法是点杂交检测技术， 5mC DNAoligo经TET氧化后的交联到尼龙膜上，分别利用5mC、5hmC、5fC和5caC抗体进行杂交，最后利用特殊标记二抗进行信号放大和显色。这种方法因为同时可以检测多个样本而被广泛使用，但是这种方法通量较小、操作复杂、成本高，且难以进行定量分析。第三种方法使用酶联免疫吸附测定法（ELISA）进行活性测定。将TET酶氧化的5mC DNA oligo固定到96孔板中，加入5hmC抗体结合，并通过标记二抗进行显色反应。这种方法虽然可以定量分析，通量比前两种大，但操作复杂，成本高，且只能分析5hmC一种反应中间产物的含量，无法准确地对TET酶的活性进行测定（高活性的TET酶可能因为氧化产物中5caC占比升高和5hmC占比降低而被此方法测定为低活性）。这三种方法都因为耗时长（8 h以上）和操作复杂（数百步操作），成为TET酶活自动化检测以及高通量小分子激活剂和抑制剂药物筛选的巨大障碍。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便快速的TET酶活性测定方法，反应原理是TET酶氧化5mC的三个步骤都伴随着α-酮戊二酸的消耗和琥珀酸盐的生成，琥珀酸盐在琥珀酸脱氢酶（SDH）的催化下释放出还原氢，还原氢被2，6- 二氯酚靛酚（DCPIP）捕获生成蓝色的DCPIPH2，在波长600 nm处出现特异性的吸收峰。

本发明采取的技术方案为：一种TET酶活性测定方法，其特征在于其步骤包括：

（1）将5mC DNA与待测TET酶混合后孵育，孵育的目的是进行氧化反应；

（2）在反应体系中加入SDH和DCPIP进行反应；

（3）加入三氯乙酸终止反应；

（4）酶标仪测量反应液在600nm处的吸收峰值，峰值越高则代表酶活性越强。

优选的，步骤（1）中所述5mC DNA的序列为AAAAAAAm5CGAAAAAAATTTTTTTm5CGTTTTTTT。

优选的，步骤（1）中5mC DNA与TET酶在TET酶反应缓冲液中孵育10-30min。

优选的，步骤（2）中还加入吩嗪二甲酯硫酸盐，吩嗪二甲酯硫酸盐可以作为还原氢传递给DCPIP的中间产物，促进反应的效率。

优选的，步骤（2）的SDH为人源SDHA或者SDHB。

本发明还公开了SDH和DCPIP联合在测定TET酶活性中的应用。

一种TET酶活性小分子激活剂或抑制剂的高通量筛选方法，其特征在于其步骤包括：

A、在反应容器中加入TET酶反应缓冲液和TET酶；

B、在反应容器中加入小分子药物，孵育一段时间；

C、在反应容器中加入5mC DNA，孵育一段时间；

D、在反应容器中加入SDH和DCPIP进行反应；

E、加入三氯乙酸终止反应；

F、酶标仪测量反应液在600nm处的吸收峰值，以未添加小分子药物的样本作为对照，比较TET酶的活力变化，吸附峰值增大则代表该小分子药物为TET酶的活性促进小分子，吸附峰值降低则代表该小分子药物为TET酶的活性抑制小分子药物。

优选的，反应容器为96孔板或384孔板，同时进行多个小分子药物的筛选。

优选的，步骤（2）中室温孵育5-10min，步骤（3）中37℃孵育30-60min。

本发明的有益效果为：

本发明提供了一种简便快速的TET酶活性测定方法(显色法)，利用TET酶氧化反应产物琥珀酸盐在琥珀酸脱氢酶的催化下释放出还原氢，还原氢被2，6- 二氯酚靛酚（DCPIP）捕获生成DCPIPH2（蓝色），在波长600 nm处出现特异性的吸收峰。整个方法流程只需要4步操作、一管式反应、耗时1 h即可完成，具有成本低、通量大、适用范围广和准确性高等优点，非常适用于TET酶活性的工业自动化检测以及小分子激活剂和抑制剂药物的高通量筛选。

附图说明

图1 显色法TET酶活测定原理示意图。

图2 显色法TET酶活测定流程示意图。

图3显色法测定各类TET酶的标准曲线。

图4 三种TET酶活测定方法比较（NgTET1）。

图5 三种TET酶活测定方法比较（mTET1）。

图6 三种TET酶活测定方法比较（mTET2）。

图7三种TET酶活测定方法比较（hTET1）。

图8三种TET酶活测定方法比较（hTET2）。

图9三种TET酶活测定方法比较（hTET3）。

图10 高通量TET酶小分子药物筛选和鉴定流程示意图。

图11 384种药物分子库筛选结果。

图12潜在TET酶抑制剂化合物127#验证结果。

图13 潜在TET酶激活剂化合物35#验证结果。

具体实施方式

为了进一步描述使本发明的具体内容，以下结合实施例对本发明进行详细说明。实施例所涉及的操作方法及试剂为业内技术人员所熟知，应当理解，以下所描述的具体实施例仅仅用于对发明进行详细说明，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。

实施例1：显色法TET酶活流程和标准曲线的测定。

在本实施例中，我们公布了TET酶活的测定流程（如图1和图2），并根据此流程测定了NgTET1(Active motif)、mTET1(WiseGene)、mTET2(Creative Biomart)、hTET1(ActiveMotif)、hTET2(Active Motif)和hTET3(Active Motif)的酶活性（如图3）。具体实施方式如下：

表1

组分	用量
		5mC DNA标准品	10 ng
TET酶反应缓冲液	3 μL
		待测TET酶	0.1-10 μg
补ddH2O至	30 μL

37℃反应30 min。

表2

组分	用量
		上述反应	30 μL
琥珀酸脱氢酶反应缓冲液	4 μL
		SDHA	2 μg
SDHB	2 μg
		补ddH2O至	40 μL

37℃反应30 min。反应结束后，加入5 uL 35%三氯乙酸终止反应。

在酶标仪上测定反应孔在600 nm处的吸收峰值，测定酶活测定曲线。

结果如图3所示，利用显色法测定各TET酶（NgTET1、mTET1、mTET2、hTET1、hTET2和hTET3）的活性，在600 nm波长处的吸收值与TET酶的投入量呈明显的相关性，线性相关系数可达0.95以上，且使用范围广（0.1-10 ug投入量范围内未出现明显偏差）。这说明显色法可能有效准确地测定TET酶的活性。

实施例2：三种TET酶测定方法比较。

在本实施例中，我们按照比较了显色法、LC-MS法和ELISA法三种酶活测定方法对TET酶的活性测定效果。

LC-MS法测定TET酶活：使用酚氯仿抽提和乙醇沉淀回收DNA，使用LC-MS测量DNA中5mC、5hmC、5fC和5caC的含量占比（Hashimoto H , Pais J E , et al. Structure of aNaegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA. Nature,2013, 506(7488):391-395.）。

ELISA法测定TET酶活：使用Epigentek的Epigenase 5mC-羟化酶TET活性/抑制分析试剂盒（荧光法）按照说明书的流程来测定各TET蛋白的酶比活性。

结果如图4-图9所示，相较于LC-MS法和ELISA法，显色法不仅操作简单、成本低、通量大，而且测定 的TET酶活呈明显的线性关系。这说明显色法在测定TET酶活性上具有准确性更高，适应范围更广等显著的优势。

实施例3：利用显色法进行高通量TET酶小分子靶向药物的筛选。

在本实施例中，我们利用开发的TET酶活测定方法（显色法），进行了高通量小分子药物库的筛选。示意图如图10。具体实施方式如下：

小分子药物库的设计和制备：我们筛选了MCE公司临床化合物库中的382种小分子临床药物。

TET酶和小分子药物库预结合：在384孔板中加入1 uL TET酶缓冲液和0.3 ug TET酶，每孔中各加入终浓度1 uM的小分子药物，室温孵育10 min。

TET酶氧化：加入2 ng的5mC DNA，反应体积10 uL。启动反应，37度反应30 min。

显色反应：加入1.3 uL的琥珀酸脱氢酶反应缓冲液和700 ng的SDHA和SDHB，反应体积13 uL。37度反应30 min。

终止反应：加入7 ul 10%的三氯乙酸。

测量：在酶标仪上测量600 nm波长处的吸收值。

结果如图11所示，我们建立的显色法TET酶活性测定体系能够有效测定用于高通量TET酶抑制剂和激活剂的筛选。我们挑取了化合物127（潜在抑制剂）和化合物35（潜在激活剂）进行了活性验证，结果显示使用显色法进行高通量药物筛选可以有效地筛选出TET酶的激活剂和抑制剂(图12和图13)。

综上，我们开发了一种简便快速的TET酶活性测定方法(显色法)，利用TET酶氧化反应产物琥珀酸盐在琥珀酸脱氢酶的催化下释放出还原氢，还原氢被2，6- 二氯酚靛酚（DCPIP）捕获生成DCPIPH2（蓝色），在波长600 nm处出现特异性性的吸收峰。整个方法流程只需要4步操作、一管式反应、耗时1 h即可完成，具有成本低、通量大、适用范围广和准确性高等优点，非常适用于TET酶活性的工业自动化检测以及小分子激活剂和抑制剂药物的高通量筛选。