缓冲液、试剂盒、提高灵敏度及特异性的方法及用途
阅读说明：本技术 缓冲液、试剂盒、提高灵敏度及特异性的方法及用途 (Buffer solution, kit, method for improving sensitivity and specificity and application ) 是由 王叶 李玲 方丽 谭春梅 于 2021-08-13 设计创作，主要内容包括：为改善现有的抑制素A检测的灵敏度及特异性,本发明实施例提供一种缓冲液、试剂盒及提高试剂盒灵敏度及特异性的方法,所述缓冲液为含有过氧化氢的分析缓冲液。所述缓冲液用于测定抑制素A的用途。试剂盒,包括R1试剂、R2试剂和R3试剂,R3试剂包括含有过氧化氢的分析缓冲液；方法,包括：将测定抑制素A的试剂盒中的分析缓冲液和过氧化氢溶液配制成含有过氧化氢的分析缓冲液。本发明实施例通过使用含有过氧化氢的分析缓冲液提高了检测抑制素A的灵敏度及特异性,本发明实施例能有效的提高试剂盒检测过程中试剂盒效价,增强试剂灵敏度。(In order to improve the sensitivity and specificity of the existing inhibin A detection, the embodiment of the invention provides a buffer solution, a kit and a method for improving the sensitivity and specificity of the kit, wherein the buffer solution is an analysis buffer solution containing hydrogen peroxide. Use of the buffer for the determination of inhibin A. A kit comprising R1 reagent, R2 reagent and R3 reagent, the R3 reagent comprising an assay buffer comprising hydrogen peroxide; the method comprises the following steps: the assay buffer and the hydrogen peroxide solution in the kit for assaying inhibin A were prepared as an assay buffer containing hydrogen peroxide. According to the embodiment of the invention, the sensitivity and specificity of the inhibin A detection are improved by using the analysis buffer solution containing hydrogen peroxide, the titer of the reagent kit in the detection process of the reagent kit can be effectively improved, and the sensitivity of the reagent is enhanced.)
技术领域
本发明涉及一种缓冲液、试剂盒及提高试剂盒灵敏度及特异性的方法。
背景技术
抑制素A是一种由女性卵巢颗粒细胞及男性睾丸支持细胞分泌的异二聚体蛋白质激素，β亚单位与βA亚单位组成抑制素A，它反馈抑制垂体FSH的合成与分泌，对性腺也有局部旁分泌作用。妇女绝经后血清抑制素不在随年龄增长而变化。女性妊娠时来源于胎盘的合体滋养层。抑制素A用于临床诊断和各种内分泌生殖系统异常的检测，是孕中期唐氏综合征筛查的常规指标，是目前公认的卵巢功能监测和先兆子痫预测最好的标志物之一。
但现有测定抑制素A(INHA)的试剂盒，灵敏度方面有所欠缺，且特异性较差，同时目前常用缓冲液有磷酸缓冲液、Tris-Hcl缓冲液以及MES缓冲液，这些缓冲液仅仅能提供一个反应的基础环境，并不能改善抗原抗体间识别效率，因此，这些缓冲液无法起到改善灵敏度及特异性的作用。
发明内容
为改善现有的抑制素A检测的灵敏度及特异性，本发明实施例提供一种缓冲液、试剂盒及提高试剂盒灵敏度及特异性的方法。
本发明实施例通过下述技术方案实现：
第一方面，本发明实施例提供一种缓冲液，所述缓冲液为含有过氧化氢的分析缓冲液。
进一步的，所述缓冲液为含有质量分数为5％-30％的过氧化氢的分析缓冲液。
进一步的，所述含有过氧化氢的缓冲液为含有过氧化氢的Tris-Hcl缓冲液。
第二方面，本发明实施例提供所述缓冲液用于测定抑制素A的用途。
第三方面，本发明实施例提供一种试剂盒，包括R1试剂、R2试剂和R3试剂，R3试剂包括含有过氧化氢的分析缓冲液。
进一步的，R1试剂包括标记有生物素的鼠单抗包被的磁珠；R2试剂包括酶工作液。
进一步的，所述R3试剂包括质量分数为5-30％的过氧化氢的分析缓冲液。
进一步的，所述R3试剂中含有过氧化氢的分析缓冲液为含有质量分数为10％的过氧化氢的分析缓冲液；标记有生物素的鼠单抗包被的磁珠为Biotin-抑制素A单克隆抗体包被的磁珠；酶工作液为含蛋白的缓冲液和酶标抗体的混合溶液。
第四方面，本发明实施例提供一种提高试剂盒灵敏度及特异性的方法，包括：
将测定抑制素A的试剂盒中的分析缓冲液和过氧化氢溶液配制成含有过氧化氢的分析缓冲液。
进一步的，将测定抑制素A的试剂盒中的分析缓冲液和过氧化氢溶液配制成含有过氧化氢的分析缓冲液，包括：
将测定抑制素A的试剂盒中的分析缓冲液和过氧化氢溶液配制成含有质量分数为5-30％的过氧化氢的分析缓冲液。
本发明实施例与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
本发明实施例的缓冲液、试剂盒、提高灵敏度及特异性的方法及用途，通过使用含有过氧化氢的分析缓冲液提高了检测抑制素A的灵敏度及特异性，本发明实施例能有效的提高试剂盒检测过程中试剂盒效价，增强试剂灵敏度。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
在以下描述中，为了提供对本发明的透彻理解阐述了大量特定细节。然而，对于本领域普通技术人员显而易见的是：不必采用这些特定细节来实行本发明。
实施例
为改善现有的抑制素A检测的灵敏度及特异性，发明人通过向分析缓冲液添加过氧化氢溶液，来改变反应体系的环境，使抗原抗体结合位点经过氧化暴露更充分，更有利于位点结合，加强抑制素A抗原与抗体的识别性。
具体地，本发明实施例提供一种缓冲液，所述缓冲液为含有过氧化氢的分析缓冲液。
进一步的，所述缓冲液为含有质量分数为5％-30％的过氧化氢的分析缓冲液。
可选地，所述缓冲液为含有质量分数为10％-30％的过氧化氢的分析缓冲液。
进一步的，所述含有过氧化氢的缓冲液为含有过氧化氢的Tris-Hcl缓冲液。
第二方面，本发明实施例提供所述缓冲液用于测定抑制素A的用途。
第三方面，本发明实施例提供一种试剂盒，包括R1试剂、R2试剂和R3试剂，R3试剂包括含有过氧化氢的分析缓冲液。
进一步的，R1试剂包括标记有生物素的鼠单抗包被的磁珠；R2试剂包括酶工作液。
进一步的，所述R3试剂包括质量分数为5-30％的过氧化氢的分析缓冲液。
进一步的，所述R3试剂中含有过氧化氢的分析缓冲液为含有质量分数为10％的过氧化氢的分析缓冲液；标记有生物素的鼠单抗包被的磁珠为Biotin-抑制素A单克隆抗体包被的磁珠；酶工作液为含蛋白的缓冲液和酶标抗体的混合溶液。
第四方面，本发明实施例提供一种提高试剂盒灵敏度及特异性的方法，包括：
将测定抑制素A的试剂盒中的分析缓冲液和过氧化氢溶液配制成含有过氧化氢的分析缓冲液。
进一步的，将测定抑制素A的试剂盒中的分析缓冲液和过氧化氢溶液配制成含有过氧化氢的分析缓冲液，包括：
将测定抑制素A的试剂盒中的分析缓冲液和过氧化氢溶液配制成含有质量分数为5-30％的过氧化氢的分析缓冲液。
实施例1
一种用于测定抑制素A的试剂盒，包括鼠单抗包被的磁珠、添加过氧化氢的分析缓冲液和酶工作液，鼠单抗包被的磁珠上标记有生物素。
所述添加过氧化氢的分析缓冲液的制备方法为：
A、准备干净的容器，使用量筒量取一定体积的质量分数为30％过氧化氢溶液。
B、向A中加入质量分数为10％的Tris-HCl缓冲液定容，配制成含有质量分数为10％的过氧化氢的分析缓冲液。
对比例1
一种用于测定抑制素A的试剂盒，包括鼠单抗包被的磁珠、添加铁氰化钾的分析缓冲液和酶工作液，鼠单抗包被的磁珠上标记有生物素。
所述添加铁氰化钾的分析缓冲溶液的制备方法为：
A、准备干净的称量纸，使用万分之一天平称量0.10g铁氰化钾。
B、将A中量取的铁氰化钾，倒入提前准备好的干净烧杯中，少量分析缓冲液溶解。
C、用质量分数为10％的Tris-HCl缓冲液将B中溶液定容至1L，配制成0.1g/L铁氰化钾分析缓冲液。
对比例2
一种用于测定抑制素A的试剂盒，包括鼠单抗包被的磁珠、添加二甲亚砜的分析缓冲液和酶工作液，鼠单抗包被的磁珠上标记有生物素。
所述添加二甲亚砜的分析缓冲液的制备方法为：
A、准备干净的容器，使用量筒量取一定体积的二甲亚砜溶液。
B、向A中加入质量分数为10％的Tris-HCl缓冲液定容，配制成质量分数为0.1％的二甲亚砜分析缓冲液。
对比实验1
不加入氧化剂的分析缓冲液、加入过氧化氢的分析缓冲液、加入铁氰化钾的分析缓冲液和加入二甲亚砜的分析缓冲液在同等条件下，进行试剂盒效价、灵敏度与特异性比较实验。
实验材料：鼠抗人INHA特异性单克隆抗体，含有质量分数为1％BSA的缓冲液Buffer，裸磁珠，ALP标记的鼠抗人INHA特异性单克隆抗体，含有质量分数为0.5％BSA的缓冲液 Buffer，分析缓冲液(添加质量分数为10％过氧化氢的分析缓冲液、添加0.1g/L铁氰化钾的分析缓冲液、添加质量分数为0.1％二甲亚砜的分析缓冲液和不添加氧化剂的分析缓冲液)，抑制素A校准品cal-1～cal-6(cal-1到cal-6的浓度为0，10，50，250，750，1500pg/mL)，已知抑制素A贝克曼测值样本S1-S10，底物液，清洗液，沃文特全自动化学发光免疫分析仪 LA2000。
采用实施例1、对比例1和对比例2的方法，将不加入氧化剂的分析缓冲液、加入质量分数为10％过氧化氢的分析缓冲液、加入0.1g/L铁氰化钾的分析缓冲液和加入质量分数为0.1％二甲亚砜的分析缓冲液分别与生物素抗体包被好的磁珠和酶工作液共同组成试剂盒，测定 INHA校准品cal-1至cal-6，观察不同抗体的测定曲线及特异性。
反应模式为：先加入校准品或样本50μL，磁珠50μL，缓冲溶液50μL37℃共同孵育10min 后，再加入酶工作液100μL37℃孵育10min，加入清洗液在磁场中清洗分离三次后，加入底物液37℃孵育5min后，于全自动化学发光测定仪上检测。实验结果如表1和表2所示。
表1
表2
实验结论：由表1可知，采用无氧化剂添加或添加二甲亚砜的分析缓冲液的试剂盒效价较低，同时灵敏度差，采用缓冲液中添加铁氰化钾的试剂盒存在效价提高现象，但曲线不能满足使用要求，灵敏度较差，采用缓冲液中添加过氧化氢的试剂盒效价明显提高，曲线基本满足使用，灵敏度良好。由表2可知，使用4种条件的试剂对已知贝克曼测值的INHA样本进行检测，无氧化剂添加、添加二甲亚砜或添加铁氰化钾的分析缓冲液的试剂盒测值与贝克曼测值相关性较差，特异性较差，添加过氧化氢的试剂盒相关性较好，特异性良好。综上所述，添加过氧化氢的试剂盒效价明显提高，并且样本检测结果良好，特异性得到很大的改善。
对比实验2不同浓度过氧化氢，试剂盒灵敏度与特异性比较实验
向分析缓冲液中添加不同量的过氧化氢溶液，配制质量分数分别为5％、10％和20％过氧化氢溶液，按照对比实验1的方法对抑制素A校准品进行测定，观察批间差。
实验材料：鼠抗人INHA特异性单克隆抗体，含有质量分数为1％BSA的缓冲液Buffer，裸磁珠，ALP标记的鼠抗人INHA特异性单克隆抗体，含有质量分数为0.5％BSA的缓冲液 Buffer，分析缓冲液(添加5％过氧化氢的分析缓冲液、添加质量分数为10％过氧化氢的分析缓冲液、添加20％过氧化氢的分析缓冲液)，抑制素A校准品cal-1～cal-6(cal-1到cal-6的浓度为0，10，50，250，750，1500pg/mL)，底物液，清洗液，沃文特全自动化学发光免疫分析仪LA2000。
实验方法参照对比实验1；实验结果如下表3。
表3
实验结论：同为分析缓冲液中添加过氧化氢溶液，但由于过氧化氢溶液含量不同，按相同的标记方法所制备的试剂盒中10％过氧化氢含量出现的效果最明显，添加5％过氧化氢试剂盒效价较低，添加20％过氧化氢的试剂盒效价提升程度也并未优于添10％过氧化氢的试剂盒。
对比实验3：不同浓度铁氰化钾，试剂盒灵敏度与特异性比较实验
向分析缓冲液中添加不同量的铁氰化钾，配制的分析缓冲溶液中铁氰化钾最终浓度梯度为：0.05g/L，0.1g/L，0.2g/L；按照对比实验1的方法对抑制素A校准品进行测定，观察批间差。
实验材料：鼠抗人INHA特异性单克隆抗体，含有质量分数为1％BSA的缓冲液Buffer，裸磁珠，ALP标记的鼠抗人INHA特异性单克隆抗体，含有质量分数为0.5％BSA的缓冲液 Buffer，分析缓冲液(铁氰化钾浓度为0.05g/L的分析缓冲液、铁氰化钾浓度为0.1g/L的分析缓冲液、铁氰化钾浓度为0.2g/L的分析缓冲液)，抑制素A校准品cal-1～cal-6(cal-1到cal-6 的浓度为0，10，50，250，750，1500pg/mL)，底物液，清洗液，沃文特全自动化学发光免疫分析仪LA2000。
实验方法参照对比实验1，实验结果如表4所示。
表4
实验结论：同为分析缓冲液中添加铁氰化钾，添加的0.1g/L与0.2g/L铁氰化钾试剂相对测定效果较好，但不同浓度的铁氰化钾对试剂盒效价的提升程度均不高，整体效价提升效果不如添加过氧化氢的试剂盒。
对比实验4：不同浓度铁氰化钾，试剂盒灵敏度与特异性比较实验
实验材料：对比实验1中含有质量分数为10％过氧化氢的分析缓冲液，包被了鼠抗人 INHA特异性单克隆抗体的磁珠，ALP标记的鼠抗人INHA特异性单克隆抗体酶工作液，抑制素A校准品cal-1～cal-6(cal-1到cal-6的浓度为0，10，50，250，750，1500pg/mL)，底物液，清洗液，沃文特全自动化学发光免疫分析仪LA2000，恒温培养箱。
实验方法：将制备好的质量分数为10％的过氧化氢的分析缓冲液等体积分成两份装入试剂盒，一份与2-8℃保存，一份于恒温培养箱中37℃保存，6天后取出。分别与磁珠和酶工作液配合测定INHA校准品。分别于第三天和第六天观察校准品的发光信号，计算信号保留率，验证添加质量分数为10％过氧化氢的分析缓冲液稳定性。实验结果如下表5所示。
表5
实验结论：含有质量分数为10％的过氧化氢的分析缓冲液，在4℃与37℃存放后信号保留率很好，稳定性更好。
综上四个实验可以得出：表明抑制素A测定试剂盒在采用添加了过氧化氢的分析缓冲液时，试剂效价明显提高，灵敏度和特异性均有效提高。在作为氧化剂与生物素包被好的磁珠反应之前，调节分析缓冲液中过氧化氢的质量分数为10％，可以提高试剂盒的稳定性，但添加比例过高会浪费资源。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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