用于抗植物病害的基因

文档序号：1835800 发布日期：2021-11-12 浏览：9次 >En<

阅读说明：本技术 用于抗植物病害的基因 (Gene for resisting plant diseases ) 是由 O·特尔耶克 D·博尔夏特 M·雷科斯克 W·梅歇尔克 J·C·莱恩 B·舒尔茨于 2019-02-18 设计创作，主要内容包括：通过提供根据本发明的抗性介导基因,能够实现抗植物病害的更有效育种或开发新的抗性品系；特别地,目标植物的抗性效果是由所鉴定基因的特性引起的。前面所述的本发明的实施方式和抗性介导基因提供了旨在开发新的抗性品种的额外应用,例如抗性基因等位基因在反式遗传途径中的用途。(By providing the resistance-mediating gene according to the present invention, more effective breeding against plant diseases or development of new resistant lines can be achieved; in particular, the resistance effect of the target plant is caused by the characteristics of the identified gene. The previously described embodiments of the invention and resistance mediating genes provide additional applications aimed at developing new resistant varieties, such as the use of resistance gene alleles in the trans-genetic pathway.)

具体实施方式

本发明涉及一种核酸分子，其能够赋予表达由该核酸分子编码的多肽的植物(特别是甜菜亚种)尾孢菌属抗性。根据本发明的优选实施方式，该病原体是真菌甜菜尾孢菌，它是甜菜、甜菜根和叶用甜菜等的最重要和最具破坏性的叶病原体之一，可导致超过 40％的作物损失。该真菌会产生次生代谢产物尾孢菌素，其在光照下与氧气发生反应，并形成活性氧(ROS)。ROS在受感染植物的叶片组织中造成大量细胞损伤，以坏死的形式呈现。

本发明基于源自供体海甜菜的基因或基因座的遗传精细定位、鉴定、分离和表征，其在植物(尤其是甜菜亚种)中的存在与植物对尾孢菌属叶斑病的抗性相关，或是植物对尾孢菌属叶斑病抗性的原因。起始材料是海甜菜群体，其由来自不同来源的37份海甜菜材料培育而成。

根据本发明的核酸分子的核苷酸和氨基酸编码序列以多种多态性为特征，其将根据本发明鉴定的NPS-LRR基因与该基因的“敏感性”变体(即不赋予尾孢菌属抗性的基因变体)区分开。多态性的实例如图1所示。

根据本发明的核酸分子可以是分离的核酸分子。优选为DNA，尤其优选为cDNA(编码DNA)。由根据本发明的核酸分子编码的多肽优选赋予对会引起尾孢菌属叶斑病的病原体甜菜尾孢菌属的抗性。此外，由根据本发明的核酸分子编码的多肽赋予—尤其是赋予甜菜属植物—对该病原体的抗性。该植物优选为甜菜物种植物，尤其优选甜菜亚种植物；例如，这些包括品种甜菜、甜菜根、饲用甜菜、叶用甜菜和瑞士甜菜。

在本发明的一个实施方式中，根据本发明的核酸分子包含编码具有根据SEQ IDNO：3的氨基酸序列和/或根据SEQ ID NO：2的编码DNA序列的多肽的核苷酸序列。此外，本发明提供了一种核苷酸序列，其包含根据SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：53 的DNA序列。

根据本发明鉴定的基因是NBS-LRR型抗性基因/蛋白，其特征在于具有特定结构基序。植物中这种抗性蛋白的一般结构已经得到了很好的研究(Martin等，《植物生物学年鉴》(Martin et al.，Annual Review Plant Biology 54(2003)，23-61)。然而，结构实施方式的原理—特别是已知的LRR结构域的原理，该结构域是大多数未知病原性效应子的潜在检测结构域—是不可预测的，并且抗性基因的功能背景(即，遗传结构)通常在很大程度上是未知的。因此，仅根据已知的结构基序来鉴定赋予尾孢菌属抗性的基因或蛋白是不可能的。此外，已经证明序列区是一个高度重复的区域，其中包含序列同源性非常高的串联重复序列，这使得诊断标记的开发以及序列数据的组装特别困难。

借助于4000多个分裂后代群体的建立和特殊重组筛选的发展，通过在一系列抗性试验中对信息重组体(基因型和表型)进行分析，减小了目标区域，将其进一步分离。遗传定位以及伴随WHG测序(“全基因组测序”)、比较BAC(BAC-by-bac)测序和生物信息学分析创建物理图谱，导致了确定抗性基因的三种重组基因型的鉴定(一方面，相邻基因中有1个重组子，另一方面，相邻基因中有2个重组子)。考虑到特殊要求，本发明人将高度重复的结构放置在目标区域，其中包括序列同源性非常高的串联重复序列，这使得标记开发和信息重组体鉴定变得更加困难。以下步骤对于抗性基因遗传结构的定位尤其具有决定性作用：

-标记s4p0264s01、s4p2271s01、sxh0678s01、s4p4293s01、s4p4295s01、s4p4301s01(参见表1B)的开发。

-与密集表型相结合进行精细定位。在温室试验中，通过每株植物90-180个后代以及密集的统计方法(例如，t检验、功率分析等)来鉴定表型。

-从抗性基因型的BAC库中鉴定和测序BAC克隆。

-序列评估，以及比较RR(即，抗性)和ss(即，敏感性)基因型之间的序列和蛋白；因此，由于序列复杂性，不总是可以进行RR和ss序列数据的明确组装。

表1B：目标区域中的标记；方括号[X/Y]中的信息表示诊断SNP，其中X表示敏感性基因型，Y表示抗性基因型。

表1B中提供的化合物可用作根据本发明的分子标记。

分析表明，LRR基因与来自番茄的Cf-2抗性蛋白(UNIPROT|Q41397_SOLPI P. Cf-2.1)中度蛋白同源(序列同一性322/830＝38％)。事实上，已鉴定的赋予尾孢菌属抗性的蛋白是Cf-2番茄抗性蛋白的最好的甜菜蛋白同源物。来自番茄的Cf-2抗性蛋白通过与来自番茄叶霉菌(Cladosporium fulvum)的无毒蛋白Avr2发生相互作用，而赋予番茄叶霉菌(一种黑霉菌)抗性(US 6,287,865 B1)。这会导致植物对病原体的免疫防御激活；参见 Dixon等，1996(Dixon，Mark S.，et al.，“The tomato Cf-2 disease resistance locus comprisestwo functional genes encoding leucine-rich repeat proteins”Cell 84.3(1996)：451-459)。由于Cf-2基因与已鉴定的LRR基因之间的序列同源性，可以假设，但不受一种理论的约束，甜菜中也存在构成尾孢菌属抗性基础的类似防御机制。然而，由于序列同源性为中等，因此不排除不同的机制。

此外，可将取代、缺失、插入、添加和/或任何其他改变单独或组合地引入根据本发明的核苷酸序列中，上述改变实际上确实改变了核苷酸序列，然而其中，经过修饰的核苷酸序列可执行与初始序列相同的功能。本案涉及赋予对尾孢菌属叶斑病的抗性的氨基酸序列的编码。因此，在又一实施例中，本发明包括编码多肽的核苷酸序列，该多肽代表由根据本发明的核苷酸序列编码的多肽的衍生物，或者包括根据本发明的氨基酸序列。具有一个或多个氨基酸的至少一个取代、缺失、插入或添加的衍生氨基酸序列代表多肽的衍生物，其中保留了编码的多肽/蛋白质的功能性。因此，单独或组合进行的取代、缺失、插入、添加和/或任何其他改变可使用常规方法引入核苷酸序列中，这些改变实际上确实改变核苷酸序列但执行与起始序列相同功能，所述常规方法是有技术中已知的，例如通过定位诱变、PCR介导的诱变、转座子诱变、基因组编辑等。

一个氨基酸被具有相同或等同或相似化学/物理性质的不同的氨基酸取代称为“保守取代”或“半保守取代”。氨基酸的物理/化学性质的例子例如疏水性或带电荷性。哪种氨基酸取代表示保守或半保守取代对本领域技术人员而言是已知的。而且，一般的专门知识允许本领域技术人员识别、鉴定和检测哪些氨基酸缺失和添加对抗性蛋白的功能无害，以及在哪些位置是可行的。本领域技术人员知晓，在本发明的NBS-LRR蛋白用于修饰氨基酸(取代、缺失、插入或添加一个或多个氨基酸)的情况下，必须保留尤其是保守结构域的功能性，且因此仅有有限的上述修饰在这些结构域中是可行的。

因此，本发明包括根据本发明的核苷酸序列的功能片段。因此，术语“片段”包括具有与上述核苷酸序列足够相似的核苷酸序列的基因。术语“足够相似”是指相对于第二核苷酸序列或第二氨基酸序列，第一核苷酸序列或氨基酸序列具有足够或最少数量的相同或等同的核苷酸或氨基酸基团。

关于氨基酸序列，在通过上述方法修饰后，其也具有共同的结构域和/或具有共同的功能活性。本文中，将与根据本发明的核苷酸序列或氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少大约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约 99％或至少约100％的相同性的核苷酸序列或氨基酸序列定义为足够相似。这也明确涵盖了90％至100％的范围。对于功能片段，如果核苷酸序列或氨基酸序列通常具有与本发明的先前指定的核苷酸序列或氨基酸序列相同的性质，则建立起足够的相似性。从在整个长度上或至少部分对应于根据本发明的核苷酸序列的初始核苷酸序列直接或间接 (例如，通过扩增或复制步骤)产生编码衍生物或用于衍生的氨基酸序列的那些核苷酸序列。

因此，本发明包括在严格条件下能够和与根据本发明的核苷酸序列或编码根据本发明的氨基酸序列的核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

在另一实施方式中，根据本发明的核酸分子的特征在于，在植物中表达后，其自身已赋予针对病原体(优选针对甜菜尾孢菌属的显性抗性效果，或者其编码能够对尾孢菌属产生显性抗性效果的多肽。在优选实施方式中，该核酸分子或该多肽赋予至少一个等级评分，优选至少两个等级评分，特别优选三至四个等级评分的抗性效果。其本身使植物对尾孢菌属产生如此显著抗性或编码能够赋予此显著抗性的多肽的此类基因是本领域中未知的。如上所述，在市场上的现有品种中，尾孢菌属抗性是通过许多效果较小的抗性基因传播的，并且这些品种的一个缺点在于，由于传播复杂，因此它们的发育非常缓慢，且价格昂贵，而且在没有侵染的情况下，这些品种的作物产量明显低于正常品种。除其它外，这可能与一些抗性基因与产糖基因的表观遗传相互作用有关，这会导致在没有病原体的情况下，植物的适应性降低。

因此，本发明人首次提供了一种可用于简化育种的尾孢菌属抗性基因。通过在优良品系中加入该基因，现在可非常迅速地开发出具有高尾孢菌属抗性的非常高产量品种。因此，在本发明的框架中，首次提供了根据本发明的具有甜菜尾孢菌属抗性的甜菜植物、叶用甜菜植物(chard plant)、红甜菜或甜菜根植物、饲料甜菜植物，且上述植物因此包含在本发明中。由于列出的植物都是栽培植物，因此适合于农业栽培并且具有本发明抗性的农作物或植物是本发明的一部分。特别地，如下此类作物是本发明的一部分：其包含可用作糖的制品、原料或工业来源的地下储藏器官，并且包含根据本发明的抗性，构成本发明的另一方面。储存器官可是例如糖用甜菜的含糖甜菜体，红甜菜的可食用甜菜体或饲料甜菜的可喂食甜菜体。地下储藏器官的总和可能高达50％以上，而对于甜菜而言其总和甚至超过成年植物总质量的70％。此外，这些植物的种子或播种材料也是本发明的一部分。种子或播种材料可按如下所述进行技术处理。

在此上下文中，本发明还包括编码根据SEQ ID NO：3的蛋白的核酸，其中，在特定实施方式中，排除根据SEQ ID NO：1的天然存在的核酸。

此外，本发明涉及重组和/或异源DNA分子，其包含根据本发明的核酸分子的序列。此外，该DNA分子优选具有调控序列。因此，它可与该调控序列可操作地连接或受到该调控序列的影响。调控序列优选是启动子序列和/或转录或翻译控制元件的其他序列，例如顺式元件。控制包括本发明的核酸分子的基因的表达的调控序列，优选是而能够赋予或调节由于病原体感染造成的表达的序列。该启动子优选地能够控制特别是在植物叶中的DNA序列的表达。调控序列可与表达序列异源。这种方法的优点在于，本领域技术人员因为选择了最适合各自使用情形的调控序列，因此可更好地调节表达序列的表达率、表达发生的组织以及表达发生的时间点。异源DNA序列优选包括编码植物病原体防御的组分的核苷酸序列(例如：抗性基因(R-基因)或编码参与信号传递的酶的基因，例如激酶或磷酸酶，对于G-蛋白，或编码致病性效应子(称为无毒基因(avr)))。异源DNA 序列可是根据本发明的DNA序列中之一。异源DNA序列还可另外编码植物病原体防御的其他组分。因此，可设计异源DNA序列，使得在其转录后产生多顺反子mRNA。

本发明还涉及可由根据本发明的核酸分子编码的多肽及其功能性和/或免疫活性片段，以及与该多肽或其片段特异性结合的抗体。所述多肽特别优选地具有根据SEQ IDNo：3的氨基酸序列。蛋白质、多肽和片段的重组生产是本领域技术人员所熟悉的(Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,第三版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2001，或Wingfield，P.T.，2008，Productionof Recombinant Proteins，Current Protocols in Protein Science，52:5.0:5.0.1–5.0.4)。根据本发明的蛋白质的多克隆或单克隆抗体可由本领域技术人员根据已知方法产生(例如 Harlow等编辑，Antibodies：A Laboratory Manual(1988))。产生单克隆抗体以及同样可用于蛋白检测方法的FabF(ab')₂可通过各种常规方法进行(Goding，MonoclonalAntibodies：Principles and Practice，第98-118页，New York：Academic Press(1983))。然后，抗体可用于筛选表达cDNA文库，以便通过免疫学筛选鉴定相同、同源或异源的基因(Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989，或Ausubel等，1994，“CurrentProtocols in Molecular Biology.”John Wiley&Sons)，或可用于蛋白质印迹分析。特别地，本发明涉及抗体，所述抗体选择性地检出由根据本发明的赋予尾孢菌属抗性的等位基因编码的多肽，并且基本上不检出由相应敏感性等位基因编码的多肽，即它们检测到的由相应的敏感性等位基因编码的多肽比由根据本发明的赋予尾孢菌属抗性的等位基因编码的多肽少2倍、优选少5倍、更优选少10倍或更多倍。

在优选的实施例中，根据本发明的抗体的特征在于它是在自然界中不存在的合成多肽。

此外，根据本发明的抗体可与荧光染料连接，以便可用于例如免疫组织化学方法中，并引起抗体染色。荧光染料可是荧光色素。根据本发明的抗体也可与其他信号分子连接存在。其中包括例如生物素、放射性同位素、报告酶(例如碱性磷酸酶)或寡核苷酸。

本发明的另一主题是载体或表达盒，其包括根据本发明的核酸分子或重组DNA分子-这些分子可能在调控元件的控制下，并且尤其在植物中的功能性调控元件的控制下，所述载体或表达盒还包括阴性和/或阳性选择标记。因此，载体主链与根据本发明的核酸分子是异源的，这意味着此类载体在自然界中不存在，并且不能从自然界中分离出来。载体是质粒、粘粒、噬菌体或表达载体、转化载体、穿梭载体或克隆载体；它可是双链或单链，线性或环状；或者它可通过整合到其基因组中或在染色体外转化原核或真核生物体。在表达载体或表达盒中的根据本发明的核酸分子或DNA分子优选地与一种或多种调控节序列可操作地连接，所述调控序列允许在原核或真核细胞中转录和任选地表达；(Sambrook等，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，2001)。这些调控序列优选是启动子或终止子，特别是转录起始起点、核糖体结合位置、RNA加工信号、转录终止位置和/或聚腺苷酸化信号。例如，核酸分子在这里处于适合的启动子和/或终止子的控制之下。适合的启动子可是组成型启动子(例如：来自花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus)的35s 启动子(Odell等，Nature 313(1985)，810-812)；病原诱导的那些启动子尤其适合(例如：来自欧芹的PR1启动子(Rushton等，EMBO J.15(1996)，5,690-5,700))。特别适合的病原诱导型启动子是自然界不存在的合成或嵌合启动子，其由多种元件组成，并含有最小启动子，并且在最小启动子上游具有至少一个顺式调控元件，其中至少一个顺式调控元件用作特殊转录因子的结合位置。嵌合启动子根据需求设计，并通过不同的因子加以诱导或抑制。这种启动子的实例存在于WO 00/29592、WO 2007/147395和WO 2013/091612 中。例如，适合的终止子是是nos终止子(Depicker等，J.Mol.J.Mol.Appl.Genet.1(1982)， 561-573)。适合的启动子和终止子也可是天然启动子和天然终止子，其DNA序列复制在SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8中。载体或表达盒另外包含常规指示/报告基因或抗性基因，以用于检测所需载体或DNA分子/核酸分子的转移，以及用于选择包含载体或 DNA分子/核酸分子的个体，因为通过基因表达进行直接检测多半相当困难。

由于根据本发明的核酸分子此处本身编码赋予尾孢菌属叶斑病抗性的多肽，对于在植物细胞中的表达提供额外的抗性基因不是必需的；然而，为允许快速选择，建议采用这种方法。

指示/报告基因的实例例如为荧光素酶基因和编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因。此外，这些指示/报告基因还允许测试基因启动子的活性和/或调控。抗性基因-特别是用于植物转化-的实例是新霉素磷酸转移酶基因、潮霉素磷酸转移酶基因，或编码膦丝菌素乙酰转移酶的基因。另外的阳性选择标记可是酶，其相对于未转化植物提供转化植物选择的优势-特别是营养优势，例如甘露糖-6-磷酸异构酶或木糖异构酶。然而，这并不排除本领域技术人员已知的其它的指示/报告基因或抗性基因。在优选的实施例中，载体是植物载体。此外，表达盒可整合到植物基因组中的形式存在。

另一方面，本发明涉及包括根据本发明的载体、重组DNA分子和/或核酸分子的细胞。本发明意义上的细胞可是原核细胞(例如，细菌)或真核细胞(例如，植物细胞或酵母细胞)。所述细胞优选为农杆菌，例如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)细胞或植物细胞；所述植物细胞特别优选为甜菜属植物、甜菜物种或甜菜亚种的细胞。细胞也可作为培养物存在。因此，本发明还包括了含有这种细胞的细胞培养物。所述细胞培养物优选是纯培养物或不含其它类型细胞的分离物。

本领域技术人员已知的是多种方法，例如缀合或电穿孔，利用这些方法，他可将根据本发明的核酸分子、重组DNA分子和/或本发明的载体或表达盒引入农杆菌中，以及诸如各种转化方法的方法(生物转化、农杆菌介导的转化)，利用这些转化方法，他可将根据本发明的核酸分子、DNA分子和/或本发明的载体引入植物细胞中(Sambrook等， MolecularCloning：A Laboratory Manual，3rd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press， ColdSpring Harbor，NY，2001)。

此外，本发明优选涉及一种包含根据本发明的赋予尾孢菌属抗性的核酸分子的抗尾孢菌属植物，优选为甜菜亚种植物或其部分。该抗尾孢菌属植物可包含根据本发明的核酸分子作为转基因或作为内基因体。在本发明的范围内，首次产生了含有根据本发明的核酸分子的甜菜亚种植物。本发明还包括甜菜亚种植物，其包含根据本发明的核酸分子作为内基因体。

因此，一部分可以是细胞、组织、器官或多个细胞、组织或器官的组合。多个器官的组合是例如花朵或种子。本发明的抗尾孢菌属植物比不含根据本发明核酸分子的相应植物(对照植物)对尾孢菌属，尤其是甜菜尾孢菌，表现出更高的抗性。理想情况下，该对照植物与转基因植物具有相同的基因型，并且在相同的条件下进行培养，但不包含赋予抗性的核酸分子。通过测定等级评分，可以定性地确定甜菜属植物的抗性水平，例如对甜菜尾孢菌的抗性水平。更高的抗性表现为抗性改善至少一个等级评分、至少两个等级评分，优选至少三个或更多个等级评分。

包含根据本发明的核酸分子的本发明的植物细胞或植物或其部分-特别是甜菜属植物，与不含有根据本发明的核酸分子或含有核酸分子的敏感性等位基因变体的相应的植物细胞或植物或其部分相比，优选显示对病原体特别是对甜菜尾孢菌具有较高的抗性。通过测定等级评分，可以定性地确立甜菜属植物的抗性水平，例如对甜菜尾孢菌的抗性水平。更高的抗性表现为抗性改善至少一个等级评分、至少两个等级评分，优选至少三个或更多个等级评分。

在转基因植物细胞或植物或其部分的情况下，其包含根据本发明的核酸分子或DNA 分子作为转基因或本发明的载体或表达盒。这种转基因植物细胞或植物或其部分例如是优选用根据本发明的核酸分子、DNA分子或用本发明的载体或表达盒稳定转化的。在优选的实施例中，核酸分子与一种或多种调控序列可操作地连接，所述调控序列允许在植物细胞中转录和任选地表达。然后，由根据本发明的核酸分子和调控序列组成的总结构代表转基因。此类调控序列例如是启动子或终止子。本领域技术人员已知适用于植物的许多功能性启动子和终止子。

本发明还包括根据本发明的细胞的液泡，以及存储在其中的内容物。

此外，本发明还涉及来自细胞的细胞提取物，细胞优选植物细胞，尤其优选甜菜细胞，并且特别优选来自以下作物之一的细胞：糖用甜菜、叶用甜菜(chard)或甜菜根。从细胞提取物不能再生任何植物。

本发明同样包括含有根据本发明的核酸的植物基因组。不能从植物基因组再生植物。

因此，细胞提取物的糖浓度可相对于不是根据本发明的细胞但属于相同物种或作物的细胞有所增加。这尤其适用于被尾孢菌属感染的情况。

本发明还涵盖细胞提取物用于生产糖(蔗糖)或用于生产汁(优选甜菜根汁)的用途。

本发明还涵盖根据本发明的细胞及其液泡中所含的糖，尤其是蔗糖。

本发明的另一方面是原种，其包含含有根据本发明的核酸的种子。根据本发明的核酸分子可以是转基因或内源性存在的。原种和种子可经过技术处理。因此，本发明还包含技术处理过的原种和技术处理过的种子。以下详细说明了技术处理过的原种的各种实施例，其中术语原种也包括种子。技术处理过的原种可抛光的形式存在。种子的最外层因此被去除，使得种子呈现更圆的形式。这在播种中很有帮助，在播种时，最佳的均匀形状导致原种颗粒的均匀分布。经过技术处理的原种还包括粒化的原种。藉此将原种埋入粒化物质(pelleting mass)中，以保护其中所含的原种并导致更大的质量，从而使粒化的原种对风漂移表现出更大的抵抗能力，因此不易被风吹跑，同时可在播种过程中实现更精确的定位。在本发明的优选实施例中，指定出售的批次或单位的所有粒化原种谷粒具有基本相同的形状和相同的质量。直径和质量的偏差可为5％。然而，偏差优选不超过1％。作为主要组分之一，粒化团块可包含例如矿物化合物，诸如粘土、膨润土、高岭土、腐殖质和/或泥炭。可添加像聚丙烯酰胺此类粘合剂材料。在US 4,067,141中引用了其他可能的组分。此外，粒化团块可包含在实践中对栽培产生积极影响的其它化学试剂。这些可能是计入施肥剂的物质。其中包括富含以下一种或多种元素的化合物：氮、磷和钾(大量营养素)。因此，施肥成分可包含例如硝态氮、铵态氮、硝酸镁、硝酸铵钙、磷酸一铵、磷酸一钾和硝酸钾。此外，粒化团块可能含有杀菌剂，杀虫剂和/或拒食剂。杀菌剂可是福美双(thiram)和/或恶霉灵(hymexazol)和/或其它杀菌剂。杀虫剂可能是新烟碱类物质。新烟碱类的物质优选为吡虫啉(ATC代码：QP53AX17)和/或噻虫胺(CAS号： 210880-92-5)。此外，杀虫剂还可是氟氯氰菊酯(CAS号：68359-37-5)、高效氟氯氰菊酯或七氟菊酯。值得一提的是，包含在拌种剂或粒化物质中的化合物被植物吸取并显示出全身作用，从而对整株植物提供适当的保护。因此，由包含一种或多种杀虫剂的粒化种子产生的植物与天然植物不同，并且在生物胁迫条件下显示出更好的性能。在这一背景下，本发明还包括根据本发明的粒化物质和种子的混合物。此外，本发明还包括用于生产根据本发明的粒化种子的方法，其包括以下步骤：

a)提供包含根据本发明的核酸的糖用甜菜植物种子，

b)将所述糖用甜菜植物种子埋入粒化物质中，

c)允许粒化物质干燥，其中所述种子可任选地是经预备的(primed)或预发芽的种子，或者可允许所述种子在步骤b)期间预备。

粒化原种是经拌种的原种的特定实施例。在这一背景下，经过技术处理的原种也包括经拌种的原种。然而，本发明不限于粒化原种，而是可任何形式的经拌种的原种施用。因此，本发明还涉及经拌种的原种，其包括粒化原种，但并不限于此。因此，还包括干拌种、湿拌种和悬浮拌种。因此，所述拌种剂还可包含至少一种染料(染色)，使得所述经拌种的原种可与未经拌种的原种快速区分开，而且确保在播种后在环境中有良好的可见度。拌种剂还可包含在粒化物质的上下文中描述的那些农用化学品。因此，本发明包括这样经拌种的原种，藉此所述拌种含有至少一种抗食剂，例如杀虫剂和/或至少一种杀真菌剂。任选地，可采用所谓的电拌种(通过施加电能进行拌种)。但是，电拌种并不是严格意义上的拌种。

经过技术处理的原种的另一种形式是包壳原种。在这种情况下，也提出了所谓的包衣以及用包衣处理的原种。与粒化原种的区别在于，籽粒保持其原始形状，其中该方法特别经济。例如，该方法描述于EP 0 334 258 A1中。经过技术处理的原种的另一种形式是发芽或经预备的原种。发芽原种通过催芽进行预处理，而经预备的原种已通过预备 (“萌芽”)进行预处理。催芽和经预备的原种优势在于出苗时间短。同时，播种后出苗的时间点更加同步。这使得在栽培过程中，尤其是在收获过程中，能够更好地进行农业技术加工，此外，还增加了产量。催芽时，原种发芽直到胚根离开原种外壳，随后停止该过程。在引发时，在胚根离开原种外壳之前停止该过程。与催芽的原种相比，已过引发的原种对再干燥的压力不敏感，并且在再干燥之后，与催芽的原种相比，其存储寿命更长，催芽的原种通常不建议再干燥。在这种情况下，经过技术预处理的原种还包括引发的和再干燥的原种。催芽的过程在US 4,905,411 A中进行了说明。在EP 0 686 340 A1 中说明了引发的各种实施例。除此外，还可在一个过程中同时进行粒化和预备原种。该方法描述于EP 2 002 702 B1中。本发明包括此外进行粒化的经预备的原种。

经技术处理的原种可另外提供一种或多种上述除草剂抗性。这允许进一步改善农业技术栽培，因为经过技术处理的原种可部署在以前用除草剂处理过而因此无杂草的田地上。

除此外，本发明还包括含有根据本发明的原种或根据本发明的种子和如上定义的拌种的混合物。因此，拌种团块优选实施为如上所述的粒化团块。

对于根据本发明的原种的储存，优选选择不会对原种的稳定性或储存寿命产生负面影响的储存条件。湿度的波动在这里尤其会产生不利影响。本发明的一部分是一种通过同时防水和透气的袋子或容器将原种储存在其中的方法。这种袋子或容器可设计为纸盒或包装。这种纸盒或包装可任选地具有内部水气阻挡层。如果将纸盒或包装设计为双层纸箱，则其稳定性会增加。包含根据本发明的原种或根据本发明的技术处理过的原种的容器、袋、纸盒或包装同样是本发明的一部分。同样，将根据本发明的原种或根据本发明的技术处理过的原种储存在此类袋、容器、包装或纸盒中也是本发明的一部分。

在一个实施方式中，根据本发明的植物是杂交植物或双单倍体植物。杂交植物和双单倍体植物不会在自然界出现，也无法从自然界中分离。在根据本发明的植物的另一实施方式中，根据本发明的核酸分子以杂合或纯合形式存在。就杂合植物而言，核酸分子也可能以半合形式存在。本发明还涵盖含有根据本发明的核酸分子或根据本发明的多肽的杂交种子和双单倍体种子。

本发明的另一实施方式包含植物，优选甜菜物种，其特征在于该植物中对尾孢菌属的抗性进一步增加。例如，这可通过“基因叠加”来实现，即使用这种剂量效应来增加抗性。为此，含有赋予尾孢菌属抗性的等位基因的根据本发明的植物用此抗性等位基因过度转化，以增加植物中基因的转录量。替代途径包括基因编辑/定点诱变或TILLING 介导修饰赋予抗性的等位基因的天然启动子以提高其表达率，或修饰赋予抗性的LRR 基因的等位基因本身以提高其活性或稳定性。例如，通过修饰抗性基因来增加活性的此类方法在WO2006/128444 A2中描述，并且可以通过本领域技术人员已知的技术实现。额外途径可包括使根据本发明的核酸分子与表现出比天然启动子更高的活性(尤其是在感染尾孢菌属后)的异源启动子融合。

本发明的另一实施方式涉及糖用甜菜植物或此类植物的粒化种子，所述植物在抽苔之前是可收获的，因为在第一个10、11、12、13、14或15个月期间没有甜菜植物没有发生抽苔，甜菜体的发育在此期间完成。

在本发明的一个实施方式中，糖用甜菜植物或此类植物的粒化种子具有基因组，其允许甜菜体发育成其质量总和达到成熟植物的总质量的至少50％、60％、70％、80％或甚至90％。

在本发明的另一实施方式中，甜菜植物或此类植物的粒化种子具有基因组，其允许甜菜体通过光合作用发育成具有最小质量为200g、250g、300g、350g、400g、450g 或500g，以及具有最大质量为100g、1100g、1200g、1300g、1400g、1500g、1600g、 1700g、1800g、1900g或甚至2000g。

本发明的另一实施方式涉及糖用甜菜植物或此类植物的粒化种子，其中糖用甜菜植物的基因组允许甜菜体发育成具有至少10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或甚至20％的蔗糖浓度。

在本发明的一个实施方式中，甜菜植物或此类植物的粒化种子包括相对于SEQ IDNO：4的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少十个、至少二十个或甚至至少三十个突变。

产生包含根据上述给定实施方式[1]的核酸分子的突变形式和/或包含由以下组成的核酸序列的启动子的突变形式的生物体的方法：(a)SEQ ID NO：7、(b)在严格条件下与和根据(a)的序列互补的序列杂交的核苷酸序列，以及(c)与根据SEQ ID NO：7的序列至少70％相同的核苷酸序列，其中方法包括以下步骤：

(I)提供包含核酸分子和/或启动子的生物体或细胞；

(II)增加生物体或细胞的突变率或

生物体或细胞的诱变；

(III)对生物体进行表型选择，所述生物体由于突变而表现出对甜菜尾孢菌的改变的抗性或改变的抗性水平，或对生物体或细胞进行基因型选择，所述生物体或细胞包含核酸分子和/或启动子中的突变，其中，所述突变是通过步骤(II)产生的；

以及，任选地

(IV)从通过步骤(III)获得的细胞再生生物体。

生物体可是植物。优选地，所述植物是甜菜。但是，也可使用单细胞生物如细菌。这种细菌可是大肠杆菌。如果生物体是植物，则该方法可在体内和体外应用。如果生物体是植物并且该方法在体外应用，则可建立植物的细胞培养物，并且可在细胞培养物中提高突变率或诱变。提高突变率包括例如使用诱变剂，例如5-溴尿嘧啶或甲基磺酸乙酯(EMS)，或使用物理诱变剂，例如电离辐射或紫外线。诱变还包括靶向诱变。可通过如基因编辑的精确的方法来实现靶向诱变(如下文进一步解释)。在细胞生物学的各种标准参考文献中解释了从细胞中再生生物体。例如在标准参考文献“Plant biotechnology： comprehensivebiotechnology，第二增刊”(Michael W.Fowler，Graham Warren，Murray Moo-Young-Pergamon Press-1992)中对植物的再生进行了说明。在Lindsey&Gallois“Transformation of sugarbeet(Beta vulgaris)by Agrobacterium tumefaciens”Journal of experimental botany 41.5(1990)：529-536中描述了从细胞培养物再生甜菜。

这些参考文献还描述了如何建立植物细胞培养物。如以上进一步解释的，核酸分子和启动子各自的突变形式优选地由于赋予抗性的核酸分子的表达率由于突变而增加)而自我表现。这种效应也可依赖于几个突变的存在。例如，可在启动子或核酸分子中引入两个、三个、四个、五个或更多个突变。

通过引入突变，可在细胞中构建赋予更多抗性的蛋白质或蛋白质具有更好的效果。因此，与包含根据本发明的未改变的核酸的对照植物相比，抗性可增加例如至少1％、2％、3％、4％、5％或更多。可如下文进一步所述测量这一增长。此外，由于一个或多个突变引起的抗性可增加至少一个评级分数。评级分数的确定在本文的其他地方进行了说明。此外，抗性蛋白质可-由于突变-而赋予改变的作用，并且在某些情况下可对本身已适应初始抗性机制的此类病原体表现出作用。在这种情况下，本发明还包括根据本发明的核酸的这种突变体和根据本发明的蛋白质的突变体。优选地，本发明包括此类变体，其在自然界中不存在并且不能从自然界中分离，以确保病原体没有机会使其自身适应此类变体。上述用于产生包含核酸分子的突变形式的生物体的方法还可包括另外的步骤，其中鉴定那些由于一个或多个突变而具有进一步增加的抗性的那些生物体或各自的植物。如果抗性已增加，则可通过本文所述的评级分数或测量抗性水平来确定。

除上述用于产生包含核酸分子或启动子的突变形式的生物体的方法外，还可在分离状态下化学修饰相应的核酸，以实现所需的效果(例如如上所述)。此途径的优势是可以更精确地编辑化合物。为此，提供以下方法：

产生根据上述给定实施方式[1]的化学修饰的核酸分子和/或包含选自以下的核苷酸序列的化学修饰的启动子：

(a)SEQ ID NO：7；

(b)在严格条件下与根据(a)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

(c)与根据SEQ ID NO：7的序列至少70％相同的核苷酸序列；

其中所述方法包括以下步骤：

(I)以分离形式提供上述核酸分子；

(II)通过以下步骤之一对核酸分子或启动子进行化学修饰：

(IIa)诱变，

(IIb)基因编辑，

(IIc)分别限制和连接，插入或缺失。

此外，在等位基因变体的情况下，可通过如本文其它地方所述的方法产生化学修饰。在步骤(II)中给出的基因编辑等于术语“基因组编辑”。任选地，所述化学修饰的核酸分子或所述化学修饰的启动子可随后引入细胞中或进行稳定地整合。在这种细胞的帮助下，化学修饰的核酸分子和修饰的启动子可在细胞增殖的背景下繁殖。随后可将它们大量分离，并可进行表达分析。当化学修饰涉及启动子时，表达分析特别适合。可收获细胞并分离化学修饰的抗性蛋白以进行化学分析。如果包含化学修饰的核酸分子或修饰的启动子的细胞是植物细胞，则可从该细胞中再生出完整的植物。在本段中描述的方法可在上面给出的用于产生核酸分子的修饰形式和/或修饰的启动子的方法之后进行，并且所获得的变体也是本发明的一部分。此外，包含化学修饰的核酸分子或修饰的启动子的植物也是本发明的一部分。因此，本发明还涉及通过该方法获得的植物。此外，本发明还涉及通过该方法获得的化学修饰的核酸分子和所编码的多肽。这些化合物可是原始(未修饰的)化合物的优化版本，其中所获得的抗性水平(如上文进一步解释的)可增加至少 1％、2％、3％、4％、5％或更多百分比，或者可增加至少一个评级分数。在这方面，用于产生化学修饰的核酸分子的方法也是用于优化核酸分子的方法。优化的方法还可包含另外的步骤，其中鉴定核酸分子的那些修饰的变体，与未修改的变体相比，修饰的变体导致植物中的抗性增加。

在另一实施方式中，本发明的植物还转基因或内源性地包含位于基因组中不同位置的第二核酸分子，其编码多肽，该多肽能够赋予表达该多肽的植物尾孢菌属抗性。例如，现有技术中描述的一个或多个抗性基因或抗性基因座可通过杂交、转化、同源定向修复或同源重组的方式引入本植物中，只要它们在初始基因型中尚未存在。其中包括例如甜菜丛根病抗性RZ1(Lewellen，R.T.，I.O.Skoyen，以及A.W.Erichsen，“Breeding sugar beetfor resistance to rhizomania：Evaluation of host-plant reactions and selectionfor and inheritance of resistance”，50th Winter Congress of the InternationalInstitute for Sugar Beet Research，Brussels(Belgium)，Feb.11-12，1987IIRB.Secretariat General，1987)，或甜菜丛根病抗性RZ3(WO 2014/202044)。

本发明还涉及一种用于增强甜菜物种植物对尾孢菌属抗性的方法，其中，与同基因植物相比，抗性的提高是在没有根据本发明的赋予抗性地基因的情况下发生的。

可以通过将根据本发明的核酸分子整合到甜菜物种植物的至少一个细胞的基因组中，以及可由该植物细胞再生植物，来提高抗性。整合可以通过有性杂交(例如与上述海甜菜之一)和随后的选择步骤，以及通过同源定向修复或同源重组进行。所引用的后两种方法优选由定点核酸酶支持，其可选自但不限于以下各项：CRISPR核酸酶，包括 Cas9、CasX、CasY或Cpf1核酸酶、TALE核酸酶、锌指核酸酶、归巢内切核酸酶、Argonaut 核酸酶、限制性内切酶(包括FokI或其变体)、重组酶，或两种位点特异性切刻内切酶。

实施例1中示出了通过CRISPR介导的同源重组而将赋予抗性的基因引入甜菜亚种中。

替代途径包括增加根据本发明的核酸分子在植物中的表达。这可通过修饰天然启动子而实现，这可通过修饰天然启动子进行，其中所述修饰优选通过基因编辑或定点诱变(其通过定点核酸酶介导)和任选的修复模型进行。上文已列举这种核酸酶的例子。使核酸分子与异源启动子融合可同样提高根据本发明的核酸分子的表达，所述异源启动子相较于天然启动子特别是在感染尾孢菌属后表现出更高的活性。融合同样可通过定点核酸酶和修复模型进行，也可通过在双链断裂后直接插入进行。

如上所述，通过修饰根据本发明的核酸分子的核苷酸序列，用于增加尾孢菌属抗性的方法也可导致增加根据本发明的多肽的活性和/或稳定性。例如，通过对抗性基因进行修饰而提高活性的此类方法在WO 2006/128444 A2中描述，并且可通过本领域技术人员已知的技术进行。下面将详细说明这种方法。

或者，可通过对敏感性基因的核酸序列进行随机或定向诱变，由尾孢菌属敏感性基因型产生尾孢菌属抗性基因型，从而可提高尾孢菌属抗性。图1中呈现了区分敏感等位基因与抗性等位基因的多态性示例。

例如，敏感性等位基因可通过基因突变来修饰，所述基因突变通过TALE核酸酶(TALEN)或锌指核酸酶(ZFN)以及CRISPR/Cas系统进行，CRISPR/Cas系统在WO 2014/144155A1(使用CRISPR/Cas系统工程化植物基因组(Engineering plant genomes using CRISPR/Cas systems))和Osakabe&Osakabe，plant Cell Physiol.，56(2015)，389-400 中以实例的方式进行了描述。这也可通过使用命名为TILLING(定向诱导基因组局部突变技术，Targeted Induced Local Lesions in Genomes)的方法来实现，其中例如在德国专利申请DE 10 2013 101 617中描述了如何在敏感基因中引起点突变，然后选择表现出适合的(赋予抗性的)突变的植物，例如，对黄花叶病毒具有抗性的大麦；参见DE 10 2013 101 617第4、8和12页，第[0014]、[0026]和[0038]段。TILLING方法也详细描述于Henikoff 等的出版物中(Henikoff等，Plant Physiol.135，2004，630-636)。

这些方法优选地导致抗性提高至少一个评级分数，特别优选地，提高至少两个、三个或更高的评级分数。在诱变植物细胞随后从诱变的植物细胞再生植物后，或在诱变植物后，可鉴定在内源性核酸分子中表现出一种或多种突变的植物，如图1所示。在这一背景下，已提及的根据本发明的植物的特征在于抗性提高至少一个评级分数，优选提高至少两个或更高的评级分数。或者，与对照植物相比，根据本发明的植物的抗性可增加例如至少1％、2％、3％、4％、5％或更多，所述对照植物不包含根据本发明的核酸。可通过在一个健康的叶子上分别接种病原体的分离物并在15天后确定受感染的表面来测量所述增加。受侵染表面减少5％对应于抗性增加5％。可从下面给出的实施例“抗性测试”中得出用于进行测量的其它参数。

本发明的另一实施方式是一种用于产生抗尾孢菌属植物的方法，该方法可通过以下步骤来实现：用根据本发明的核酸分子、重组DNA分子，或用载体或表达盒转化植物细胞，以及由该转化的植物细胞再生转基因植物(参见实施例2)，以及如上所述，通过对敏感性基因的核酸序列进行随机或靶向诱变来产生尾孢菌属抗性基因型，或通过杂交和筛选，例如使用上述海甜菜中的一种。上文已经对载体或表达盒，以及用于转化植物的方法进行了描述。

如上所述，用于产生抗尾孢菌属植物的方法还可包括：将定点核酸酶和修复基质引入甜菜物种植物的细胞中，其中，该定点核酸酶能够在该细胞的基因组中，优选目标区域的上游和/或下游，产生至少一个DNA双链断裂，并且该修复基质包含根据本发明的核酸分子。该方法还包括在允许进行同源定向修复或同源重组的条件下培养该细胞，其中，该核酸分子从修复基质并入该植物的基因组中。此外，还包括由经修饰的植物细胞再生植物(参见实施例1)。

在优选实施方式中，该目标区域是根据本发明的核酸分子的等位基因变体，其中，该等位基因变体编码不赋予尾孢菌属抗性的多肽。在另一优选实施方式中，该等位基因变体包含编码具有根据SEQ ID NO：6的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，且/或包含根据SEQID NO：5的编码DNA序列或根据SEQ ID NO：4的基因组DNA序列。

如结合根据本发明的核酸分子所述，可引入取代、缺失、插入、添加和/或任何其它改变，其单独或以组合的形式改变核苷酸序列，但执行与初始序列(在这里是指根据本发明的核酸分子的等位基因变体的核苷酸序列)相同的功能。因此，在另一实施方式中，本发明包括编码多肽的核苷酸序列，该多肽表示由根据本发明的核酸分子的等位基因变体编码，或包含根据本发明的核酸分子的等位基因变体的氨基酸序列的多肽的衍生物。衍生的氨基酸序列(其具有一个或多个氨基酸的至少一个取代、缺失、插入或添加，其中，保留所编码的多肽/蛋白的功能)表示该多肽的衍生物。因此可使用现有技术中已知的常规方法，例如通过定点诱变、PCR介导的诱变、转座子诱变、基因组编辑等，通过取代、缺失、插入、添加和/或任何其它变化(以单独的方式或与基因组合的方式)引入核苷酸序列，从而改变该核苷酸序列，但执行与初始序列相同的功能。

关于氨基酸序列，在通过上述方法进行修饰后，其也具有共同的结构域和/或具有共同的功能活性。与根据本发明的核酸分子的引用等位基因变体的核苷酸序列或氨基酸序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％相同的核苷酸序列或氨基酸序列在此定义为充分相似。因此，本发明包括能够在严格条件下与根据本发明的核酸分子的等位基因变体的核苷酸序列或编码相应氨基酸序列的核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

在另一优选实施方式中，根据本发明的方法的特征在于，双链断裂发生在根据实施方式[1]的核酸分子的等位基因变体中，或者该至少一个双链断裂发生在该等位基因变体上游或下游的至少10000个碱基对的位置处，其中，该等位基因变体编码不会赋予尾孢菌属抗性的多肽。

对于本领域技术人员而言，显而易见的是，可能会出现许多不同的敏感性序列，这些序列源于根据本发明的核酸分子，但不会赋予对尾孢菌属的抗性，因此上述序列(SEQ IDNos.4、5、6)应仅被视为序列的实例，且本发明并不限于根据本发明的核酸分子的上述等位基因变体。此类等位基因变体可包含选自以下各项的核苷酸序列：

(a)编码具有根据SEQ ID NO：6的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；

(b)包含根据SEQ ID NO：5的DNA序列的核苷酸序列；

(c)包含根据SEQ ID NO：4的DNA序列的核苷酸序列；

(d)在严格条件下与根据(a)、(b)或(c)的序列的互补序列杂交的核苷酸序列；

(e)编码通过取代、缺失和/或添加氨基酸序列的一个或多个氨基酸而与由根据(a)、 (b)或(c)的核苷酸序列编码的多肽不同的多肽的核苷酸序列；

(f)编码具有与根据SEQ ID NO：6的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；

(g)与根据SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的DNA序列至少70％、75％、80％、 85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列；

如上所述，通过QTL的数量遗传，不仅常会将期望抗性引入植物中，而且还经常会将不期望的特征(例如，产量降低)引入到植物中，因为遗传了与抗性的正向特征不相关的其它基因。如果像尾孢菌属抗性一样，抗性是通过许多抗性基因在之前可获得的品种中遗传的，并且影响很小，则这种情况就会越来越多地发生。因此，在优选实施方式中，根据本发明的核酸分子的引入(其本身已显示出显性抗性效果)或载体或表达盒的引入与不期望的特征的引入无关，其中，产量优选不受负面影响。此外，本发明包括通过这种方法获得的植物。

尽管使用先前现有技术已知的QTL分析可以检测实际的QTL，但显示QTL效应的潜在基因组区域也介导了上述缺点，这就是为什么在本文中还讨论了“连锁累赘”。同时，QTL及其相关效果在各自的现有技术中没有统一的描述，只是介导了微弱的效果，因此这些结果在抗尾孢菌属植物育种中的使用可能仅在有限的范围内，并且在很大程度上是不确定的。现在，通过鉴定本文所述的抗性基因，可以将抗性基因定向育种并控制整合到甜菜基因库中。这确保了培育和产生全新的尾孢菌属抗性品种，这些品种表现出对病原体的高度抗性，而不会对糖产量产生负面影响。

本发明同样涉及用于鉴定并且可能提供对病原体尾孢菌属具有抗性的甜菜物种植物的方法，其特征在于，该方法包括在该植物或其样品/部分中检测根据本发明的核酸分子或根据本发明的多肽的存在和/或表达的步骤。根据本发明的核酸分子或根据本发明的多肽的存在和/或表达可通过本领域技术人员已知的标准方法，例如通过PCR、RT-PCR、或蛋白质印迹法来测试。

此外，根据本发明的鉴定方法还包括：使用检测一种或多种多态性的分子标记，通过检测抗性序列和敏感性序列之间(即，上述根据本发明的核酸分子的序列和根据本发明的核酸分子的等位基因变体的序列之间)的至少一种多态性，来检测根据本发明的核酸分子。如上所述，对于本领域技术人员来说，显然存在许多敏感性序列，即许多编码根据本发明的核酸分子的等位基因变体的序列。其中一个通过与图1所示的根据本发明的核酸分子的核苷酸序列进行序列比对中以实例的形式呈现。因此，根据本发明的方法的优选实施例包括使用检测多态性-特别是诊断多态性的分子标记检测图2中呈现的至少一种多态性。该检测优选每个多态性(特别是每个诊断多态性)使用至少一个分子标记进行。本领域技术人员知道应用哪些标记技术来检测相应的多态性，以及为此如何构建分子标记(参见Advances in Seed Science and Technology，第I卷，Vanangamudi等，2008)。此外，本发明包括描述或检测根据图1的多态性的分子标记，例如使用用于检测根据图 1的多态性的分子标记。因此，也可以使用不区分各种多态性的标记，只要这些标记能够检测根据本发明的核酸分子中发生，而敏感性等位基因变体中不发生的这种多态性。

或者或此外，根据本发明的鉴定方法包括在根据本发明的核酸分子的核苷酸序列中或在其共分离区中检测至少一个标记基因座的步骤。优选地，该共分离区是甜菜中与根据本发明的多肽赋予的尾孢菌属抗性或根据本发明的核酸分子共分离的基因组区，更优选地，该共分离区包括或侧翼为标记sxh0678s01和s4p0264s01、标记s4p4301s01和s4p2271s01、标记s4p4301s01和s4p4293s01，或标记s4p4301s01和s4p4295s01。因此，检测可通过将至少一个标记或至少一个引物对结合在根据SEQ ID NO：74或75的基因座处(优选根据SEQ ID NO：76或77的基因座处)，以及可选的由此产生信号(例如荧光信号或序列扩增)的方法步骤进行。因此，或者或此外，该共分离区可包括根据SEQ ID NO 74和/或75或SEQ ID NO：76和/或77的序列。此外，前述鉴定方法还表示用于选择显示出根据本发明的尾孢菌属抗性的植物的方法。该选择方法包括选择抗性植物的最终步骤。

在此背景下，本发明还包括开发或产生适用于检测根据本发明的核酸分子(抗性等位基因)和敏感性等位基因变体之间的上述多态性的分子标记，其中，该标记优选适用于检测图1中呈现的多态性，或构建与根据本发明的核酸分子的核苷酸序列特异性结合的杂交探针，或产生适用于在PCR(对根据本发明的核酸分子具有特异性的区域)中扩增，并因此用于在植物或植物细胞中进行检测的一对核酸分子。

本发明优选包括一种用于产生长度为至少15、16、17、18、19或20，优选至少21、22、23、24或25，特别优选至少30、35、40、45或50，尤其优选至少100、200、300、 500或1000个核苷酸的寡核苷酸的方法，该寡核苷酸与根据本发明的核酸分子或与其互补的核酸分子的核苷酸序列特异性杂交；或包括一对核酸分子(优选为寡核苷酸形式)，其适于作为正向和反向引物附着到与根据本发明的核酸分子具有特异性的区域，以及用于在聚合酶链反应(PCR)中进行扩增，或者其适于作为正向和反向引物杂交至甜菜基因组中与由根据本发明的多肽赋予的尾孢菌属抗性或与根据本发明的核酸因子共分离的区域中。SEQ ID NO 98和SEQ ID NO 99给出了用于检测根据本发明的抗性介导核苷酸序列的合适引物的实例。这两个序列构建了一个可用于PCR的引物对。

用于产生寡核苷酸的方法最初包括：将根据本发明的核酸分子的核苷酸序列与不赋予抗性的相应核酸分子或敏感性等位基因变体的核苷酸序列(其优选具有根据SEQ IDNO：4或5的核苷酸序列)进行比对；鉴定这两个核苷酸序列之间的序列差异；以及产生与根据本发明与核酸分子特异性结合，但不与不介导抗性的核酸分子结合的核酸分子 (这里指的是寡核苷酸)。

此外，根据本发明的寡核苷酸可与荧光染料连接，以便在例如通过相应波长的光的激发下产生荧光信号。荧光染料可是荧光色素。根据本发明的寡核苷酸可与适于产生信号的其它化合物偶联。这种寡核苷酸在自然界中并不存在，也不能从自然界中分离出来。执行以下操作以产生这样标记的寡核苷酸：DNA可进行生物正交标记。为此，可在体内或体外用核苷类似物标记DNA，其随后可例如在每个Staudinger反应中与荧光团偶联。除此外，DNA还可能通过化学方式提供荧光团。寡核苷酸可用例如用于QPCR、 DNA测序和原位杂交中的荧光团通过亚磷酰胺合成来标记。此外，DNA可在与荧光核苷酸的聚合酶链式反应过程中酶促产生，或者用连接酶或末端脱氧核苷酸转移酶标记。还可通过生物素化和荧光抗生物素蛋白间接检测DNA。为偶联，荧光素、荧光镧系元素、金纳米粒子、碳纳米管或量子点等被用作荧光团。最常用的荧光物质之一是FAM(羧基荧光素)。因此，本发明包括寡核苷酸以及特别是具有FAM标记的引物。FAM优选地以6-FAM的形式存在，其中，根据发射和激发的期望波长，也可使用其它FAM变体，例如5-FAM。其他荧光标记的例子是AlexaFluor、ATTO、Dabcyl、HEX、Rox、TET、 Texas Red和Yakima Yellow。根据使用领域的不同，可提供修饰了碱基或糖磷酸骨架的寡核苷酸。其中包括氨基-dT、叠氮-dT、2-氨基嘌呤、5-Br-dC、2'-脱氧肌苷(INO)、3'- 脱氧-A,C,G、5-Met-dC、5-OH-Met-dCN6-Met-dA等。

此外，本发明还涉及一种标记芯片(“DNA芯片”或微阵列)，其包含适于检测的根据本发明的至少一种寡核苷酸。该标记芯片适合应用于根据本发明的一种或多种检测方法。

本发明同样包括生产根据本发明的蛋白质的方法。该方法包括提供或培养含有SEQ ID NO：2的细胞培养物，以及后续表达由SEQ ID NO：2编码的蛋白。

此外，本发明还涉及一种抗尾孢菌属植物或其部分，其通过如前所述的方法鉴定，并且如果适用地话则被选定。特别地，本发明涉及包含植物的植物群体，所述植物可根据如前所述的根据本发明的方法之一获得，并且优选地对尾孢菌属叶斑病或尾孢菌属侵染具有抗性，并且其特征在于存在根据本发明的核酸分子。该群体优选具有至少10株，优选至少50株，更优选至少100株，特别优选至少500株，并且特别在农业耕作中，优选至少1,000株植物。群体中不携带根据本发明的核酸分子和/或易受尾孢菌属叶斑病影响的植物的比例优选低于25％-优选低于20％，更优选地低于15％，甚至更优选地为 10％，并且特别地，优选低于5％，如果存在的话。

通过上述精细定位，可确定赋予尾孢菌属抗性的基因在海甜菜基因组中的位置，并且可以鉴定基因本身和周围的序列区。这反过来又表示在目标区域开发DNA杂交探针或遗传标记的基础，借助这些探针或遗传标记，可以检测尾孢菌属抗性介导基因，或者可以与不产生抗性的基因进行区分。

DNA杂交探针可从赋予尾孢菌属抗性的基因的序列中获得，并且可用于筛选所需生物体的基因组和/或cDNA库。该探针可用于通过已知的聚合酶链式反应(PCR)扩增已鉴定的同源基因，并用于检查赋予尾孢菌属抗性的基因是否内源性地存在于生物体中，或是否已异源性地引入植物体中。

本领域技术人员在这里可采取常规的杂交、克隆和测序方法，其例如列在Sambrook 等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,第三版，Cold Spring HarborLaboratory Press， Cold Spring Harbor，NY，2001中。本领域技术人员还可合成并使用寡核苷酸引物来扩增赋予尾孢菌属抗性的基因的序列。为实现特异性杂交，这种探针应该是特异性的，并且具有至少15个核苷酸的长度，优选具有至少20个核苷酸的长度。关于核酸杂交的详细指南可在以下文献中找到：Tijssen，Laboratory Techniques in Biochemistryand Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes,第一部分，第二章，“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidprobe assays.”Elsevier，New York (1993)；以及Current Protocols in MolecularBiology,第二章，Ausubel等编辑，Greene Publishing and Wiley lnterscience，NewYork(1995)。

因此，长度为至少15、16、17、18、19或20，优选至少21、22、23、24或25，尤其优选至少30、35、40、45或50，特别优选至少100、200、300、500或1000个核苷酸的核酸分子是本发明的主题，其中，该核酸分子与包含赋予尾孢菌属抗性的基因的根据本发明的前述核苷酸序列特异性杂交。这也明确包括15至35个核苷酸的范围。

因此，本发明还涉及作为寡核苷酸(特别是引物寡核苷酸)的标记。这些标记包含长度为至少15个核苷酸的核酸分子，该核酸分子与前述核苷酸序列特异性杂交。

具体而言，本发明包括一对核酸分子-优选以寡核苷酸或含有该对寡核苷酸的试剂盒的形式，其适于作为正向和反向引物杂交到与根据本发明的核酸分子具有特异性的区域中，以及用于在聚合酶链式反应(PCR)中进行扩增，或者其适于作为正向和反向引物用于杂交到甜菜基因组中与由根据本发明的多肽赋予的尾孢菌属抗性或与根据本发明的核酸分子共分离的区域中。

通过本发明也可实现甜菜属的新的抗性植物品系的育种和培育的以下优点。序列信息以及鉴定出的多态性-所述多态性允许在所公开的基因的抗性等位基因和易感等位基因之间，即在赋予尾孢菌属抗性的等位基因和无法赋予此抗性的等位基因之间作出区分，使得可能在上述基因中以及位于上游和下游的区域直接开发标记，这对于植物育种者而言代表了重要促进-特别是针对没有“连锁累赘”的优化的核心品系的开发而言。此外，关于序列结构的知识可用于鉴定例如同源或直系同源的其它抗性基因，特别是抗尾孢菌属基因。

因此，本发明还包括用于鉴定编码多肽或其它蛋白质的其它核酸分子的方法，所述多肽或其它蛋白质能够在表达多肽的植物中赋予对尾孢菌属的抗性。因此，本领域技术人员可使用数据库，采用合适的搜索简档和计算机程序来筛选同源序列或进行序列比较。此外，通过常规的分子生物学技术，本领域技术人员可自己获得编码尾孢菌属抗性蛋白的其它DNA序列，并在本发明的范围内使用这些序列。例如，适合的杂交探针可源自根据本发明的核酸序列，并可用于筛选所需生物体的基因组和/或cDNA库。本领域技术人员在这里可采取常规的杂交、克隆和测序方法，其例如列在Sambrook等， Molecular Cloning：ALaboratory Manual,第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold SpringHarbor，NY，2001中。使用已知序列，本领域技术人员还可合成和使用寡核苷酸引物来扩增赋予尾孢菌属抗性的核酸分子的序列。

在一个实施方式中，本发明因此还包括用于鉴定编码多肽的核酸分子的方法，所述多肽能够在表达该多肽的甜菜物种植物中赋予对尾孢菌属的抗性。因此，所述方法包括在甜菜物种的基因型中，将根据本发明的多肽的氨基酸序列(其在甜菜亚种中赋予尾孢菌属抗性)与来自序列数据库的氨基酸序列，或与根据本发明的多肽的等位基因变体的序列进行比较。此外，根据本发明的方法包括鉴定与根据本发明的多肽的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列或等位基因变体，以及在甜菜物种植物中引入编码所鉴定的氨基酸序列或等位基因变体的核酸分子；在植物中表达核酸分子；以及任选地，随后验证对尾孢菌属的抗性。

如前所述，可通过经典的生物信息学方法(数据库搜索和用于筛选同源序列的计算机程序)来鉴定其它赋予尾孢菌属抗性的蛋白质或其编码基因，即与由根据本发明的核酸分子编码的多肽的氨基酸序列至少70％相同-优选至少80％，特别优选至少90％，特别优选至少95％，或者甚至98％相同的同源物、类似物和直系同源物。

因此，术语同源物意味着有关的基因(来自两种不同的植物物种)具有基本上相同的功能和共同的祖先，因此通常在其核酸或编码的氨基酸序列中显示出显著的相同性。然而，也有许多基因彼此同源，但没有产生有意义的配对比对(paired alignment)的蛋白质序列。与此相反，术语类似物描述的基因或蛋白质(同样)具有相同或相似的功能，但不是由相同的结构产生的，即没有共同的祖先。在这种情况下，通常在它们的核酸或编码的氨基酸序列中，或者在最佳情况下，在特定的功能结构域中，不能建立显著的相同性。

在基因组测序的背景下，为标注，对同源物进行更精细地分类。为此引入了术语：直系同源和旁系同源。直系同源物是通过物种形成事件连接的基因。旁系同源物是追溯复制事件的基因。

在本发明的意义上，如果基因能够在植物中赋予尾孢菌属抗性，则其基本上是同源物或类似物或直系同源物。为验证这一点，使用前面已描述的本领域技术人员已知的方法，例如，将鉴定的同源物或类似物或直系同源物通过PCR扩增，在表达载体中克隆，引入靶植物或植物细胞中，然后检查抗性。

如上所述，本文所公开的在顺式或转基因方法中使用抗性基因的等位基因开辟了甜菜属新抗性物种的可能性，其利用剂量效应表现出更高的抗性，或者，通过将所公开的基因与其它抗性基因堆叠，可以避免抗性断裂，并优化抗性发展。也可以通过tilling技术或靶向工程对基因进行修饰，以优化密码子选择，继而增加表达或开发新的或经修饰的抗性等位基因。根据优选实施方式，密码子优化的序列或经修饰的抗性等位基因不是天然存在，而是人工合成的。SEQ ID NO：94提供了经修饰的基因组序列的实例，其中 16-18位处的密码子被修饰，但编码的氨基酸序列不变，并对应于SEQ ID NO：3。SEQ ID NO：95提供了经修饰的cDNA序列的实例，其中55-57位处的密码子被修饰，但编码的氨基酸序列不变，并对应于SEQ ID NO：3。根据SEQ ID NO：96的氨基酸序列给出了经修饰的赋予抗性的等位基因的实例，其中氨基酸缬氨酸已在第209位被氨基酸亮氨酸取代。根据SEQ ID NO：96的氨基酸序列由根据SEQ ID NO：97的经修饰的cDNA 编码。这些序列不是天然存在的，而是人工合成的。当取代例如根据SEQ ID NO：3的抗性介导序列中的氨基酸时，建议交换以下组内的氨基酸：

a)甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸

b)丝氨酸、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、苏氨酸、蛋氨酸

c)苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸

d)组氨酸、赖氨酸、精氨酸

e)天门冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺。

本发明还涉及与可能赋予农学上有利的特性的其它遗传元件的遗传或分子叠加的鉴定的赋予尾孢菌属抗性的等位基因在植物中的用途。因此，栽培植物的经济价值可显著提高，因为例如与具有相同遗传基因但未提供根据本发明的核酸分子的植物相比，产量表现增加。此外，由于强的病原体压力等生物因素，可能会开辟植物的新作物区域，该区域之前无法栽培此植物。具体地，本发明涉及赋予尾孢菌属抗性的等位基因在甜菜属植物的农业或园艺栽培中控制病原体甜菜尾孢菌侵染的方法中的用途，包括借助于前述方法之一鉴定和选择甜菜属植物和/或栽培如此选择的植物或其后代。因此，本发明包括一种用于栽培甜菜物种植物的方法，包括在第一步骤中，提供根据本发明的具有尾孢菌属抗性的甜菜物种植物，或者借助于根据本发明的生产方法生产甜菜物种植物，或者借助于前面描述的根据本发明的鉴定方法鉴定和选择甜菜物种植物；以及包括，在第二步骤中，培养来自所述第一步骤的植物，或者部署来自第一步骤的植物的原种，或者养育来自第一步骤的植物。所述栽培方法因此阻碍了尾孢菌属侵染所栽培的植物。栽培方法可是生产糖的方法的一部分。生产糖的方法包括栽培方法的步骤，此外还包括，收割栽培植物作为倒数第二步骤，以及从上述植物中提取糖作为最后的步骤。

栽培方法可是生产原种的方法的一部分。生产原种的方法包括栽培方法的步骤，此外还包括，春化所栽培的植物作为倒数第二步骤，以及从上述植物中提取种子作为最后的步骤。

提取的种子可任选地粒化，以获得甜菜物种的粒化原种。在这种情况下，这是一种生产粒化原种的方法。

此外，生产原种的方法可设计成用于生产尾孢菌属抗性原种的方法。生产尾孢菌属抗性原种的方法包括上述生产原种的方法的步骤，此外还包括根据本文所述的方法，在所提取的种子的至少一个中，优选在所提取的种子的至少0.1％或至少1％中，验证根据本发明的核酸作为最后的步骤。特别优选实施验证，以使种子保持可萌芽。这意味着从种子中提取验证所需的DNA不会中和种子的可萌芽性。在这种情况下，对根据本发明的核酸的验证可在所有提取的种子中以特别大的比例进行。例如，验证可在所有提取的种子的至少2％中-优选地，至少3％中，特别优选地，至少4％中进行。

根据本发明的植物、它们的细胞或根据本发明的种子或原种可具有另外在农艺学上有利的特性，或者提供这些特性。一个例子是对除草剂如草甘膦、草铵膦或ALS抑制剂的耐受性或抗性。优选对草甘膦或ALS抑制剂除草剂的耐受性。在US 7,335,816 B2 中公开了草甘膦抗性的具体实施例。这种草甘膦抗性例如可从存储在NCIMB， Aberdeen(苏格兰，英国)的原种中获得，其登录号为NCIMB 41158或NCIMB 41159。可使用此类种子来获得耐草甘膦的糖用甜菜植物。草甘膦抗性也可通过杂交引入到甜菜属的其他物种中。

因此，本发明还包括植物、其细胞或种子或种子原料，其特征在于它们包含根据本发明的核酸，并且其特征还在于：

a)植物、其部分或种子的基因组DNA的DNA片段可通过与具有根据SEQ ID NO： 81的核苷酸序列的第一引物和具有根据SEQ ID NO：82的核苷酸序列的第二引物发生聚合酶链式反应，而进行扩增，其中该DNA片段与根据SEQ ID NO：83的核苷酸序列至少95％(优选100％)相同，且/或

b)植物、其部分或种子的基因组DNA的DNA片段可通过与具有根据SEQ ID NO： 84的核苷酸序列的第一引物和具有根据SEQ ID NO：85的核苷酸序列的第二引物发生聚合酶链式反应，而进行扩增，其中该DNA片段与根据SEQ ID NO：86的核苷酸序列至少95％(优选100％)相同，且/或

c)植物、其部分或种子的基因组DNA的DNA片段可通过与具有根据SEQ ID NO：87的核苷酸序列的第一引物和具有根据SEQ ID NO：88的核苷酸序列的第二引物发生聚合酶链式反应，而进行扩增，其中该DNA片段与根据SEQ ID NO：89的核苷酸序列至少95％(优选100％)相同。

在WO2012/049268A1文件中公开了ALS抑制剂除草剂抗性的特定实施例。例如，这种ALS抑制剂除草剂抗性可从英国NCIMB，Aberdeen的保藏中获得，登录号为 NCIMB 41705。此外，这种ALS抑制剂抗性可通过tilling或定点诱变(例如，通过基因编辑)产生，基因编辑例如通过使用CRISPR/Cas、CRISPR/Cpf1、TALENS或锌指核酸酶进行。因此，本发明还包括植物、其细胞或种子或种子原料，其特征在于，它们包含根据本发明的核酸，并且其特征还在于，它们在内源性乙酰乳酸合成酶基因中表现出突变，其中该乙酰乳酸合成酶基因编码乙酰乳酸合成酶蛋白(由于569位的突变，其氨基酸与色氨酸不同)。作为突变的结果，位置569处的氨基酸优选为丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸或精氨酸。位置569优选地通过 SEQ ID NO：90的位置569来定义。此外，优选突变乙酰乳酸合成酶基因SEQ ID NO： 91的特定序列。乙酰乳酸合成酶基因的突变序列，或根据SEQ ID NO：91的序列，并不是天然存在的，无法从自然界中分离出来。此外，该突变可能在植物、其细胞或种子或种子原料中同时以杂合和纯合形式存在。我们推荐突变以纯合形式存在，因为这可以促进更稳定或更强烈的抗性表型。

本领域技术人员可从现有技术中获知许多其它的除草剂和它们的适用性。他可诉诸于现有技术，以便了解为在植物中实现相应的耐受性，哪些遗传元件将以何种方式使用。

此外，除草剂耐受性具有协同效应，即通过使用除草剂可以减少杂草的发生。这在对抗尾孢菌属方面是有利的，因为众所周知，甜菜尾孢菌的分生孢子(无性孢子)或假基质(菌丝体)在植物材料上可以存活长达2年。

农艺优势特性的另一实例是其它病原体抗性，其中，病原体可以是例如昆虫、病毒、线虫、细菌或真菌。例如，植物的广泛病原体防御可通过不同的病原体抗性/耐受性组合来实现，因为遗传元件可表现出彼此之间的加性效应。例如，本领域技术人员已知许多用于此的抗性基因作为遗传元件。例如，US20160152999A1公开了针对甜菜丛根病的 RZ抗性基因。这种疾病是由“甜菜坏死黄脉病毒”引起的。一株植物中包含的几种抗病性相互之间具有协同效应。如果植物第一次感染病原体，则其免疫系统通常会减弱，作为外部屏障的表皮通常会受损，从而增加了进一步感染的可能性。农艺优势特性的另一实例是耐寒性或抗冻性。例如，表现出这种特性的植物可在当年早些时候播种，或者可在田间生长更长时间，这可导致产量增加。这里，本领域技术人员还可诉诸于现有技术来寻找合适的遗传元件。农艺优势特性的其它实例是水分利用效率、氮利用效率和产量。可以在现有技术中找到可用于赋予此类特性的遗传元件。

此外，病原体防御的许多修饰是本领域技术人员已知的。除经常描述的R基因家族外，也可有利地使用Avr/R方法、Avr基因互补(WO 2013/127379)、R基因自激活(WO 2006/128444)或HIGS(宿主诱导的基因沉默)方法(例如，WO2013/050024)。具体而言，R 基因的自激活可能对本发明很重要。为此，创建了一种编码使植物产生病原体抗性的自激活抗性基因的核酸。然后，该核酸仅具有NBS-LRR抗性基因(例如wb-R基因)的有限部分，其从NBS-LRR抗性基因编码区的5'末端向下游延伸到编码NBS-LRR抗性基因的NBS结构域的开始点。

在此上下文中，还包括一种方法，该方法包括去除根据本发明的核酸区域的步骤，该核酸编码N-末端区，并且从NBS结构域中的p-环开始，并延伸到N-末端区的末端。

由这种缩短的核酸编码的抗性蛋白通常是自激活的，因为这些抗性蛋白在植物中会触发免疫应答(即使在没有相关病原体的情况下)，因此会增加植物的基础免疫。此外，还包括根据本发明的这种缩短的核酸以及由此编码的多肽。

此外，本发明还包括通过上述方法鉴定的赋予尾孢菌属抗性的基因的等位基因用于与前述修饰之一或与前述可赋予植物一个或多个农艺优势特性的遗传元件组合的用途。

除涉及根据本发明的植物外，本发明还涉及在通常由可持续原料制造的产品的生产中和在化学工业用的材料或物质的生产中的植物的种子或后代、或其器官或植物部分、组织或细胞，所述可持续原料例如食品和动物饲料-优选糖或糖浆(糖蜜)，其中糖蜜还用于工业应用中，例如用于酒精生产或用作生产生物技术产品的生长基质，所述化学工业用的材料或物质例如精炼化学制品、药物或其前体，诊断剂、化妆品、生物乙醇或沼气。申请案DE10 2012 022 178A1中描述了沼气厂使用甜菜作为生物原料的例子；例如参见第10段。

以下实例解释了本发明，但不限制本发明的主题。除非另有说明，否则使用标准分子生物学方法。参见，例如，Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2001；Fritsch 等，Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989；Mayer等，Immunochemical Methods inCell and Molecular Biology，eds.，Academic Press，London，1987；以及Weir等，Handbook of Experimental Immunology，第I-IV卷，Blackwel编辑，1986。

下面将详细说明根据本发明的一些最重要的序列：

-SEQ ID NO：1：来自海甜菜的赋予尾孢菌属抗性的基因的基因组DNA序列。

-SEQ ID NO：2：非天然存在的赋予尾孢菌属抗性的基因的cDNA序列。

-SEQ ID NO：3：由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2编码的赋予尾孢菌属抗性的蛋白的氨基酸序列。

-SEQ ID NO：4：赋予尾孢菌属抗性的基因的敏感性变体的基因组DNA序列。

-SEQ ID NO：5：赋予尾孢菌属抗性的基因的敏感性变体的cDNA。

-SEQ ID NO：6：赋予尾孢菌属抗性的基因的敏感性变体的氨基酸序列。

-SEQ ID NO：7：来自海甜菜的赋予尾孢菌属抗性的基因的天然启动子。

-SEQ ID NO：8：来自海甜菜的赋予尾孢菌属抗性的基因的天然终止子。

-SEQ ID NO：53：来自海甜菜的含有根据SEQ ID NO：1的赋予尾孢菌属抗性的基因的基因座的序列。

实施例

实施例1：将赋予抗性的基因通过CRISPR介导的同源重组引入甜菜亚种

crRNA的设计和选择：

借助于CRISPR RGEN工具，设计了用于Cpf1介导的双链断裂的诱导的合适的crRNA(Park J.、Bae S.和Kim J.-S.Cas-Designer：A web-based tool for choice ofCRISPR-Cas9 target sites Bioinformatics 31，4014-4016(2015)；Bae S.、Park J.和Kim J.-S. Cas-OFFinder：A fast and versatile algorithm that searches forpotential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases Bioinformatics30，1473-1475(2014))。为此，在具有 500-1300bp长度的基因组DNA序列内寻找合适的原间隔序列，该序列位于来自海甜菜的尾孢菌属抗性基因的5‘-末端和3‘-末端两侧。为确保毛螺菌科细菌(Lachnospiraceae bacterium)ND2006(Lb)的内切核酸酶Cpf1的功能性，选择了具有24nt长度的原间隔序列，其5'-末端的基因组结合序列侧翼为具有序列5‘-TTTV-3‘(V＝G或C或A)的基本原间隔序列相邻基序(PAM)。合适的原间隔序列根据工具的预定质量标准进行选择，并与甜菜亚种的参考基因组的潜在脱靶点配合。对于继续测试，仅选择了crRNA，除实际靶序列外，其与功能性PAM最多具有15个相同碱基。由于原间隔序列的前18nt对于检测和切割靶序列至关重要，可以通过此方式排除其它基因组序列中的不必要切割(Tang， X.，L.G.Lowder，T.Zhang，A.A.Malzahn，X.Zheng，D.F.Voytas，Z.Zhong，Y.Chen，Q.Ren，Q.Li，E.R.Kirkland，Y.Zhang，and Y.Qi(2017)，“A CRISPR-Cpf1 system forefficient genome editing and transcriptional repression in plants”Nat Plants3：17018)。通过此方式，可以在抗性基因的5’-侧翼区鉴定四个潜在crRNA(5’crRNA#1-4)，在抗性基因的3’-侧翼区鉴定三个crRNA(3’crRNA#1-3)(参见表A)。

表A：甜菜中抗性基因的5‘-和3‘-侧翼DNA序列内所选择的靶序列。PAM以下划线标出。

遗传元件的克隆：为克隆cpf1表达盒和crRNA表达盒，首先通过引入点突变(T到G)，从靶载体pZFNnptII中去除阻止克隆的BbsI限制酶的检测序列。根据制造商的说明书，使用两个诱变引物，用诱变试剂盒进行诱变(参见表B)。

表B：用于引入点突变(T至G，以下划线表示)以去除BbsI检测序列的诱变引物。

名称	序列5‘→3‘
		诱变引物1	TCAGTGCAGCCGTC<u>G</u>TCTGAAAACGACA(SEQ ID NO：23)
诱变引物2	TGTCGTTTTCAGA<u>C</u>GACGGCTGCACTGA(SEQ ID NO：24)

为在甜菜中表达Lbcpf1基因，合成产生了针对拟南芥(A.thaliana)进行密码子优化的DNA序列，其具有来自欧芹(Petroselinum crispum)的5‘侧翼PcUbi启动子序列(SEQID NO：79)和来自豌豆(Pea sp).的3‘侧翼3A终止子序列，作为DNA片段。通过引入沉默突变(碱基交换，不修改氨基酸序列)去除与在Lbcpf1编码序列(CDS)[SEQ ID NO：78] 中克隆相关的限制性介质(HindIII)，以避免编码区内的意外切割。密码子优化借助于来自Invitrogene/ThermoScientific的GeneArt算法进行。为使Cpf1能够在细胞核内运输，SV40的核定位信号(NLS)的编码序列在5'端处被整合到cpf1 CDS中，且核质蛋白的NLS 在3'端处被整合。对于二元靶载体pZFNnptII中的连接(图2)，表达盒侧翼为两个HindIII 限制性介质且随后连接至pZFNnptII_LbCpf1。通过测序验证PcUbi::Cpf1::TPea表达盒的成功插入，其中用于测序的引物的结合区位于侧翼载体区和表达盒内(参见表C)。

表C：用于整合到pZFNnptII中的PcUbi::Cpf1::TPea表达盒的测序的引物

名称	序列5‘3‘
		pSeq_CRBM4_F1	SEQ ID NO：25
pSeq_CRBM4_R1	SEQ ID NO：26
		pSeq_CRBM4_F2	SEQ ID NO：27
pSeq_CRBM4_R2	SEQ ID NO：28
		pSeq_CRBM4_F3	SEQ ID NO：29
pSeq_CRBM4_R3	SEQ ID NO：30
		pSeq_CRBM4_F4	SEQ ID NO：31
pSeq_CRBM4_R4	(SEQ ID NO：32)

在转录到植物细胞中后，crRNA应该通过两个侧翼核酶切下。为此，前体crRNA 的侧翼为锤头状核酶和HDV核酶的编码序列(Tang，X.，L.G.Lowder，T.Zhang，A.A. Malzahn，X.Zheng，D.F.Voytas，Z.Zhong，Y.Chen，Q.Ren，Q.Li，E.R.Kirkland， Y.Zhang，and Y.Qi(2017)，“A CRISPR-Cpf1 system for efficient genome editing and transcriptionalrepression in plants”Nat Plants 3：17018)。

为在crRNA重复序列的编码序列处实现各原间隔序列的完美连接，在crRNA重复序列和HDV核酶之间整合了两个BbsI检测序列，其中用于克隆的单链突出端(overhangs) 相应地进行了调整。为确保cpf1和crRNA的相同表达强度，crRNA核酶盒在5’端与PcUbi 启动子序列结合，在3’端与3A终止子序列结合。对于之后靶载体pZFNnptII_Cpf1中的连接，crRNA表达盒侧翼为两个PstI接口，并作为合成DNA片段排列。将原间隔序列合成为互补寡核苷酸，并根据标准方案进行退火。以此方式生成的24bp长的DNA片段侧翼为与连接相关的4-nt单链突出端(参见表D)。

表D：用于生成短24bp原间隔序列的寡核苷酸的序列。用于连接的4-nt单链突出端分别是每个以下所列序列的前四个核苷酸。

通过甜菜叶片中农杆菌介导的基因转移来测试四个crRNA的效率。共转化pZFNTNTPTII质粒以检查转化效率。根据标准方案，通过真空渗透进行叶片外植体的转化。六天后，通过荧光显微镜检查tDT的荧光，并丢弃具有异质性荧光的叶片外植体。渗透发生十天后，将叶片外植体在液氮中快速冷冻，捣碎，并通过CTAB方法分离基因组DNA(Clarke，Joseph D.，“Cetyltrimethyl ammonium bromide(CTAB)DNA miniprep for plant DNAisolation”Cold Spring Harbor Protocols 2009.3(2009)：pdb-prot5177)。单个 crRNA的效率由外部服务提供商通过NGS，使用插入版本(例如插入、缺失或碱基交换) 的频率与基因组DNA中未编辑序列的频率进行比较来确定。

作为合成DNA构建体，最有效的crRNA(5’crRNA#3和3’crRNA#1)与前述核酶、启动子和终止子序列一起作为反向表达盒排列。整个DNA构建体侧翼为两个PstI限制性接口，用于在靶载体pZFNnptII_LbCpf1中克隆。crRNA插入发生后，通过HindIII将 LbCpf1和crRNA表达盒从载体pZFNnptII_LbCpf1_crRNA连接到pUbitDTnptII载体。

作为应通过同源重组整合到甜菜的基因组中的修复模板，抗性基因表达盒的侧翼5’- 末端为5’crRNA#3结合序列，3’-末端为3’crRNA#1结合序列。这使得可以通过Cpfl从质粒中切除抗性基因表达盒。整个DNA模板合成为87326bp长的合成DNA片段(SEQ ID NO：80)，并直接用于载体主链中进行转化。借助于基因炮将抗性基因质粒和 pUbitDTnptII_LbCpf1_crRNA质粒引入甜菜愈伤组织培养物中。

转化后一天，通过荧光显微镜使用瞬态tDT荧光测定转化效率。将愈伤组织培养物在无选择压力(不含卡那霉素)的芽诱导培养基上培养，随后检查再生芽的赋予抗性的抗性基因盒的定点整合。为此，通过CTAB分离了基因组DNA。使用根据SEQ ID NO： 47的引物pCRBM4_F1和根据SEQ ID NO：48的引物pCRBM4_R1(参见表E)，通过PCR 扩增赋予抗性的基因的整合，并随后用两种引物对PCR产物进行测序。在以下对抗性基因整合位点的分析中，鉴定了可以以此方式验证成功插入表达盒的芽。为验证基因组中期望的靶序列的插入，通过PCR扩增抗性基因表达盒的侧翼区域。此处的引物结合发生在抗性基因DNA序列内；第二引物的结合发生在所插入表达盒的5’-或3’-侧翼同源区外(参见表E)。使用相同的引物对扩增的DNA序列进行测序，并以此方式确认期望位置的整合。为排除引物pCRBM4_F1(SEQ IDNO：47)、pCRBM4_R1(SEQ ID NO：48)、 pCRBM4_R2(SEQ ID NO：50)和pCRBM4_F3(SEQ ID NO：51)在基因组的序列相似区域结合，所有引物序列事先与甜菜基因组比较。对于引物pCRBM4_F3(SEQ ID NO：51) 而言，选择核苷酸序列以排除与野生型序列结合是不可能的。因此，3’侧翼区在所有抗性基因测试为阳性的芽中扩增，并且通过随后的测序专门验证了位点特异性插入。由此生成的PCR产物与野生型序列相差18bp。为能够对扩增序列进行完整测序，通过在扩增序列中具有结合位置的第三引物(pCRBM4_S2、pCRBM4_S3；参见表E)对PCR产物进行额外测序。为排除引物pCRBM4_F1(SEQ ID NO：47)、pCRBM4_R1(SEQ ID NO： 48)和pCRBM4_R2(SEQ ID NO：50)在非野生型基因组内发生非特异性结合，将核苷酸序列与甜菜的内部参考基因组比较。通过PCR额外测试了引物在甜菜野生型植物的基因组序列中的结合。

为排除抗性基因在基因组的其它区域中的整合，对靶位置进行靶向扩增(靶向位点扩增，TLA)。

表E：用于验证抗性基因表达盒插入期望整合位点的引物。

除抗性基因表达盒的验证和成功插入甜菜基因组外，还检查了质粒DNA的不必要整合。为此，通过PCR检查基因组DNA(其中验证了抗性基因成功插入期望目标位点) 中质粒DNA的存在。因此，使用表F中列出的引物扩增cpf1、crRNA核酶盒和tDT内的序列区域，随后进行测序。

表F：用于验证再生甜菜芽的基因组中稳定整合的质粒特异性序列的引物

实施例2：通过基因转化将赋予抗性的基因作为转基因引入甜菜亚种中

产生抗尾孢菌属植物的转基因途径不仅用于LRR基因作为赋予抗性的基因的替代校验，还可作为产生赋予新型尾孢菌属抗性或提高现存尾孢菌属抗性的转基因抗性事件的手段。

二元载体pZFN-nptII-LRR通过以下标准克隆程序生成：在此载体的T-DNA内，根据SEQ ID NO 2的抗性基因的cDNA与其天然启动子序列一起克隆。T-DNA还包括新霉素磷酸转移酶II(nptII)基因，该基因赋予对氨基糖苷类抗生素(如卡那霉素或巴龙霉素) 的抗性。这些抗生素抗性用于选择转基因植物细胞和组织。NOS启动子和pAG7终止子位于nptII基因的两侧。二元载体的主链还含有用于在大肠杆菌或根癌农杆菌中进行质粒复制的colE1和pVS1来源。aadA基因赋予用于细菌选择的链霉素/大观霉素抗性。通过标准程序将pZFN-nptII-LRR质粒转化到农杆菌菌株AGL-1中。

甜菜的转化是根据Lindsey&Gallois(1990)进行的(“Transformation ofsugarbeet(Beta vulgaris)by Agrobacterium tumefaciens”Journal of experimentalbotany 41.5，529-536)。为此，使用不携带根据本发明的抗性基因的基因型04E05B1DH5的“微繁殖芽”作为起始材料。根据Lindsey&Gallois(1990)将芽在相应的培养基中进行繁殖。为诱导尽可能多的分生组织，将“芽”转移到不同的培养基中(参见Lindsey&Gallois(1990))，并在大约30℃下于黑暗中孵育数周。将带有载体pZFN-nptII-LRR的农杆菌株AGL-1(图3)在额外提供用于选择的相应抗生素的另一培养基中培养(参见Lindsey&Gallois(1990))。将基于待处理的芽的分生组织的切片在另一培养基中与农杆菌一起孵育数小时(参见Lindsey& Gallois(1990))。将植物外植体和农杆菌在培养基中于黑暗下共同培养至少2天(参见 Lindsey&Gallois(1990))，随后将接种的外植体在另外的培养基中于黑暗下培养大约2 周(参见Lindsey&Gallois(1990))。随后，将外植体在另外的培养基中进一步繁殖(参见 Lindsey&Gallois(1990))并进行亚培养，以便能够选择转基因组织。为结束选择阶段并减少嵌合体形成的程度，将绿色“芽”转移到培养基H中，并全部繁殖2周。然后从该绿色的正在生长的“芽”中提取叶片材料，并通过PCT检查是否存在转基因。合适的“芽”在培养基I中生根，然后将其转移到温室中用于产生T1种子原料。此外，使用来源于这些“芽”的叶片材料来分析转化的抗性基因的表达。

表达水平的分析

从体外“芽”的叶片分离RNA，并用于qRT-PCR。根据Weltmeier等(2011)进行 qRT-PCR(参见背景技术)。将测量值针对参考基因PLT3_075_F09进行归一化(参见 Weltmeier等，2011)。通过使用以下引物序列来测定表达：

序列	大小[No.核苷酸]	T<sub>m</sub>[C°]	扩增产物的大小[No.核苷酸]
				SEQ ID NO：92	21	59,8	170
SEQ ID NO：93	21	58,9	170

温室条件下甜菜接种甜菜尾孢菌后的抗性测试：

在20℃近紫外线(NUV)光下，在培养皿(直径9cm)中的蔬菜汁琼脂上繁殖具有已知高毒力的纯甜菜尾孢菌属培养物。14天后，在每个培养皿中用10ml无菌水浸没长出霉菌的琼脂表面，并在受试者载玻片的帮助下仔细刮去分生孢子和菌丝碎片。使用每毫升 20000个分生孢子/菌丝体碎片的接种体密度加0.1％吐温20接种植物。接种时，植物已在温室条件下培养了8至9周。用接种物处理叶片的顶部和底部。随后将这些植物在 25℃、18小时/6小时明/暗和大约100％湿度下培养5至7天。12至14小时后甜菜叶片上出现第一个尾孢菌属症状。在表1A中所示的等级评分评估的帮助下，有规律地对各个植物的症状进行评估。结果如下所示。

表G：根据本发明的抗性基因在转化的植物中的功能的转基因验证结果；

LSD＝最小显著差异；dpi＝感染后天数

根据本发明的抗性基因的转基因验证结果(参见表G)。

测试组1表示阴性对照。基因型与测试组2至11相同，但未发生转化。因此，未检测到表达。测试组4进行了转化，但未检测到表达。测试组2、3和5至11表示仅由于转化而携带根据本发明的抗性基因的转化子。测试组12表示包含非转基因形式的根据本发明的抗性基因的育种品系。所有品系的等级评分在将植物材料接种上述甜菜尾孢菌后确定。测试组12显示出最高抗性，最终值指示为5,19。

转基因品系显示出根据下表的等级评分：

表H：表G的转基因品系的等级评分

表H仅示出了转基因校验组的等级评分。首先示出了所有转基因测试组(不包括第4组)的平均值。仅给出了显示出至少为10的表达水平的转基因品系的等级评分(第3、8、 9、10组；参见表G)。此处最终等级评分为5,91。这明显高于第1组阴性对照(其仅具有6,46的等级评分)的更高抗性(最小显著差异＝0,4；参见表G)。最佳转基因测试组(第8 组)显示出更好的抗性，因为等级评分为5,48(参见表G)。

值得一提的是，转基因插入物的表达水平可能受整合基因座的影响。当体外测量表达水平时，感染条件下的实际表达水平可能更高，尤其是在抗性基因受病原体可诱导启动子控制的情况下。

转基因校验结果的统计评价。

表I：统计聚类分析

试验组	聚类8dpi	聚类11dpi	聚类13dpi	聚类15dpi
					1	ab	a	a	ab
2	e	de	bc	cd
					3	e	ef	c	bcd
4	bc	bcd	bc	bcd
					5	cd	abc	a	abc
6	a	ab	a	ab
					7	ab	a	a	a
8	de	ef	c	e
					9	e	de	bc	d
10	cd	cd	b	d
					11	ab	a	a	a
12	de	f	d	e

表I示出了表G中所含的等级评分的统计评价。每个字母象征分配至一个统计组。例如，很明显在最终评价后(15dpi)，测试组8(转基因验证)与测试组12(抗性来源)处于相同聚类中，但与测试组1(阴性对照)处于不同聚类中。据此，测试组8与测试组1有显著差异，但与测试组12无显著差异。

此外，还进行了箱形图分析。从图4至图7可获得箱形图的图示。

序列表

<110> 科沃施种子欧洲股份两合公司

<120> 用于抗植物病害的基因

<130> KWS0270PCT

<150> EP18157246.2

<151> 2018-02-16

<150> US16/051,113

<151> 2018-07-31

<160> 99

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3720

<212> DNA

<213> Beta vulgaris

<400> 1

atgaacatga aaatcctcct tttgtttgtc ttccttcatc acctccacta cttcatccat 60

ggcagaacac ttacagaacg ccaagcttta ctaagtatca aatctgccat tacttatgat 120

tattataact ctctctcctc atggaaaaac acaacacacc actgcagttg gccatacatc 180

acttgctcct cctcttcttc ttcttcttct gttatttctc tcaacttcac catgttattt 240

ctcgaaggaa ttctctcccc tgatataggc ttcctcacca acctgcaaaa cctctctatt 300

cgatctaacc ttttttctgg cccactcccc cattctctct ctctcctcac ccaactccgc 360

tatctcgacg tttcccaaaa cagtttcaca ggtccaatcc catcttctct ctctctcctc 420

acccaactcc gctatctcca cgtttccggc aacagtttca caggtccaat cccatctttt 480

ctctctctcc tcacccaact ccgctatctc gacgtttccg acaacagttt cacaggtcca 540

atcccatctt ctctctctct cctcacccaa ctccgctatc tcgacgtttc ctacaacaat 600

ctaaatggca ctcttccctt atcggtcgtt gagaagatgt cggagctcag ctaccttaac 660

cttaggtata actctttcta cggtgagatt ccaccggagt ttgggaaact taagaagctt 720

gaaacattga atcttggtaa caacactctt tctgggagtc ttccatctga gttgggttca 780

ttaaagagtt tgaaacatat ggacttttct agtaatatgc tatttggtga gatcccacaa 840

tcttattctc ttcttcgaaa cttaatcgat attgatctta atagaaacaa gttatatggg 900

agtatacctg attatattgg agattttccg gagttggaat cacttttatt agactcgaat 960

aacttcacag ggagtatccc acaaaagtta ggtacaaacg ggaagttgca atatctagat 1020

ataagtaaca acaattttag tggtagtttg ccactaagtc tttgcaaagg agacaaactc 1080

caagatctgg acgcatccta taatttgttg gttgggtcaa ttcctgagag tttgggaagt 1140

tgcaagtcac ttgaaggagt gtacatggga aataatttct taaacgggtc gattcctaag 1200

ggcttgtttg ggagtgatgt ttcacttaat gacaaacttc ttagtggagg tctcgatgag 1260

aaattcggtg attgcgttaa tcttcgggac attgatctct ctaataataa gctatcaggg 1320

aagttacctg cgaccatcgg aaactgtatt catcttcggt ccttgacgct ttataataac 1380

acctgtaccg gacgtatccc tcaagagatt agcaagtgta agcagctaca gaccctcgat 1440

ctcagccaaa atcagttctc tggtgtgata cccaatgata ttacaggtaa gaaagtatat 1500

taaacttgtt acttttgaaa atattcgctc tagtttttgt ttcagttggt ccattctcac 1560

tttgtattat tgaaatatat cccaaaaaag taaatataat tatataaaag aatcttgcta 1620

aaaataatat gaattatttt tgtatgtgca aaataatgta caaatctaac taatttgttg 1680

tggataataa tattaattgt gtgaaatagt aaatgtgtgg agatatataa ctttatttat 1740

catattcact caggttttta ggtatttatt atgagttttg cattggagat atccaacttg 1800

acaatagtat ttttgtaata taccaatata taaagattac tgtacataac caaaatgtat 1860

acttttctta tttttataaa cttatatatt cctcttcttt gtatttatca caacattttt 1920

tatacccttt tgcctcatat taatagcaac acttataatt tatttattta ctttttattt 1980

cttggtctat aacctcatct acccacatat gacacaccct ataaaggacc cacatgatta 2040

accaaaatat acaaatatct tcaatgaaat taactttaac actaatatga taaaaatcat 2100

gtcccgcttt ttatcctcta actaagactc tgcataaagg tatattgcaa ttaatatgag 2160

atggaagagg tataataatt atatgatcaa attcctggat tgaaaaataa atatgagatt 2220

aaaagtggta tgtttttggt taaaagaaac tatccataaa gtatgttttt ggttaaaaga 2280

aactatgcaa cataccaatc aaatgtttat acgcttacaa tttatgtacc acttttttgt 2340

cattgttttt ctattgtttg ccatacgtac gttactaaat catgttgtct tttcacattt 2400

taactaacaa taaattacta ttgatacacc aaaaaaatct atgagcattg gagtacgttg 2460

tttgatagaa gcttcgtgct attatttctt gtcaaagaat ttcatatctc aatatcttct 2520

aatttaacaa tctaacgaaa tttttttgac ccaggaaaca aatccatttg caatctggaa 2580

aagatacaaa cacttaaatt atcaaacaat gctttgactg gtgaaatccc tcattgtgtt 2640

ggaaatatcg agctcatagc attatttctc caatcaaaca aactgaacgg taccataccc 2700

gcaaacttct caaagttatg tgattcattg atatatctag atcttagtga caatcaactc 2760

gaaggagttc tacctaagtc cttgtccaaa tgtcaaagtc tagaactcct aaatgtcggg 2820

aacaataggc taagagataa atttccttca tggttagaca acctcccacg tctccaagtt 2880

ttcagtgtgc gttttaacgc cttctacggt cctataacta gctcaccaaa agttagtcac 2940

ccatttccta tgctacaaat tatcgaccta tctaacaata agttttgtgg caagttgcca 3000

agaagatata tcaaaaactt tgcaaccatg cgcaatatga atgagtctgg tgttgggaat 3060

ccacagtacc tgggggactc atcaatatat agtattacgt actctatggt attgacattc 3120

aatgggttac aacaaaaata tgaaaagctt attgtgacga tgtcgacctt tgatatatcc 3180

agcaacaact ttactggaca gattccatat gttatagggg gattacgctc acttcgtaac 3240

cttaatctct ctcataatgt cttaaccggg aacattcctc catcaattgc aaaattgtct 3300

ttgcttcaag atttggacct ttcatcaaac agacttactg gtcgtatccc tcaagaatta 3360

gttagtttaa catttcttgg gagtttcaat gtttcgaaca atctattgga ggggtctata 3420

cctcatggtt tcaacttcga cacgtacaca gctaattcat accaggggaa tctcgaatta 3480

tgtggaaaac cattacctga gtgtggagaa agaagggcaa aaggcaccac taataatcaa 3540

gatgatccta aaaatgataa tgaacgaatg ttgtcgatgt ccgaaatcgt agttatgggg 3600

tttggcagtg gtgtactagt tgggttggct tggggatact atatgttttc agtgggaaag 3660

cccttttggt ttatcaagat ggctagcaaa atggaatcaa tattgattgg ttttttctga 3720

<210> 2

<211> 2652

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cDNA sequence of the Cercospora resistance-conferring gene

<400> 2