一种高产四甲基吡嗪的菌株及其制备方法
阅读说明：本技术 一种高产四甲基吡嗪的菌株及其制备方法 (Bacterial strain for high yield of tetramethylpyrazine and preparation method thereof ) 是由 江东材 朱和琴 彭礼群 罗陟 于 2021-07-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种高产四甲基吡嗪的菌株及其制备方法,其中,所述高产四甲基吡嗪的菌株为地衣芽孢杆菌,分类命名为Bacillus licheniformis xf-4-1,保藏编号为CCTCC NO:M 2021664,形态为棒状,细胞直径(0.8～1.0)μm×(1.5～2.0)μm,菌落颜色为乳白色,菌落边缘呈不规则状,有黏液,革兰氏阳性。本发明高产四甲基吡嗪的菌株能够应用于柔雅香型白酒的生产,得到的白酒中乙偶姻和四甲基吡嗪含量分别为268.1mg/L和5.6mg/L；另外本发明方法得到的菌株生长旺盛、无污染,且能够解决菌株在培养过程中出现的自溶现象。(The invention discloses a bacterial strain for high yield of tetramethylpyrazine and a preparation method thereof, wherein the bacterial strain for high yield of tetramethylpyrazine is Bacillus licheniformis, the bacterial strain is classified and named as Bacillus licheniformis xf-4-1, the preservation number is CCTCC NO: M2021664, the shape is rod-shaped, the cell diameter is (0.8-1.0) Mumx (1.5-2.0) Mum, the colony color is milky white, the colony edge is irregular, mucus exists, and gram is positive. The bacterial strain for high yield of the tetramethylpyrazine can be applied to production of the soft and elegant flavor type white spirit, and the contents of acetoin and tetramethylpyrazine in the obtained white spirit are 268.1mg/L and 5.6mg/L respectively; in addition, the strain obtained by the method of the invention has vigorous growth and no pollution, and can solve the autolysis phenomenon of the strain in the culture process.)
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种高产四甲基吡嗪的菌株及其制备方法。
背景技术
柔雅香型白酒为四川省宜宾市叙府酒业股份有限公司全国首创白酒产品，产品一次成型，具有“无色透明、浓酱协调、香气优雅、醇厚绵甜、酒体丰满、余味净爽、多粮兼香风格典型”的特点，产品自上市以来深受广大消费者的喜爱。研究发现，在中国传统发酵食品白酒中含有一定的吡嗪类物质，不仅具有芳香性，同时具有扩张血管、改善血循环、护肝的功效，而其中四甲基吡嗪的含量最高。
四甲基吡嗪(2，3，5，6-tetramethylpyrazine)是一种常见的杂环含氮化合物，具有烘烤、花生、榛子和可可的香气，常用于烘烤食品、冷饮、肉类、乳制品、卷烟等香精的调配，除了作为食品风味添加剂的用途，四甲基吡嗪作为中药材川芎(Ligusticumwallichii)根茎的主要活性生物碱成分，已被证明具有治疗心脑血管疾病的药理作用，并对顺铂诱导的氧化应激、细胞凋亡和肾毒性有预防作用。随着药理研究的深入，现在已经作为一种新型的钙离子拮抗剂广泛应用于临床，是循环、中枢神经、呼吸及其它系统相关疾病的大宗用药，广泛应用于心脑血管疾病、呼吸系统疾病、肾小球疾病等的治疗。白酒中的四甲基吡嗪主要在制曲和发酵中产生，经蒸馏带入酒中，具有扩张血管，改善微循环及抑制血小板积聚作用，赋予中国白酒以健康功能，其前体物质为乙偶姻。
乙偶姻，化学品名为3-羟基-2-丁酮，又名3-羟基丁酮、双乙酰或甲基乙酰甲醇，是许多微生物具有生理意义的代谢产物，其作为四甲基吡嗪的前驱物质应用于微生物发酵生产四甲基吡嗪中已被许多研究者证实。通过外源添加前驱物质3-羟基-2-丁酮的方法已被成功应用于提高发酵法生产四甲基吡嗪的产量中。然而，外加的前驱物质被微生物的利用程度低，即使较高量吡嗪产生的情况下，前驱物质的利用率也小于1％。且大量外源添加的前驱物质3-羟基-2-丁酮添加到培养基中，不仅对微生物细胞有毒性，还会导致微生物代谢平衡紊乱。
因此，若能够生产出一种能够提高外源乙偶姻利用率，从而实现四甲基吡嗪高产的菌株，对于白酒的风味及其经济价值具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高产四甲基吡嗪的菌株及其制备方法，该菌株有效提高了乙偶姻的利用率以及TTMP的产量，可应用于柔雅香型白酒的生产。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一目的是提供一种高产四甲基吡嗪的菌株，所述地衣芽孢杆菌的所述地衣芽孢杆菌的分类命名为Bacillus licheniformis xf-4-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2021664，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏日期为2021年6月2日。
进一步地，所述地衣芽孢杆菌菌株的细菌学特征是：形态为棒状，细胞直径为(0.8～1.0)μm×(1.5～2.0)μm；菌落颜色为乳白色，菌落边缘呈不规则状，有黏液，革兰氏阳性。
本发明所述地衣芽孢杆菌对白酒具有呈酸和增香的作用,能够改善白酒风格及风味的贡献。
本发明的第二目的是提供一种上述高产四甲基吡嗪的菌株的制备方法，包括如下内容：进行微生物发酵积累前体乙偶姻，得到高产乙偶姻菌株后制备强化大曲；
所述微生物发酵的方法包括如下内容：
将一级种子培养液接种于筛选培养基中培养、浸提、蒸馏，即得含前体乙偶姻的曲醅。
进一步地，所述一级种子培养液以蒸馏水定容至1L，包括：蛋白胨8～15g/L，酵母粉3～8g/L，NaCl 8～15g/L，pH值为6.8～7.5；
优选为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，pH值为7.0。
进一步地，所述筛选培养基为水分含量30～50％的小麦粉，进一步得，为水分含量30～35％的小麦粉；
进一步地，所述小麦粉过20目筛得到。
传统筛选方法均以试验室培养基优化筛选，本发明的筛选培养基组分以曲麦粉为基质筛选，更切合生产实际。
进一步地，在筛选培养基中的培养条件为：20～60℃，28～32d；
所述浸提的试剂为40％～90％的无水乙醇，浸提时间为20～30h，进一步为60％的无水乙醇，浸提时间为24h；
所述曲醅：无水乙醇的质量体积比为1:1～3，优选质量体积比为1:2。
所述“60％的无水乙醇”是将无水乙醇稀释成质量浓度为60％；所述“质量体积比为1:2”表示曲醅100g:无水乙醇200ml。
进一步地，所述强化大曲的制备方法包括如下内容：
将高产乙偶姻菌株接种到二级种子培养基培养，与小麦粉拌和，即得。
进一步地，所述二级种子培养基以蒸馏水定容至1L，包括：蛋白胨20～40g/L，酵母粉5～15g/L，葡萄糖40～60g/L，磷酸氢二铵20～40g/L，pH值为6.8～7.2，
优选为蛋白胨30g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖50g/L，磷酸氢二铵30g/L，pH值为7.0。
进一步地，所述培养条件为25～32℃培养2～4d，优选为30℃培养3d；
拌和时，将培养菌株后的二级种子培养基与水的体积比为1:500；所述培养菌株后的二级种子培养基与水拌和后与麦粉的质量比为0.1～2‰，优选为1‰。
本发明还提供一种上述高产四甲基吡嗪的菌株在酒生产中的用途。
本发明所述高产四甲基吡嗪的菌株除了可应用于酒生产中外，还能用于食品、食品添加剂、药物中。
本发明具有的有益效果是：
本发明提供的高产四甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌菌株制备的柔雅型白酒中乙偶姻和四甲基吡嗪含量分别为268.1mg/L和5.6mg/L，较对照窖池提高49.4％和51.8％，且两者出酒率基本一致，对大曲微生物区系及最终酒体风格无明显影响，促进和提高了柔雅香型白酒健康风味物质。
附图说明
图1为试验曲和空白曲群落的DGGE轮廓图(1：对比曲2：试验曲)；
图2为试验窖池和对比窖池发酵过程温度变化趋势图。
具体实施方式
下面对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例数据均为平均值。
材料
菌株：从大曲中分离得到并经16SrDNA鉴定后保藏菌株，其中B.licheniformis9株、B.subtilis2株(表3)。
主要试剂：四甲基吡嗪标样(纯度≥98.0％)、三羟基丁酮(纯度≥98.0％)：中国标准试剂网；其他试剂均为国产分析纯。
活化培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，pH值为7.0，向该培养基中添加2％琼脂，0.1MPa灭菌20min，用于平板活化。
一级种子培养液：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，pH值为7.0，0.1MPa灭菌20min。
乙偶姻筛选培养基：纯麦粉，拌合到水分含量为30％～35％后0.1MPa灭菌20min。
二级种子培养基：蛋白胨30g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖50g/L，磷酸氢二铵30g/L，pH值为7.0，葡萄糖单独灭菌后加入，其余成分0.1MPa灭菌20min。
实施例1高产乙偶姻菌株筛选
将一级种子培养液按1‰的接种量接种于乙偶姻筛选培养基中，用不同温度，培养不同时间后，用60％的无水乙醇按照曲醅：无水乙醇＝1:2(100g曲醅，200ml无水乙醇)比例浸提24h，水浴蒸馏，探究不同温度、培养时间对乙偶姻含量的影响，结果如表1～3。
表1不同温度、培养时间对乙偶姻含量的影响(mg/L)
表2一级种子液生长情况
+：生长(104)，++生长较好(106)；+++：生长很好(108)；-：生长缓慢或自溶。
表1中结果显示，在小麦粉筛选培养基中，生长温度在20-60℃，培养25-30天乙偶姻大量富集，在30℃培养30天时，菌株刚好达到最佳生长状态，且菌株生长未老化，乙偶姻含量达到最高值，之后乙偶姻含量下降；表2中，温度升高，可使菌株的萌芽生长期和旺盛期提前，但菌株也衰老更快，液体培养基超过45℃培养3d后菌株还会出现自溶现象，温度越高自溶现象为明显，在30℃培养72h生长最好；故本发明将30℃培养30天作为一级种子培养的最佳培养条件。
将一级种子培养液按1‰的接种量接种于乙偶姻筛选培养基中，在曲房生产过程同期在30℃培养30d，用60％的无水乙醇按照曲醅：无水乙醇＝1:2(100g曲醅，200ml无水乙醇)比例浸提24h，水浴蒸馏，检测乙偶姻含量，如表3。
表3菌株初步筛结果
从表3看出，本发明筛选出的地衣芽孢杆菌9株、枯草芽孢杆菌2株中的乙偶姻含量均在1000mg/L以上，但地衣芽孢杆菌xf-4-1的产量达到了3284mg/L。
生理生化鉴定实验表明，通过上述实验得到的地衣芽孢杆菌xf-4-1菌株具有典型的芽孢杆菌特征，细胞直径为(0.8～1.0)μm×(1.5～2.0)μm，颜色为乳白色，菌落边缘不整起，有黏液，培养48h后菌落直径在1～2cm，革兰氏阳性，棒状。
将地衣芽孢杆菌xf-4-1菌株于2021年6月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名为Bacillus licheniformis xf-4-1，保藏编号为CCTCC NO:M2021664，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号。
实施例2强化大曲的制备
(1)二级种子不同培养条件对菌株生长的影响
将筛选出的高产乙偶姻的xf-4-1菌株逐级扩大到二级种子培养基，在不同温度条件下培养不同时间后，稀释500倍后按照1‰比例接种到麦粉培养基，拌和均匀后制成曲醅，探究不同培养条件对菌株生长的影响，结果如表4。
表4二级种子不同培养条件对菌株生长的影响
表4中，菌株在30℃培养72h生长最好。
(2)不同接种比例对大曲乙偶姻含量的影响
将筛选出的高产乙偶姻的xf-4-1菌株逐级扩大到二级种子培养基，30℃培养3d后，菌体浓度达到5.8×107cfu/mL，稀释500倍后按照成不同比例接种麦粉培养基，找到最佳接种比例，拌和均匀后制成曲醅。选取8间曲室作为试验组，另外8间作为对照组，结果如表5。
表5不同接种比例对目标产物的影响
表5中，添加比例在1‰时，乙偶姻产量最高，为3235.5mg/L。
(3)不同接种比例对曲胚发酵的影响
由表6可以看出，菌株添加量控制在1‰以内时，对曲醅发酵过程和成品大曲最终的外观无影响。通过对微生物区系的初步分析，表明在1‰添加量时对大曲微生物区系没有实质性的影响，且图1中条带20为强化前后B.licheniformis的明亮度有一定的提高，表明强化过程对该菌株的富集有一定的效果。
表6不同接种比例对曲醅发酵影响
将筛选出的高产乙偶姻的xf-4-1菌株逐级扩大到二级种子培养基，30℃培养3d后，菌体浓度达到5.8×107cfu/mL，稀释500倍后按照1‰的接种比例将菌液接种麦粉培养基，拌和均匀后制成曲醅，与对照组中的大曲进行品质对比，结果如表7、表8。
表7大曲感官评定表
表8大曲理化指标分析
从表7、8可以看出，对照组和试验组的大曲理化指标基本相当，本发明添加的外源微生物对大曲理化指标没有明显的影响。
(4)强化大曲对糟醅的理化指标的影响
对照组和试验组的入窖糟醅参数控制相同：曲药使用量为粮食使用量的20％，入窖水分控制在55-56％，入窖酸度控制在1.8，储存90d后通过对发酵过程和发酵结束、对糟醅发酵温度、理化指标进行对比分析，结果如表9、表10、图2。
表9储存90d后使用曲理化指标分析
表10糟醅理化指标分析
从表9可以看出，与对照组相比，储存90d后试验组中的大曲酸度、糖化力、液化力、发酵力无明显差异；图2中，入窖温度控制在21℃左右，入窖后20天达到顶温，发酵周期75天，符合“前缓、中挺、后缓落”变化趋势，两者温度变化趋势基本相同，发酵过程正常。从表10中出窖糟醅检测结果显示，糟醅各项指标均表明发酵结果正常，试验窖和对照窖检测结果差异性不明显；上述结果表明，强化大曲和非强化大曲对糟赔发酵过程及最终理化指标影响不明显。
(5)强化大曲对出酒率的影响
表11酒体主要风味组分分析
表11中，对照窖池的乙酸乙酯、丁酸乙酯及乳酸乙酯略高于试验窖池，己酸乙酯则相反。试验窖乙偶姻和四甲基吡嗪含量分别为286.1mg/L和5.6mg/L，较对照窖池提高49.4％和51.8％。试验窖出酒率高于对比窖，表明强化后的大曲能够提高出酒率及其风味品质。
验证实施例1中筛选出的9株地衣芽孢杆菌、2株枯草芽孢杆菌对出酒率的影响，结果如表12。
表12不同菌株的出酒率
由上表可知，本发明筛选出的地衣芽孢杆菌xf-4-1出酒率最高。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。