一种小鼠高血压脑出血模型的造模方法
阅读说明：本技术 一种小鼠高血压脑出血模型的造模方法 (Modeling method of mouse hypertensive cerebral hemorrhage model ) 是由 胡泊 荣良群 张清秀 于 2021-08-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种小鼠高血压脑出血模型的造模方法,所述方法步骤如下：首先在小鼠的左心室穿刺取血,然后通过擦拭清理覆盖颅骨的软组织暴露颅骨术野,确定颅骨表面进针点后进行钻孔,再通过脑立体定位仪于钻孔处注射自体血,完成注射后,用骨蜡封住钻孔,消毒切口,缝合皮肤,即可。本发明采取左心室穿刺取动脉血,能在提取足量动脉血的前提下不降低小鼠存活率,通过小鼠脑定位仪精准地将自体动脉血回注入脑内基底节区尾壳核,形成稳定的血肿,为后续的实验提供保障,利于实验对照研究,且与临床上高血压患者病理变化和疾病转归极为相似,对脑出血后的疾病转归及治疗方案具有重要意义。(The invention discloses a molding method of a mouse hypertensive cerebral hemorrhage model, which comprises the following steps: firstly, puncturing the left ventricle of a mouse to take blood, then cleaning soft tissues covering the skull by wiping to expose a skull surgical field, drilling holes after determining a needle inserting point on the surface of the skull, then injecting autoblood at the drilling holes by a brain stereotaxic apparatus, sealing the drilling holes by bone wax after completing injection, disinfecting incisions, and suturing the skin. According to the invention, the arterial blood is obtained by puncturing the left ventricle, the survival rate of the mouse can not be reduced on the premise of extracting sufficient arterial blood, the autologous arterial blood is accurately injected back into the caudal putamen of the basal ganglia region in the brain through the mouse brain positioning instrument to form stable hematoma, the follow-up experiment is guaranteed, the experimental contrast research is facilitated, the pathological change and the disease outcome of the clinical hypertension patient are very similar, and the method has important significance for the disease outcome and the treatment scheme after cerebral hemorrhage.)
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种小鼠高血压脑出血模型的造模方法。
背景技术
脑实质内出血是第二大常见卒中类型，具有高发病率、高死亡率和高致残率的特点，在我国约占全部脑卒中的20％～30％。高血压性脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)常发生在基底核的壳核及内囊区，约占ICH的70％，壳核出血常侵入内囊，常有病灶对侧偏瘫、偏身感觉缺失和同向性偏盲。脑出血后会引起脑水肿、血脑屏障完整性破坏、肢体感觉运动障碍和神经功能缺损。因此研究脑出血后的疾病转归及治疗方案具有重要意义，而建立有效、稳定的动物模型对于后续的研究是至关重要的第一步。
目前文献中报道主要有两种脑出血造模方法：胶原酶诱导脑出血模型和颅内自体血注入建立脑出血模型。其中胶原酶诱导脑出血模型是通过立体定位仪将胶原酶注射到小鼠右侧基底区，建立了脑出血模型。细菌胶原酶是一种蛋白酶，它溶解大脑毛细血管周围的细胞外基质并使其变弱，导致血管破裂和随后的血液外溢。但血肿体积不好控制，呈弥散性出血，不利于实验对照研究。且较高的死亡率限制了该模型的应用。另外胶原酶本身具有神经毒性，且会放大炎症反应，影响模型的建立，不能很好的模拟人类脑出血的病理变化和疾病转归。另一种颅内自体血注入脑出血模型，该方法是从鼠自体抽血后利用脑定位仪注入基底节区，文献中有报道从鼠尾静脉、眶周取血，但抽取的血液为静脉血，而高血压脑出血形成血肿的是动脉血，因此该方法不能很好地模拟临床上高血压脑出血。也有用剪尾法取血，将鼠尾端剪断取血，但该方法取得动静脉混合血，也非单纯动脉血。另外有文献报道从鼠尾动脉穿刺取血，该方法适用于大鼠，而小鼠尾动脉位于腹侧面深部，非常细，穿刺很困难，即使穿刺成功，取血量也有限，不能很好的满足实验需求。
综上所述，现有造模技术存在如下缺点和不足之处：(1)无法在小鼠体内找到最佳的穿刺部位和穿刺通道，从小鼠体内抽取足量的动脉血，以供实验所需。(2)穿刺取血后无法保证小鼠的存活率。(3)无法形成稳定的血肿，从而不能为后续的实验提供保障，不利于实验对照研究，不能很好的模拟人类脑出血的病理变化和疾病转归。因此探索一种新的优化的脑出血造模方法具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种小鼠高血压脑出血模型的造模方法，能在提取足量动脉血的前提下不降低小鼠存活率，且能形成稳定的血肿，为后续的实验提供保障，利于实验对照研究。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种小鼠高血压脑出血模型的造模方法，包括以下步骤：
步骤1)左心室穿刺取血：小鼠经异氟烷气体诱导麻醉，将小鼠仰卧位放置并将其四肢固定，使小鼠胸部、上腹部充分暴露；对小鼠进行胸部、上腹部大范围消毒，然后在其胸骨剑突与肋骨夹角处，倾斜10°～20°对准其心尖部穿刺抽血，将动脉血迅速转移备用；
步骤2)暴露颅骨术野：用手术刀在小鼠的头皮上做一个1cm长的中线切口，擦拭清理覆盖颅骨的软组织，以暴露垂直交点，即冠状和矢状缝交合点；
步骤3)确定颅骨表面进针点：将微量进样器安装到注射泵上，并将针头立体定向到冠状和矢状缝交合点上并调零；接下来，调整立体定向操作臂，将针放置在冠状和矢状缝交合点前0.2mm和右侧旁开2mm的位置；在此坐标使用变速钻在小鼠的颅骨上钻孔；
步骤4)脑立体定位仪注射自体血：迅速抽取步骤1)备用的动脉血转移到微量进样器的玻璃筒中，将针头通过小鼠的颅骨表面钻孔处，向腹侧推进3.7mm，即可到达右侧尾壳核处，注入自体动脉血；
步骤5)静置微量进样器：完成注射后，将针头留在原位10min，然后以1mm/min的速度抽回，减少穿刺道回血，用骨蜡封住钻孔；
步骤6)消毒切口，缝合皮肤，即可。
优选地，所述小鼠为KM小鼠，来源于swiss小鼠。
优选地，步骤4)所述注入自体动脉血的注入速度为2μL/min。
优选地，步骤6)所述缝合皮肤时，缝合处注意预防感染，适当向小鼠腹腔注射生理盐水补液。
优选地，还包括步骤7)：于术后24h对小鼠采用adhesive removal试验评估或进行神经功能缺损评分，符合评估/评分标准的小鼠即为造模成功的小鼠。
优选地，所述adhesive removal试验的步骤如下：将0.3cm×0.4cm的胶带贴在小鼠对侧受伤的前爪上；通过记录去除胶带的时间，测量触觉运动反应，最大观察时间为120s；去除胶带的时间＞10s为造模成功的小鼠。
优选地，所述神经功能缺损评分的步骤如下：
(1)将小鼠置于空旷的平台表面自由活动2～5min；
(2)将小鼠置于45°网格斜面60s；
(3)将小鼠提尾倒立30s；
(4)将小鼠提尾倒立并使其前肢置于桌面30s；
所述神经功能缺损评分的评分标准如下：
针对步骤(1)：身体对称性正常，无转圈现象，步态正常，触须后双侧反应对称的小鼠评分为0；身体轻微不对称，向一侧偏斜活动，一侧肢体僵硬不灵活，触须后轻微不对称的小鼠评分为1；身体中度不对称，偶尔向一侧转圈，一侧肢体跛行，触须后显著不对称的小鼠评分为2；身体显著不对称，一直向一侧转圈，肢体颤抖滑步，触须后同侧肢体反应消失，对侧反应减弱的小鼠评分为3；身体极其不对称，绕轴旋转、摇摆或无活动，静止不走，触须后双侧肢体感觉迟钝的小鼠评分为4；
针对步骤(2)：正常攀爬的小鼠评分为0；爬行吃力，肢体无力的小鼠评分为1；静止于斜面，不能上下活动的小鼠评分为2；缓缓滑下斜面的小鼠评分为3；无阻力迅速滑下的小鼠评分为4；
针对步骤(3)：表现正常的小鼠评分为0；轻微不对称的小鼠评分为1；明显不对称的小鼠评分为2；显著不对称的小鼠评分为3；显著不对称，且前肢或肢体无活动的小鼠评分为4；
针对步骤(4)：表现正常的小鼠评分为0；倾向于转向一侧的小鼠评分为1；向一侧转圈的小鼠评分为2；迟缓地向一侧转圈的小鼠评分为3；肢体无法活动的小鼠评分为4；
所述神经功能缺损评分共计28分，评分＞0为造模成功的小鼠。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明采取左心室穿刺取动脉血，此穿刺方法可以取足量的动脉血以满足实验需求，且取血后小鼠的存活率不会降低。
2、通过小鼠脑定位仪精准地将自体动脉血回注入脑内基底节区尾壳核，形成稳定的血肿，为后续的实验提供保障，利于实验对照研究，且与临床上高血压患者病理变化和疾病转归极为相似，因此这是一种很好的高血压脑出血模型造模方法。
附图说明
图1为实施例2中Sham组与ICH组第1、2、3天的小鼠脑部切开后冠状面：(1)为Sham组，(2)为ICH组第1天，(3)为ICH组第2天，(4)为ICH组第3天；
图2为实施例3中Sham组与ICH组的小鼠的脑水肿系数统计图(****P＜0.0001，n＝5)；
图3为实施例4中Sham组与ICH组的小鼠的伊文氏蓝渗透率结果(**P＜0.05，n＝5)；
图4为实施例5中Sham组与ICH组的小鼠的adhesive removal test结果(*P＜0.05，n＝5)；
图5为实施例6中Sham组与ICH组的小鼠的Neurological deficit score统计图(****P＜0.0001，n＝5)。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施例对本发明做进一步详细说明。
实施例1
一种小鼠高血压脑出血模型的造模方法，具体步骤如下：
(1)左心室穿刺取血：小鼠经异氟烷气体诱导麻醉，将小鼠仰卧位放置于硬纸板上，用医用胶布将其四肢固定，棉线扣过小鼠前齿上，并牵拉固定，使小鼠胸部、上腹部充分暴露。使用棉签蘸取75％标准医用酒精，进行胸部、上腹部大范围消毒，用左手触摸胸部心脏搏动最强点(心尖部)，然后用1mL注射器在胸骨剑突与肋骨夹角处，倾斜10°～20°对准心脏搏动最强点穿刺，边退针边回抽血，将动脉血迅速转移至1.5mL EP管中备用。
(2)暴露颅骨术野：用手术刀在头皮上做一个1cm长的中线切口，使用蘸取双氧水的棉签擦拭清理覆盖颅骨的软组织，以暴露垂直交点，即冠状和矢状缝交合点(bregma)。
(3)确定颅骨表面进针点：将微量进样器(50μL)安装到注射泵上，并将针头立体定向到bregma上并调零。接下来，调整立体定向操作臂，将针放置在bregma点前0.2mm和右侧旁开2mm的位置。在此坐标使用带0.6mm钻头的变速钻在颅骨上钻孔。
(4)脑立体定位仪注射自体血：迅速从EP管中抽取20μL动脉血(可根据造模需要调整所抽取血液的体积)转移到微量进样器的玻璃筒中，将针头通过颅骨表面钻孔处，向腹侧推进3.7mm，即可到达右侧尾壳核处，以2μL/min的速度注入自体动脉血20μL。
(5)静置微量进样器：完成注射后，将针头留在原位10min，然后以1mm/min的速度抽回，减少穿刺道回血，用骨蜡封住钻孔。
(6)消毒切口，缝合皮肤。
术后处理：缝合处注意预防感染，适当腹腔注射生理盐水补液。
实施例2小鼠高血压脑出血造模后血肿冠状面
将5～7周龄雄性昆明小鼠(来源于swiss小鼠)10只，体重在20～30g，分为两组(n＝5)，分别为Sham、ICH组，安静环境下饲养，自由饮水取食。Sham组为不抽取自体血，仅将微量进样器从钻孔向腹侧插入3.7mm，拔针前保持针留在原位10min，然后以1mm/min的速度抽回，用骨蜡封住钻孔，缝合皮肤。ICH组按实施例1所述造模方法具体步骤执行。造模后观察Sham组冠状面、ICH组血肿冠状面，ICH组冠状面以注射点为中心点作冠状切开，选取1、2、3天为观察时间点，切开后冠状面如图1所示。
结果如图1所示，Sham组(图1(a))冠状切面只显示微量进样器穿刺道，ICH组冠状切面显示造模后形成明显的、稳定的血肿，第1天(图1(b))血肿体积最大，随后血肿体积大小随时间推移(图1(c)-图1(d))逐渐减小。这些变化符合临床上高血压脑出血后基底节区血肿逐渐被吸收消散的病理变化和疾病转归。
实施例3小鼠高血压脑出血造模后脑水肿程度测定
将5～7周龄雄性昆明小鼠10只，体重在20～30g，分为两组(n＝5)，分别为Sham、ICH组，安静环境下饲养，自由饮水取食。Sham组为不抽取自体血，仅将微量进样器从钻孔向腹侧插入3.7mm，拔针前保持针留在原位10min，然后以1mm/min的速度抽回，用骨蜡封住钻孔，缝合皮肤。ICH组按实施例1所述造模方法具体步骤执行。然后采用干湿重法，将各组在24h的小鼠行腹腔注射10％水合氯醛诱导麻醉，断头取脑，去除嗅球、小脑及脑干，立即称重即为湿重，然后脑组织放入60℃烤箱中72h烘干，待恢复至室温后称取脑组织重量即为干重。计算各组小鼠脑含水量(％)＝(脑组织湿重-脑组织干重)/湿重×100％。所测得的脑水肿系数统计图如图2所示。
结果如图2所示，Sham组的脑水肿系数在0.785上下徘徊，而ICH组的脑水肿系数显著高于Sham组，ICH组与Sham组比较，****P＜0.0001，n＝5，有明显统计学差异。说明造模后脑水肿程度明显增高。符合临床上高血压脑出血后患者会出现脑水肿的临床特征。
实施例4小鼠高血压脑出血造模后血脑屏障完整性测定
将5～7周龄雄性昆明小鼠10只，体重在20～30g，分为两组(n＝5)，分别为Sham、ICH组，安静环境下饲养，自由饮水取食。Sham组为不抽取自体血，仅将微量进样器从钻孔向腹侧插入3.7mm，拔针前保持针留在原位10min，然后以1mm/min的速度抽回，用骨蜡封住钻孔，缝合皮肤。ICH组按实施例1所述造模方法具体步骤执行。然后用生理盐水作配制2％伊文氏蓝。在脑出血24h对小鼠按注射计量为4mL/kg，经尾静脉注射2％伊文氏蓝，灌流3h。出血侧脑组织称重：10％水合氯醛腹腔注射后诱导麻醉，待小鼠完全麻醉后，开胸用50mL生理盐水进行心脏灌注，断头将脑组织自颅骨中完整取出，去除嗅球、小脑及脑干，取出血侧大脑半球，称取脑组织湿重。
萃取：将出血侧大脑半球放入装有3mL已预冷甲酰胺的EP管中，用塑封膜封好EP管，置于60℃水浴锅中孵育72h，以3000r/min的转速将样本离心10min，取出上清液备用。
伊文氏蓝含量测定：
(1)伊文氏蓝标准品：取20μg伊文氏蓝，用甲酰胺定容为1mL，将伊文氏蓝稀释成20μg/mL的浓度。
(2)将标准品按200μL、100μL、50μL、25μL、12.5μL、6.25μL、0μL加到96孔板的标准品孔中，在标准品孔中加入甲酰胺补充体积至200μL。在96孔板的样品孔中加200μL样品，如下表1所示。
表1伊文氏蓝浓度测定上样量
(3)吸光度测定：应用酶标仪在632nm波长处检测各组标准品及样本的OD值，绘制EB浓度标准曲线，根据各组样品的OD值计算出待测样本伊文氏蓝含量，再除以出血侧脑组织湿重，测出每组伊文氏蓝的渗透率，以此提示血脑屏障通透性。所测得的伊文氏蓝渗透率结果如图3所示。
结果如图3所示，Sham组的伊文氏蓝渗透率数值在1.349上下徘徊，而ICH组的伊文氏蓝渗透率数值在9.415上下徘徊，明显高于Sham组，ICH组与Sham组比较，**P＜0.05，n＝5，差异具有统计学意义。说明造模后伊文氏蓝渗透率增高，提示血脑屏障通透性增高，即血脑屏障完整性遭到破坏。符合临床上高血压脑出血后患者血脑屏障完整性会遭到破坏的病理变化特征。
实施例5小鼠高血压脑出血造模后触觉和运动功能测定
将5～7周龄雄性昆明小鼠10只，体重在20～30g，分为两组(n＝5)，分别为Sham、ICH组，安静环境下饲养，自由饮水取食。Sham组为不抽取自体血，仅将微量进样器从钻孔向腹侧插入3.7mm，拔针前保持针留在原位10min，然后以1mm/min的速度抽回，用骨蜡封住钻孔，缝合皮肤。ICH组按实施例1所述造模方法具体步骤执行。采用adhesive removal试验评估造模后24h触觉反应和感觉运动功能。将0.3cm×0.4cm的胶带贴在对侧受伤的前爪上。通过记录去除胶带的时间，测量触觉运动反应，最大观察时间为120s，去除胶带的时间＞10s为造模成功的小鼠。所得到的adhesive removal test结果如图4所示。
结果如图4所示，Sham组的adhesive removal test测试时间在6.8s上下徘徊，而ICH组的测试时间在74s上下徘徊，明显高于Sham组，ICH组与Sham组比较，*P＜0.05，n＝5，差异具有统计学意义。说明造模后触觉和运动功能减弱。符合临床上高血压脑出血后患者肢体触觉和运动功能减弱的临床查体特征。
实施例6小鼠高血压脑出血造模后神经功能缺损评分
将5～7周龄雄性昆明小鼠10只，体重在20～30g，分为两组(n＝5)，分别为Sham、ICH组，安静环境下饲养，自由饮水取食。Sham组为不抽取自体血，仅将微量进样器从钻孔向腹侧插入3.7mm，拔针前保持针留在原位10min，然后以1mm/min的速度抽回，用骨蜡封住钻孔，缝合皮肤。ICH组按实施例1所述造模方法具体步骤执行。于术后24h对小鼠进行神经功能缺损评分，依据28分神经功能缺损评分量表(Neurological deficit score)进行，如下表2所示，评分＞0为造模成功的小鼠。
表2小鼠28分神经功能缺损评分量表
所得到的Neurological deficit score统计图结果如图5所示。
结果如图5所示，Sham组的Neurological deficit score评分为0，而ICH组的评分在12.4上下徘徊，显著高于Sham组，ICH组与Sham组比较，****P＜0.0001，n＝5，有明显统计学差异。说明造模后神经功能缺损严重。符合临床上高血压脑出血后患者神经功能缺损的神经功能评分和查体特征。
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