利用不同落体打击对sd大鼠脑外损伤造模的方法
阅读说明：本技术 利用不同落体打击对sd大鼠脑外损伤造模的方法 (Method for modeling SD rat brain injury by using different falling body hitting ) 是由 江斌 熊忠贤 叶健 于 2021-08-06 设计创作，主要内容包括：本发明利用不同落体打击对SD大鼠脑外损伤造模的方法,包括轻型外伤性颅脑损伤造模,神经功能缺损脑损伤造模和昏迷脑损伤造模,所述落体包括砝码,克氏针或圆柱形撞击锤。本发明通过自制自由落体撞击器,结合不同重量的不同落体自由坠落对SD大鼠脑外损伤造模,可以建立轻型外伤性颅脑损伤模型,神经功能缺损脑损伤模型和昏迷脑损伤模型。(The invention relates to a method for modeling the brain external injury of an SD rat by utilizing different falling body striking, which comprises light traumatic brain injury modeling, nerve function defect brain injury modeling and coma brain injury modeling, wherein the falling body comprises a weight, a Kirschner wire or a cylindrical striking hammer. According to the invention, a light traumatic brain injury model, a neurological function impairment brain injury model and a coma brain injury model can be established by self-making a free fall impactor and combining different fall free falls with different weights to model the external brain injury of the SD rat.)
技术领域
本发明属于动物造模技术领域，涉及利用不同落体打击对SD大鼠脑外损伤造模的方法。
背景技术
创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)是指由于外部机械力的作用导致大脑的损伤，其能导致脑外伤幸存者出现短暂或永久的躯体功能障碍、认知障碍以及心理障碍，并且颅脑外伤是神经退行性病变的重要发表因素之一。为了了解颅脑外伤病理生理过程，并制定出新的治疗方法，建立良好的动物模型显得至关重要。
近年来，国内外学者针对颅脑损伤的病理生理变化过程和损伤机理进行了广泛而深入的研究。大量的基础实验和临床研究结果表明，颅脑外伤的损伤机制主要包括原发性损伤和继发性损伤两个方面。
原发性损伤主要与外力的大小、受力部位及损伤程度等密切相关，直接导致结构破坏，脑组织变形等，是颅脑外伤预防措施的重要研究方向之一。继发性损伤是颅脑外伤临床治疗和实验研究的基础，涉及神经炎症反应、氧自由基、坏死等多个方面，易引起“损伤-炎症-损伤”的恶性循环，进一步加剧神经损伤，导致大脑的间接损伤。其难以恢复主要体现在两个方面：1、外部环境阻碍神经元的再生、修复。2、内在阻碍再生、修复的因素。
由于啮齿类动物模型低成本、占用空间较小以及对结果易于进行标准化评估，自从1990年开始，越来越广泛地采用啮齿类动物进行脑外伤研究。在大鼠的实验动物模型中，打击型致伤机制通过可控性的外力来调节对大脑造成的损伤程度，进而量化研究不同损伤情况下的病理生理机制，对指导治疗和预后评估更有意义。其中3种模型近年应用较广泛：落体打击模型(weight-drop models)，液压脑损伤模型(fluid percussion injury，FPI)，控制性皮质撞击模型(controlled cortical impact，CCI)。
发明内容
基于以上，本发明的目的在于提供利用不同落体打击对SD大鼠脑外损伤造模的方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
利用不同落体打击对SD大鼠脑外损伤造模的方法，包括轻型外伤性颅脑损伤造模，神经功能缺损脑损伤造模和昏迷脑损伤造模，所述落体包括砝码，克氏针或圆柱形撞击锤，其中：
所述轻型外伤性颅脑损伤造模包括：将麻醉后的SD大鼠固定后，在大鼠头部下方放4cm的海绵垫，等待大鼠苏醒，当大鼠逐渐苏醒并且有肢体活动时，将120g的砝码从上方0.34m处自由坠落，其作用在大鼠的头部，重复3次；
所述神经功能缺损脑损伤造模包括：将麻醉后的SD大鼠头部备皮后固定，头部消毒、暴露颅骨、剥离骨膜并保持硬脑膜完整，将20g的砝码/克氏针从上方15～20cm处自由坠落，其作用于大鼠的硬脑膜，使脑组织产生瞬间形变，致顶叶脑挫裂伤，迅速将固定大鼠的装置移开；其中，克氏针采用规格二十公分左右，直径在0.5-2毫米的规格均可；
所述昏迷脑损伤造模包括：将麻醉后的SD大鼠头部备皮后固定，头部消毒、暴露颅骨，在颅骨表面垫一个金属垫片，等待大鼠苏醒，当大鼠逐渐苏醒时，将400g圆柱形撞击锤从上方自由下落，撞击颅骨表面上的金属垫片，根据大鼠体重不同，其高度在38～42cm之间，撞击后大鼠颅骨出现凹陷性骨质。
优选地，所述轻型外伤性颅脑损伤造模和昏迷脑损伤造模中的麻醉方式均包括诱导麻醉和维持麻醉，所述诱导麻醉包括：将SD大鼠放入异氟烷呼吸麻醉诱导箱中，调节空气泵，氧气流量控制1L/min，调节麻醉罐输出浓度，调整至5％异氟烷吸入诱导麻醉SD大鼠；所述维持麻醉包括：诱导麻醉成功后用2％异氟烷面罩吸入维持麻醉。
优选地，所述轻型外伤性颅脑损伤造模中，SD大鼠表现出侧肢活动受限，四肢不协调，少数出现口腔出血或鼻腔出血，说明轻型外伤性颅脑损伤造模成功。
优选地，所述神经功能缺损脑损伤造模中的麻醉方式为：SD大鼠称重后用10％的水合氯醛按350mg/kg剂量进行腹腔注射。
优选地，所述神经功能缺损脑损伤造模和昏迷脑损伤造模中，暴露颅骨采用的方法为：头正中线切口，长3cm，钝性分离软组织、骨外膜，暴露颅骨。
更优选地，所述神经功能缺损脑损伤造模中，剥离骨膜采用的方法为：用牙科钻在冠状缝后、中线旁区域钻一直径5mm骨窗，保持硬脑膜完整。
优选地，所述神经功能缺损脑损伤造模还包括撞击后切口内滴注16万IU青霉素4～5滴，缝合头皮，通过神经功能缺损评分(mNSS)判断造模是否成功。
优选地，所述昏迷脑损伤造模中，昏迷评定标准为：大鼠术后观察意识状态，分为6级：1级，在笼内活动如常；2级，在笼内活动减少；3级，在笼内活动减少并运动失调；4级，当背部放在笼底部的时能滚动(翻正反射存在)但不能站立；5级，翻正反射消失，但对疼痛刺激有肢体回缩反应；6级，对任何刺激无反应，其中5、6级被认为是昏迷状态。
优选地，所述轻型外伤性颅脑损伤造模，神经功能缺损脑损伤造模和昏迷脑损伤造模中，均采用脑立体定位仪固定SD大鼠。
更优选地，采用以下方法进行固定：用镊子拨开门齿，将门齿卡在动物适配器的门齿夹的方孔内，压下门齿夹横杆。调节门齿夹高度，使动物耳间线与定位仪耳杆连线保持一致；在定位仪底座上采用泡沫垫高动物身体，使动物头部与身体水平保持水平，防止动物的呼吸阻塞；将左侧耳杆插入动物耳道，调节左、右侧耳杆使动物头部保持在U型开口的中心位置，先锁紧固定左侧耳杆，后固定右侧耳杆，使动物头部不能晃动，同时调节门齿夹螺丝。
本发明具有的有益效果为：
本发明通过自制自由落体撞击器，结合不同重量的不同落体自由坠落对SD大鼠脑外损伤造模，可以建立轻型外伤性颅脑损伤模型，神经功能缺损脑损伤模型和昏迷脑损伤模型。
附图说明
图1是本发明中自制自由落体撞击器的结构示意图，其中：1、铁架台；2、鳄鱼夹；3、橡胶管；4、不锈钢钢棒；5、海绵垫；6、小块海绵。
图2显示本发明将SD大鼠固定在脑立体定位仪上的状态。
图3显示本发明撞击前大鼠的放置情况。
图4显示本发明实施例2剥离骨膜后的大鼠颅骨状态。
图5显示本发明实施例2缝合头皮后的大鼠。
图6显示本发明实施例2造模后取样情况。
图7显示本发明实施例3将垫片固定在大鼠颅骨表面。
图8显示本发明实施例3撞击后大鼠颅骨出现凹陷性骨质。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
以下实施例中均采用自制自由落体撞击器，参照Marmarou模型改造致伤装置，如图1所示，具体包括：
i.圆柱形橡胶管3，长度为1.0m，内径19.0mm，外径25.0mm；并在管壁上每10cm钻一直径为5mm的小孔，对应两排，以减少空气阻力。
ii.立方形海绵垫5，规格为40.0cm×30.0cm×10.0cm；小块海绵6，规格为3.0cm×2.0cm×1.0cm，各一块。
iii.打击垫片：直径为10mm、厚为3mm的圆形不锈钢片，用以制作弥漫性轴突损伤模型，另一种在其不锈钢垫片距中心2.5mm处钻一直径1.5mm的小孔，置入一不锈钢圆柱，使之高出垫片平面3mm以制作弥漫性脑损伤同时合并局灶性脑损伤动物模型。
iv.不锈钢钢棒4一根，直径18.0mm，重量470.0g。
v.其他：铁架台1、鳄鱼夹2等，铁架台1包括底座和垂直于底座的直金属杆，为实验室常规零部件。
两个鳄鱼夹2固定橡胶管3于铁架台1，使橡胶管3垂直于地面，下端离地面约15.0cm，以放置海绵垫5和大鼠，小块海绵6置于大鼠颅骨正下方以保证不锈钢钢棒4垂直打击大鼠颅骨上的金属垫片，垫片紧贴于大鼠颅骨表面。
实施例1轻型外伤性颅脑损伤造模
一、实验准备
实验动物：雄性SD大鼠8周龄。
实验仪器及手术器械：120g砝码、脑立体定位仪、异氟烷呼吸麻醉机、自制自由落体撞击器
二、实验操作
1.麻醉：采用异氟烷呼吸麻醉机进行SD大鼠进行麻醉。
1.1诱导麻醉：将SD大鼠放入异氟烷呼吸麻醉诱导箱中。调节空气泵，氧气流量控制1L/min，调节麻醉罐输出浓度，调整至5％异氟烷吸入诱导麻醉SD大鼠。
1.2维持麻醉：诱导麻醉成功后(麻醉成功指标：大鼠四肢无自主活动，肌肉松弛，呼吸平顺)用2％异氟烷面罩吸入维持麻醉。
2.固定：将SD大鼠固定在脑立体定位仪上，如图2所示。用镊子拨开门齿，将门齿卡在动物适配器的门齿夹的方孔内，压下门齿夹横杆。调节门齿夹高度，使动物耳间线与定位仪耳杆连线保持一致；在定位仪底座上采用泡沫垫高动物身体，使动物头部与身体水平保持水平，防止动物的呼吸阻塞；将左侧耳杆插入动物耳道，调节左、右侧耳杆使动物头部保持在U型开口的中心位置，先锁紧固定左侧耳杆，后固定右侧耳杆，使动物头部不能晃动，同时调节门齿夹螺丝。
3.撞击头部：SD大鼠固定在脑立体定位仪后，在大鼠头部下方放4cm的海绵垫，如图3所示，关闭异氟烷呼吸麻醉机，等待大鼠苏醒，当大鼠逐渐苏醒并且有肢体活动时，将120g的砝码从装置上方0.34m处自由坠落，其作用在大鼠的头部，重复3次。
4.观察：SD大鼠表现出侧肢活动受限，四肢不协调，少数出现口腔出血或鼻腔出血。说明轻型外伤性颅脑损伤造模成功。
这种方式适合建立轻型外伤性颅脑损伤模型。
实施例2神经功能缺损脑损伤造模
一、实验准备
实验动物：8周龄雄性SD大鼠
实验仪器及手术器械：10％水合氯醛、脑立体定位仪、异氟烷呼吸麻醉机、自制管道(20-30cm不等，根据实验情况制作合适的管道)、20g砝码(可用克氏针代替，如A162)、牙科钻、手术刀片、手术刀柄、手术剪刀、眼科镊子(2把)、尺子、棉签、碘伏消毒液、持针器、止血钳、针线(4-0编织线)
二、实验操作
1.麻醉：SD大鼠称重后用10％的水合氯醛按350mg/kg剂量进行腹腔注射。
2.备皮：大鼠头部剃毛。
3.固定：将SD大鼠固定在脑立体定位仪上。用镊子拨开门齿，将门齿卡在动物适配器的门齿夹的方孔内，压下门齿夹横杆。调节门齿夹高度，使动物耳间线与定位仪耳杆连线保持一致；在定位仪底座上采用泡沫垫高动物身体，使动物头部与身体水平保持水平，防止动物的呼吸阻塞；将左侧耳杆插入动物耳道，调节左、右侧耳杆使动物头部保持在U型开口的中心位置，先锁紧固定左侧耳杆，后固定右侧耳杆，使动物头部不能晃动，同时调节门齿夹螺丝。
4.消毒：将大鼠头部用碘伏消毒。
5.暴露颅骨：头正中线切口，长3cm，钝性分离软组织、骨外膜，暴露颅骨。
6.剥离骨膜：用牙科钻在冠状缝后、中线旁区域钻一直径5mm骨窗，保持硬脑膜完整，如图4所示。
7.撞击造模：SD大鼠固定在脑立体定位仪后，在大鼠头部下方放4cm的海绵垫，将20g的砝码从装置上方15～20cm处自由坠落，其作用于大鼠的硬脑膜，使脑组织产生瞬间形变，致顶叶脑挫裂伤，迅速将装置移开。
8.缝合：撞击后切口内滴注16万IU青霉素4～5滴，缝合头皮，如图5所示。
9.神经功能缺损评分：通过神经功能缺损评分(mNSS)判断造模是否成功。国际标准目前定义正常SD大鼠为0分，mNSS评分在1-6分之间为轻度损伤，7-12分之间为中度损伤，13-18分之间为重度损伤。
表1.神经功能缺损评分表
10.造模后取样，如图6所示，可见脑损伤明显。
这种方式适合建立中度脑损伤模型。
实施例3昏迷脑损伤造模
一、实验准备
实验动物：8周龄雄性SD大鼠
实验仪器及手术器械：脑立体定位仪、异氟烷呼吸麻醉机、牙科钻、自制自由落体撞击器、薄铝垫片、400g圆柱形撞击锤、手术刀片、手术刀柄、手术剪刀、眼科镊子(2把)、尺子、棉签、碘伏、持针器、止血钳、针线(4-0编织线)
二、实验操作
1.麻醉：采用异氟烷呼吸麻醉机进行SD大鼠进行麻醉。
1.1诱导麻醉：将SD大鼠放入异氟烷呼吸麻醉诱导箱中。调节空气泵，氧气流量控制1L/min，调节麻醉罐输出浓度，调整至5％异氟烷吸入诱导麻醉SD大鼠。
1.2维持麻醉：诱导麻醉成功后(麻醉成功指标：大鼠四肢无自主活动，肌肉松弛，呼吸平顺)用2％异氟烷面罩吸入维持麻醉。
2.备皮：大鼠头部剃毛。
3.固定：将SD大鼠固定在脑立体定位仪上。用镊子拨开门齿，将门齿卡在动物适配器的门齿夹的方孔内，压下门齿夹横杆。调节门齿夹高度，使动物耳间线与定位仪耳杆连线保持一致；在定位仪底座上采用泡沫垫高动物身体，使动物头部与身体水平保持水平，防止动物的呼吸阻塞；将左侧耳杆插入动物耳道，调节左、右侧耳杆使动物头部保持在U型开口的中心位置，先锁紧固定左侧耳杆，后固定右侧耳杆，使动物头部不能晃动，同时调节门齿夹螺丝。SD大鼠固定在脑立体定位仪后，在大鼠头部下方放4cm的海绵垫。
4.消毒：将大鼠头部用碘伏消毒。
5.暴露颅骨：头正中线切口，长3cm，钝性分离软组织、骨外膜，暴露颅骨。
6.垫铝片：在其颅骨顶部垫一个薄铝垫片，如图7所示，然后关闭异氟烷呼吸麻醉机，等待大鼠苏醒。
7.撞击：当大鼠逐渐苏醒时，将400g圆柱形撞击锤从装置上方沿自制自由落体撞击器的直金属杆自由下落，撞击颅骨表面上的薄铝垫片。根据大鼠体重不同，其高度在38～42cm之间，撞击后大鼠颅骨出现凹陷性骨质，如图8所示。
8.昏迷评定标准：大鼠术后观察意识状态，分为6级：1级，在笼内活动如常；2级，在笼内活动减少；3级，在笼内活动减少并运动失调；4级，当背部放在笼底部的时能滚动(翻正反射存在)但不能站立；5级，翻正反射消失，但对疼痛刺激有肢体回缩反应；6级，对任何刺激无反应。其中5、6级被认为是昏迷状态。
这种方式适合建立重度脑损伤模型。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为更清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方法予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
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