一种检测生物体内Fe2+的双光子荧光探针及其制备方法和的应用
阅读说明：本技术 一种检测生物体内Fe2+的双光子荧光探针及其制备方法和的应用 (Detection of Fe in organism2+Two-photon fluorescent probe and preparation method and application thereof ) 是由 张承武 陆瑶 李林 吴越 徐家佳 王延宾 黄维 于 2021-07-27 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种基于嘧啶基染料,可通过光调控快速、灵敏检测生物体内Fe～(2+)的双光子荧光探针,属于有机荧光探针领域。所述的荧光探针为PyFe荧光探针,PyFe荧光探针的结构式如式(I)所示。本发明的荧光探针能够精确检测生物体内的Fe～(2+),避免细胞内其他离子氨基酸的干扰。该探针具有极快的响应速率,很高的离子选择性,可以实现体外的裸眼检测同时也具有很好的生物相容性。荧光共聚焦成像实验表明该探针具有较好的细胞通透性,对细胞和生物体无毒副作用,同时该探针具有双光子性,可以实现活体动物或组织的深度成像。(The invention relates to a pyrimidine-based dye which can be used for quickly and sensitively detecting Fe in organisms through light regulation 2+ The two-photon fluorescent probe belongs to the field of organic fluorescent probes. The fluorescent probe is a PyFe fluorescent probe, and the structural formula of the PyFe fluorescent probe is shown as a formula (I). The fluorescent probe can accurately detect Fe in organisms 2+ And the interference of other ionic amino acids in the cells is avoided. The probe has extremely high response rate and high ion selectivity, can realize in-vitro naked eye detection and also has good biocompatibility. Fluorescence confocal imaging experiments show that the probe has good cell permeability, has no toxic or side effect on cells and organisms, has two-photon property, and can realize the depth of living animals or tissuesAnd (6) imaging.)
技术领域
本发明涉及一种基于嘧啶基染料，可通过光调控快速、灵敏检测生物体内Fe2+的双光子荧光探针，属于有机荧光探针领域。
背景技术
铁是生物圈中普遍分布的过渡金属，由于其参与电子转移反应的能力，对维持正常细胞功能必不可少，然而过量的铁，尤其是具有氧化还原活性的Fe2+，也可能生成有毒的活性氧(ROS)，进而损害机体。研究表明，铁代谢异常引起的氧化应激与帕金森病(Parkinson’s disease,PD)等一些疾病密切相关。基于铁在这些疾病中所处的重要地位，快速、准确的检测细胞内Fe2+水平，对于研究PD等疾病的发病机制以及有效监控疾病的发生、发展有重要意义。
因此，开发实时、无创的Fe2+特异性检测工具对于研究PD等相关疾病的发病机制尤为重要。为了解决这一问题，研发可以高效、精准检测Fe2+的荧光探针将具有重大价值。
商业化的Fe2+荧光探针直到近几年才出现，主要有两种：FeRhoNox-1和FerroOrange。根据相关报道，这些探针已经可以实现Fe2+的体内外检测，但是价格昂贵(1300元/50μg或2480元/24μg)，并且由于单光子激发的特性，这些探针在生物组织中的穿透深度将受到限制，这也会影响探针在生物体内的成像效果。同时，这些探针的检出限和疾病应用模型等数据尚不明确。
在此，我们提出了一种双光子荧光探针PyFe(可由单光子488nm或双光子880nm激发，630nm发射)，它除了对Fe2+具有极高选择性和快速的响应速率外，还具有极低的理论检出限(0.04nM)，并可以实现低浓度Fe2+的裸眼检测。探针在单、双光子激发波长下均可以实现成像。实验证明在双光子激发下，探针在生物体内的成像更为清晰，在小鼠脑组织中的穿透深度可达391μm，且被证明可以应用于PD生物模型成像。在这些方面，PyFe探针的性能要优于现有的商业探针。
发明内容
本发明利用嘧啶基染料DEt的光学及生物性质，在其结构上引入了Fe2+特异性识别基团N-O结构，进而达到精准检测活细胞内Fe2+的目的，亦可用于检测野生型及PD动物模型体内的Fe2+。
为了解决本发明的技术问题，提出的技术方案是：一种Fe2+双光子荧光探针，所述的荧光探针命名为PyFe，其结构式如下：
优选的，探针的最佳吸收波长为360-370nm，当探针与Fe2+反应后，吸收波长红移至470-490nm，此时的发射波长为620-640nm。
本发明中提及的Fe2+双光子荧光探针与Fe2+的反应机理如下：
为了解决本发明的技术问题，提出的另一技术方案是：一种Fe2+双光子荧光探针的制备方法包括如下步骤：取适量溶剂溶解嘧啶基染料DEt后，冰浴条件下缓慢加入间氯过氧苯甲酸(m-CPBA)，室温搅拌0.5-3h，反应结束后旋干溶剂，通过硅胶层析法分离纯化得到目标产物PyFe荧光探针。
优选的，嘧啶基染料DEt、m-CPBA的摩尔比为1：1-1：10。
优选的，所述的嘧啶基染料DEt、m-CPBA的摩尔比为1：2.2。
优选的，所述的嘧啶基染料DEt的制备方法如下：将4-氟苯甲醛，碳酸钾，二乙基胺，Aliquat-336溶解在DMF中，95℃搅拌12h。反应后的溶液用乙酸乙酯溶解，水洗涤。无水硫酸钠除水，硅胶层析法纯化得到DEt-a。
将DEt-a溶解在乙醇中，超声溶解固体，搅拌加入浓盐酸，95℃回流24h。反应结束后将溶液倒入冰水中，加入碳酸氢钠中和。用CH2Cl2萃取两次后无水硫酸钠干燥有机相，除去无水硫酸钠和有机溶剂，用硅胶层析法得到染料DEt。
优选的，本发明一种Fe2+的双光子荧光探针的制备反应式如下：
本发明采用的另一技术方案是：所述的一种Fe2+双光子荧光探针的应用，用于生理体系中精确检测生物体内的Fe2+的试剂制备。
优选的，所述试剂在细胞体系中通过双光子激发调控精确检测生物体内的Fe2+，而避免来自细胞中其他离子和氨基酸的干扰的应用。
优选的，所述的活细胞及动物组织为HepG2细胞株、LO2细胞株、斑马鱼胚胎、果蝇大脑和C57BL/6小鼠。
有益效果：
本发明的荧光探针具有近红外发射的优点，且具有双光子性，因此具有组织穿透能力强、光损伤弱和受组织自发荧光影响弱等优点，反应后荧光量子产率及双光子吸收截面显著增高。体外实验研究表明，探针与Fe2+反应速度快(<3min)，检出限低(0.04nM)，且具有肉眼可见的颜色变化。在生物条件(pH 7.4)下对Fe2+具有较高的灵敏度和选择性，不受其他离子和氨基酸的干扰。生物实验研究表明，探针对神经细胞毒性较低，并已成功在多种模式生物体内取得了良好的成像效果。该探针可以检测细胞和斑马鱼胚胎中外源和内源性Fe2+的水平。单、双光子荧光成像数据对比可发现，双光子激发特性可以提供更清晰的图像和更深的组织穿透深度。进一步将探针应用于PD动物模型中，实验证明探针可以直观地显示出PD果蝇脑组织和PD小鼠脑组织中内源性Fe2+水平。
图3：(a)10μM探针PyFe在DMSO中，与0-100nM Fe2+反应的吸收光谱图；(b)10μM探针PyFe在DMSO中，与0-100nM Fe2+反应的发射光谱图；(c)10μM探针PyFe与100nM Fe2+在DMSO中，可在3min内达到反应平台期；(d)46种不同离子及氨基酸对探针PyFe几乎无影响(1.Na+,2.K+,3.Mg2+,4.Al3+,5.Fe3+,6.Mn2+,7.Cd2+,8.Zn2+,9.Ni2+,10.Cr3+,11.Al3+,12.Ca2+,13.Pd2+,14.Ag+,15.Cu2+,16.Cu+,17.SO4 2-,18.HCO3 -,19.F-,20.Br-,21.I-,22.ClO-,23.CO3 2-,24.SO3 2-,25.HS-,26.SCN-,27.HPO4 2-,28.H2PO4 -,29.Histidine,30.Proline,31.L-Alanine,32.L-Aspartic acid,33.L-Threonine,34.DL-methionine,35.L-tryptophan,36.L-serine,37.L-phenylalanine,38.L(+)-arginine,39.Tyrosine,40.DL-cys,41.L-isoleucine,42.Glycine,43.L-valine,44.L-ornithine,45.Glutamicacid,46.DL-homocystine,47.Fe2+,48.Blank.)。
图4：当探针中加入Fe2+后，溶液产生肉眼可见的颜色变化
图5：(a)不同浓度PyFe作用24h后，HepG-2细胞存活率大于90％(MTT法)；(b)不同浓度PyFe作用24h后，SH-SY5Y细胞存活率大于90％(MTT法)。
图6：(a)PyFe可以实现HepG2细胞的外源性/内源性Fe2+水平荧光成像，荧光效果良好。比例尺＝10μm；(b)相对荧光强度(1-6)。统计分析采用t检验。***P<0.001。
图7：(a)PyFe可以实现5日龄斑马鱼中外源性/内源性Fe2+水平的单、双光子荧光成像，荧光效果良好，且双光子图像信号更清晰。比例尺＝100μm；(b)相对荧光强度(2，4，6，8)。统计分析采用t检验。***P<0.001。
图8：(a)PyFe可以实现PD模型果蝇(Parkin null)和对应野生型果蝇脑中Fe2+水平的双光子荧光成像，荧光效果良好。比例尺＝50μm；(b)相对荧光强度(1-5)。统计分析采用t检验。***P<0.001。
图9：(a)PyFe可以实现PD和对照组小鼠脑内Fe2+水平的单、双光子荧光成像，荧光效果良好，穿透深度可达391μm。比例尺＝200μm；(b)相对荧光强度(3，4)。统计分析采用t检验。**P<0.01。
附图说明
下面结合附图对本发明的作进一步说明。
图1：(a)探针PyFe的核磁氢谱数据；(b)探针PyFe的核磁碳谱数据
图2：探针PyFe的核磁质谱数据
图3：(a)探针和不同浓度Fe2+反应后的吸收光谱；(b)探针和不同浓度Fe2+反应后的发射光谱；(c)探针的动力学测试；(d)探针的选择性测试
图4：肉眼下的探针颜色变化
图5：(a)探针在HepG2细胞中的毒性测试；(b)探针在SH-SY5Y细胞中的毒性测试
图6：(a)探针在HepG2细胞中的成像；(b)对应的相对荧光强度
图7：(a)探针在活体斑马鱼胚胎中的单、双光子成像；(b)对应的相对荧光强度
图8：(a)探针在野生型和帕金森病模型果蝇脑中的双光子成像；(b)对应的相对荧光强度
图9：(a)探针在对照和帕金森病模型小鼠脑中的单、双光子成像；(b)对应的相对荧光强度
图10：探针PyFe的反应和应用示意图
具体实施方式
实施例1
一种新型的检测生物体内Fe2+的双光子荧光探针的制备方法如下：
1、嘧啶基染料DEt的制备
将4-氟苯甲醛，碳酸钾，二乙基胺，Aliquat-336溶解在DMF中，95℃搅拌12h。反应后的溶液用乙酸乙酯溶解，水洗涤。无水硫酸钠除水，硅胶层析法纯化得到DEt-a。
将DEt-a溶解在乙醇中，超声溶解固体，搅拌加入浓盐酸，95℃回流24h。反应结束后将溶液倒入冰水中，加入碳酸氢钠中和。用CH2Cl2萃取两次后无水硫酸钠干燥有机相，除去无水硫酸钠和有机溶剂，用硅胶层析法得到染料DEt。
2、探针PyFe的制备
将嘧啶基染料DEt用CHCl3溶解，冰浴条件下缓慢加入m-CPBA，室温搅拌3h。反应结束后旋干溶剂，通过硅胶层析法分离纯化得到目标产物PyFe荧光探针。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.88(d,J＝8.2Hz,6H),7.80(d,J＝7.7Hz,4H),7.10(d,J＝15.1Hz,3H),3.85(s,4H),3.63(s,4H),1.06(d,J＝7.0Hz,12H).
13C NMR(101MHz,METHANOL-D4)δ159.01,149.37,138.00,136.23,128.34,122.42,101.25,66.46,7.27.
实施例2
一种新型的检测生物体内Fe2+的双光子荧光探针的制备方法如下：
1、嘧啶基染料DEt的制备
将4-氟苯甲醛，碳酸钾，二乙基胺，Aliquat-336溶解在DMF中，95℃搅拌14h。反应后的溶液用乙酸乙酯溶解，水洗涤。无水硫酸钠除水，硅胶层析法纯化得到DEt-a。
将DEt-a溶解在乙醇中，超声溶解固体，搅拌加入浓盐酸，95℃回流过夜。反应结束后将溶液倒入冰水中，加入碳酸氢钠中和。用CH2Cl2萃取两次后无水硫酸钠干燥有机相，除去无水硫酸钠和有机溶剂，用硅胶层析法得到染料DEt。
2、探针PyFe的制备
将嘧啶基染料DEt用CHCl2溶解，冰浴条件下缓慢加入m-CPBA，室温搅拌1h。反应结束后旋干溶剂，通过硅胶层析法分离纯化得到目标产物PyFe荧光探针。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.88(d,J＝8.2Hz,6H),7.80(d,J＝7.7Hz,4H),7.10(d,J＝15.1Hz,3H),3.85(s,4H),3.63(s,4H),1.06(d,J＝7.0Hz,12H).
13C NMR(101MHz,METHANOL-D4)δ159.01,149.37,138.00,136.23,128.34,122.42,101.25,66.46,7.27.
实施例3
一种新型的检测生物体内Fe2+的双光子荧光探针的制备方法如下：
1、嘧啶基染料DEt的制备
将4-氟苯甲醛，碳酸钾，二乙基胺，Aliquat-336溶解在DMF中，95℃搅拌20h。反应后的溶液用乙酸乙酯溶解，水洗涤。无水硫酸钠除水，硅胶层析法纯化得到DEt-a。
将DEt-a溶解在乙醇中，超声溶解固体，搅拌加入浓盐酸，95℃回流24h。反应结束后将溶液倒入冰水中，加入碳酸氢钠中和。用CH2Cl2萃取两次后无水硫酸钠干燥有机相，除去无水硫酸钠和有机溶剂，用硅胶层析法得到染料DEt。
2、探针PyFe的制备
将嘧啶基染料DEt用CHCl3溶解，冰浴条件下缓慢加入m-CPBA，室温搅拌0.5h。反应结束后旋干溶剂，通过硅胶层析法分离纯化得到目标产物PyFe荧光探针。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.88(d,J＝8.2Hz,6H),7.80(d,J＝7.7Hz,4H),7.10(d,J＝15.1Hz,3H),3.85(s,4H),3.63(s,4H),1.06(d,J＝7.0Hz,12H).
13C NMR(101MHz,METHANOL-D4)δ159.01,149.37,138.00,136.23,128.34,122.42,101.25,66.46,7.27.
实施例4
一种新型的检测生物体内Fe2+的双光子荧光探针对Fe2+的体外响应检测：
1、PyFe对不同Fe2+浓度的荧光响应(附图3a、b)：
首先在DMSO中加入10μM PyFe探针，在加入0-100nM的Fe2+，用荧光分光光度法测试，并绘制PyFe探针对不同浓度Fe2+的荧光光谱图，可观察到PyFe探针对0-100nM的Fe2+具有线性增强的荧光响应。
2、PyFe对Fe2+的反应动力学测试(附图3c)
首先在DMSO中加入10μM PyFe探针，在加入100nM的Fe2+，混合均匀后迅速从中取出80μL至384孔板中，并用酶标仪进行长时间检测，并绘制PyFe对Fe2+的反应动力学曲线图，可观察到PyFe探针对Fe2+具有极快的响应速率。
3、PyFe对常见离子氨基酸的荧光响应(附图3d)：
首先在DMSO中加入10μM PyFe探针，分别加入47种离子氨基酸(100μM)，然后在630nm处测量反应溶液的发射值。并绘制PyFe探针对不同分析物的荧光光谱图，可观察到PyFe探针对Fe2+具有选择性，其他生物体内常见的离子/氨基酸与探针不发生响应。
4、PyFe对Fe2+的检测限测定
通过检测PyFe与从0-100nM浓度梯度的Fe2+响应后的荧光变化，线性拟合630nm处的荧光强度以获得校准曲线。根据检测限计算公式(3σ/S)计算出PyFe对Fe2+的检出限为0.04nM。
实施例5
一种新型的检测生物体内Fe2+的双光子荧光探针对Fe2+的体内响应检测：
1、PyFe在不同细胞中的毒性测试(附图5)：
HepG2/SH-SY5Y细胞在含有10％胎牛血清、100.0mg/mL链霉素和100IU/mL青霉素的Dulbecco改良Eagle培养基中培养。细胞保持在37℃下5％二氧化碳的增湿空气中。
使用3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2-H-四唑溴化铵(MTT)比色细胞增殖试剂盒(Roche)测定PyFe的细胞毒性。HepG2/SH-SY5Y细胞在96孔板中生长到70-80％后收集，吸取培养基，然后用含有不同浓度PyFe的培养基代替。
培养24h后，向细胞中加入10μL MTT溶液(5mg/mL)。在37℃、黑暗环境中进一步孵育4h后，用100μL二甲基亚砜代替溶液溶解产生的晶体。10分钟后，用酶标仪在560nm处测量吸光度，并绘制细胞活性图表。
与30/50μM PyFe孵育24h后，HepG2与SH-SY5Y细胞均有90％以上保持活力，这表明PyFe在工作浓度下具有较低的细胞毒性。
2、PyFe在HepG2细胞中的成像测试(附图6)：
将HepG2细胞以5×105个细胞的密度接种在35mm共焦激光成像皿中，并生长24小时。细胞培养用PyFe探针在10μM浓度下孵育，在37℃的5％CO2气氛中保持3h，然后用PBS(每盘3×2ml)洗涤细胞。
对于外源性实验，细胞在37℃下用50μM Fe2+孵育0.5h，然后用PBS洗涤3次后，细胞继续用10μM探针PyFe孵育2.5h。(附图6-a4)
为了证实荧光增强归因于细胞内Fe2+，我们应用Fe2+螯合剂——2 2'-联吡啶(Bpy)作为对照。(附图6-a6)
所有细胞在成像前用PBS冲洗3次。最后，用共聚焦激光扫描显微镜(蔡司LSM 880)和单光子激光对细胞进行成像，激发波长为488nm，记录的发射波长为570-700nm。
用Image J进行细胞成像图的荧光强度定量，各取每张图的平均荧光强度数值，并在数值间进行t检验。(附图6-b)
实验结果表明，PyFe具有良好的细胞通透性，实现了精确检测细胞内的Fe2+而不受细胞质内其他物质的干扰。
3、PyFe在斑马鱼中的成像测试(附图7)：
将收集到的斑马鱼卵用E3培养液培养，待培养至5日龄后分为4组。
对于外源性实验，将培养斑马鱼的正常培养液替换为含50μM Fe2+的E3培养液，在25℃下培养1h后，换用含20μM探针PyFe的培养液，在25℃下继续培养1h。(附图7-a5/6)
所有斑马鱼在成像前用PBS冲洗3次。最后，用共聚焦激光扫描显微镜(蔡司LSM880)和单光子、双光子激光对斑马鱼进行成像，单光子激发波长为488nm，双光子激发波长为880nm，记录的发射波长为570-700nm。
用Image J进行细胞成像图的荧光强度定量，各取每张图的平均荧光强度数值，并在数值间进行t检验。(附图7-b)
实验结果表明，PyFe可以实现在活体动物体内检测Fe2+，双光子成像可以呈现更清晰的图像细节，成像效果良好。
实施例6
1、PyFe在野生型及PD模型果蝇脑组织中的成像测试(附图8)：
野生型和PD型果蝇来自新加坡国家神经科学研究所的神经变性研究实验室。
所有果蝇均在玉米粉-糖蜜培养基上生长并保持在25℃，分别将PD和野生型果蝇记为实验组(附图8-a2、图8-a5)和对照组(附图8-a1、图8-a4)，将添加Bpy的果蝇作为抑制组(附图8-a3)。解剖后，将实验组的果蝇脑组织放入含20μM PyFe的PBS(pH 7.4)缓冲液中。将抑制组的果蝇脑组织浸入含Bpy(1mM)的PBS缓冲液中，在37℃下孵育1小时，然后浸入含20μM探针PyFe的PBS缓冲液，在37℃下继续孵育2小时。随后，将每组脑组织用PBS清洗3次。
最后，用共聚焦激光扫描显微镜(蔡司LSM 880)和双光子激光对果蝇脑组织进行成像，双光子激发波长为880nm，记录的发射波长为570-700nm。
用Image J进行果蝇脑成像图的荧光强度定量，各取每张图的平均荧光强度数值，并在数值间进行t检验。(附图8-b)
实验结果表明，PyFe在PD昆虫模型脑组织内具有良好的成像性能。
2、PyFe在PD模型小鼠脑组织中的成像测试(附图9)：
将所有小鼠随机分为两组(对照组和实验组)，实验组小鼠每天腹腔注射溶于生理盐水的MPTP(25mg/kg)，连续10天；对照组小鼠每天注射等量的无菌生理盐水。
PD模型构建完成后，进行行为学验证。
随后PD小鼠和对照组小鼠的大脑被仔细分离。用振荡切片机获取脑切片。将脑片(厚度＝500μm)与PyFe探针(50μM)、1％DMSO和0.1％Triton在PBS(pH＝7.4)中孵育2小时。
随后，每组切片用PBS洗涤三次。最后，用共聚焦激光扫描显微镜(蔡司LSM 880)和单、双光子激光对果蝇脑组织进行成像，单光子激发波长为488nm，双光子激发波长为880nm，记录的发射波长为570-700nm。
用Image J进行果蝇脑成像图的荧光强度定量，各取每张图的平均荧光强度数值，并在数值间进行t检验。(附图9-b)
实验表明探针PyFe可以检测到PD模型小鼠脑内存在铁富集情况。且在有一定厚度的组织样本中，可以达到391μm的穿透深度，呈现的图像清晰，适用于动物组织成像。
本发明的不局限于上述实施例所述的具体技术方案，凡采用等同替换形成的技术方案均为本发明要求的保护范围。