一种选择性识别氟离子的荧光探针及其制备方法
阅读说明：本技术 一种选择性识别氟离子的荧光探针及其制备方法 (Fluorescent probe for selectively identifying fluorine ions and preparation method thereof ) 是由 赵宝华 夏艳 赵爽 柳翱 魏境宣 李东风 于 2021-07-01 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种选择性识别氟离子的荧光探针及其制备方法。它以香豆素作为荧光基团,进一步拓展了其作为荧光基团的功能性。在香豆素荧光基团上修饰了含不同取代的苯并咪唑基团,咪唑环上的H会与香豆素的羰基氧之间形成分子内氢键来保持分子的平面性。利用氟离子的强电负性、电荷密度高的特点,氟通过与咪唑环上的氢通过形成氢键作用,破环了原本的分子内氢键,导致分子内结构产生变化。合成的化合物10作为荧光探针对氟离子有较好的选择性,较快的响应速度,检出限为3.50μmol/L。(The invention discloses a fluorescent probe for selectively identifying fluorine ions and a preparation method thereof. The coumarin is used as a fluorescent group, and the functionality of the coumarin as the fluorescent group is further expanded. The fluorescent group of coumarin is modified with benzimidazole group with different substitution, and H on imidazole ring and carbonyl oxygen of coumarin form intramolecular hydrogen bond to maintain the planarity of molecule. By utilizing the characteristics of strong electronegativity and high charge density of fluorine ions, fluorine and hydrogen on an imidazole ring form hydrogen bond action, the original intramolecular hydrogen bond is broken, and the intramolecular structure is changed. The synthesized compound 10 has better selectivity for fluorine ions as a fluorescent probe, has higher response speed and has a detection limit of 3.50 mu mol/L.)
技术领域
本发明涉及的是化学分析检测技术领域，具体涉及一种选择性识别氟离子的荧光探针及其制备方法。
背景技术
氟化物阴离子被广泛用作牙膏的添加剂，也是制药业的重要成分众所周知，过量接触氟化物或摄入过量氟化物会导致尿路结石以及胃和肾脏疾病。
在众多的检测分析方法中，传统的检测法如火焰光度法、原子吸收光谱法等都相对费用较高，往往需要较多的样品，制备步骤繁复，不能追踪其动态变化，检测时间较长，不能满足在实际检测工作中的应用。与之相比，基于荧光探针检测的方法在灵敏度、选择性、响应时间、局部观察(如荧光成像光谱)等方面具有明显的优势。现今，荧光探针的应用取得了重大的进展，并越来越受到人们的重视，已经被广泛的应用于各种生活生产领域。
目前用于检测氟离子的荧光探针大多基于氟使硅氧键断裂的化学反应，或由氟离子的强电负性所导致的探针分子的去质子效应。经过这两种作用过程后大多会导致荧光探针发生重排，导致分子结构发生较大改变，难以继续对氟离子进行检测。因此，开发高效、灵敏、准确地检测生物系统中氟化物的方法十分重要。
发明内容
一种含香豆素的荧光探针化合物，其特征在于，结构式为：
；
一种含香豆素的荧光探针化合物8的制备方法，其特征在于，它包括：
（1）7-(二乙胺基)香豆素的制备
常温下加入0.01mol的4-(二乙基氨基)水杨醛，0.02mol丙二酸二乙酯，0.1mL哌啶，溶于30mL无水乙醇中；氮气保护85℃下，回流11h，蒸发，加入AcOH/HCl 10mL，温度升至100℃继续回流反应10h，pH为中性；抽滤干燥，正相色谱洗脱，洗脱剂为二氯甲烷：石油醚=2:1；所述的AcOH和HCl的体积比为1:1；
（2）化合物5的制备
量取DMF与POCl3液体各5mL在常温氮气保护下搅拌0.5h后，温度升至60℃，缓慢将溶于15mL的DMF的7-(二乙基氨基)香豆素(1.08g，0.005mol)滴加到反应液中。反应12h后，加冰水淬灭反应液，调pH为中性。抽滤干燥，正相色谱洗脱，洗脱剂为二氯甲烷：乙酸乙酯=10:1；所述的化合物结构式如下：
；
（3）荧光探针化合物8的制备
取0.25g化合物5与0.17g的 2-硝基苯胺溶于20mL无水乙醇中，加入硫代硫酸钠固体0.5g后，氮气保护，加热回流反应2h，将自然冷却的反应液浓缩，用二氯甲烷、水萃取后干燥，蒸发得粗产品，用乙酸乙酯重结晶；
一种含香豆素的荧光探针化合物9制备方法：
取0.25g化合物5与0.20g 的4-甲氧基-2-硝基苯胺溶于20mL无水乙醇中，加入0.5g硫代硫酸钠固体后，氮气保护，加热回流反应2h，将自然冷却的反应液浓缩，用二氯甲烷、水萃取后干燥，蒸发得粗产品，用乙酸乙酯重结晶；
一种含香豆素的荧光探针化合物10制备方法：
取0.25g化合物5与0.19g 的3-氨基-4-硝基苯甲腈溶于20mL无水乙醇中，加入0.5g硫代硫酸钠固体后，氮气保护，加热回流反应2h，将自然冷却的反应液浓缩，用二氯甲烷、水萃取后干燥，蒸发得粗产品，用乙酸乙酯重结晶；
一种含香豆素的荧光探针化合物在氟离子检测中的应用。
本发明提供了一种选择性识别氟离子的荧光探针及其制备方法。它以香豆素作为荧光基团，进一步拓展了其作为荧光基团的功能性。在香豆素荧光基团上修饰了含不同取代的苯并咪唑基团，咪唑环上的H会与香豆素的羰基氧之间形成分子内氢键来保持分子的平面性。利用氟离子的强电负性、电荷密度高的特点，氟通过与咪唑环上的氢通过形成氢键作用，破环了原本的分子内氢键，导致分子内结构产生变化。合成的化合物10作为荧光探针对氟离子有较好的选择性，较快的响应速度，检出限为3.50 μmol/L。
附图说明
图1为3-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-7-(二乙基氨基)香豆素类化合物的合成路线；
图2化合物8, 9,10 (a, b, c)受不同阴离子影响吸收光谱所产生的变化；
图3化合物10受不同阴离子影响发射光谱所产生的变化；
图4化合物10浓度为10-5mol/L的溶液吸收光谱随氟离子的加入的变化情况；
图5化合物10的发射光谱随F-离子的浓度升高(0-25倍F-离子当量)的变化情况；
图 6化合物10与随着氟离子当量所占比的上升的510 nm处发射峰强度的变化；
图 7化合物10随氟离子加入的最大荧光发射强度的变化的拟合曲线；
图8化合物10中加入100倍当量的氟离子后510 nm处荧光发射强度随时间的变化；
图9 该系列化合物与氟离子可能存在的相互作用；
图10在不同溶剂中的化合物10的发射光谱的变化。
具体实施方式
实施例1荧光探针的制备
本发明荧光探针的制备途径如图1所示。
（1）7-(二乙胺基)香豆素的制备
在常温下加入4-(二乙基氨基)水杨醛(1.93g，0.01mol)，丙二酸二乙酯(2.4g，0.02mol)，0.1mL哌啶，溶于30mL无水乙醇中。氮气保护85℃下，回流反应11h后，蒸发出多余溶剂，加入AcOH/HCl (1:1) 10mL，温度升至100℃继续回流反应10h。反应完成后调节pH为中性。抽滤收集滤饼干燥即得粗产物，用正相色谱洗脱，洗脱剂为二氯甲烷：石油醚=2:1。得暗黄色油固体2.05g，收率为94.4%。
（2）中间体化合物5的制备
量取DMF与POCl3液体各5mL在常温氮气保护下搅拌0.5h后，温度升至60℃。缓慢将溶于15mLDMF的7-(二乙基氨基)香豆素(1.08g, 0.005mol)滴加到反应液中。反应12h后，加冰水淬灭反应液，调pH为中性。抽滤收集滤饼干燥即得粗产物，用正相色谱洗脱，洗脱剂为二氯甲烷：乙酸乙酯=10:1。得橙红色固体0.98g，收率为80.4%。
（3）荧光探针化合物8的制备
将化合物5(0.25g, 1.0mmol)与2-硝基苯胺(0.17g, 1.2mmol)溶于20mL无水乙醇中，加入硫代硫酸钠固体0.5g后，氮气保护，加热回流反应2h。反应完成后，将自然冷却的反应液浓缩，用二氯甲烷、水萃取后干燥，蒸发多余溶剂即得粗产品。再用乙酸乙酯重结晶，得橙红色固体0.19g，收率为57.6%。
荧光探针化合物8：1H NMR (CDCl3 ,400MHz): δ=11.25(s, 1H), 8.91(s, 1H),7.76(d, J=7.2 Hz, 1H), 7.49(d, J=6.4 Hz, 1H), 7.45(d, J=7.2Hz, 1H), 7.29-7.23(m, 2H), 6.67(dd, J=8.8, 2.4Hz, 1H), 6.65(d, J=2.0Hz, 1H), 3.45(q, J=7.2Hz,4H), 1.24(t, J=7.2Hz, 6H); 13C NMR(CDCl3 ,100MHz): δ=164.1, 148.4, 142.1,138.9, 128.9, 124.7, 123.9, 123.2, 117.2, 115.2, 47.5, 28.9, 20.1, 13.8; FTIR(cm-1):3350, 2970, 2927, 2830, 2696, 1698, 1618, 1594, 1529, 1439, 1402, 1358,1258, 1186, 1131, 806, 773, 735, 648, 493; MALDI-TOF-MS (m/z): 333.38 (100%,M+-1, calcd. 333.39)。
（4）荧光探针化合物9的制备
将化合物5(0.25g, 1.0mmol)与4-甲氧基-2-硝基苯胺(0.20g, 1.2mmol)溶于20mL无水乙醇中，加入硫代硫酸钠固体0.5g后，氮气保护，加热回流反应2h。反应完成后，将自然冷却的反应液浓缩，用二氯甲烷、水萃取后干燥，蒸发多余溶剂即得粗产品。再用乙酸乙酯重结晶，得橙红色固体0.23g，收率为63.8%。
荧光探针化合物9：1H NMR (CDCl3 ,400MHz): δ=11.16(s, 1H), 8.87(d, J=10.8Hz, 1H), 7.64(d, J=8.8 Hz, 1H), 7.46(dd, J=8.8, 2.8 Hz, 1H), 7.37(d, J=8.8Hz, 1H), 6.96-6.87(m, 1H), 6.65(d, J=8.8, 1H), 6.53(s, 1H), 3.85(s, 3H) 3.45(q, J=7.2Hz, 4H), 1.22(t, J=7.2Hz, 6H); 13C NMR(CDCl3 ,100MHz): δ=161.6,154.4, 149.8, 134.8, 132.7, 128.4, 123.6, 117.3, 97.3, 70.5, 44.7, 35.4,12.3; FTIR (cm-1):3338, 3046, 2972, 2705, 1691, 1621, 1593, 1529, 1402, 1356,1311, 1276, 1254, 1190, 1135, 1079, 973, 820, 778, 740, 658, 634, 473; MALDI-TOF-MS (m/z): 364.19 (100%, M+-1, calcd. 363.42)。
（5）荧光探针化合物10的制备
将化合物5(0.25g, 1.0mmol)与3-氨基-4-硝基苯甲腈(0.19g, 1.2mmol)溶于20mL无水乙醇中，加入硫代硫酸钠固体0.5g后，氮气保护，加热回流反应2h。反应完成后，将自然冷却的反应液浓缩，用二氯甲烷、水萃取后干燥，蒸发多余溶剂即得粗产品。再用乙酸乙酯重结晶，得橙红色固体0.25g，收率为69.8%。
荧光探针化合物10：1H NMR (CDCl3 ,400MHz): δ=11.53(s, 1H), 8.92(d, J=5.2Hz, 1H), 8.04(s, 1H), 7.84-7.76(m, 1H), 7.56-7.46(m, 2H), 6.70(dd, J=9.2,2.0 Hz, 1H), 6.56(s, 1H), 3.48(q, J=7.2Hz, 4H), 1.26(t, J=7.2Hz, 6H); 13C NMR(CDCl3 ,100MHz): δ=161.77, 157.56, 150.59, 138.98 , 128.99, 121.66, 108.89,108.27, 96.95, 114.92, 50.32, 44.81, 38.93, 12.44; FTIR (cm-1):3338, 3046,2972, 2929, 2704, 1694, 1621, 1593, 1529, 1403, 1356, 1275, 1254, 1190, 1135,1079, 820, 778, 740, 634, 472; MALDI-TOF-MS (m/z): 358.39 (100%, M+-1, calcd.358.40)。
实施例2 荧光探针对F-的识别能力的检测
为了评价化合物8, 9, 10对氟离子的识别作用，对目标化合物8, 9, 10的10μmol/L标准溶液进行了紫外-可见吸收光谱中的测试。三种化合物均在430-460 nm处有较宽吸收峰，再分别向化合物8, 9, 10加入少量1mmol/L的待测离子溶液使其浓度为100μmol/L，如图2所示，发现其吸收峰高度均有少量下降，其中化合物10在加入氟离子时吸收峰高度下降最为显著，其次为化合物8，下降幅度最小的为化合物9，对比其它阴离子对化合物8,9, 10吸收光谱的影响，可以认为化合物10对氟离子有选择性作用。并以吸收峰变化最为显著的化合物10测试了吸收光谱受氟离子影响最大的化合物10的荧光发射光谱，如图3所示。以吸收光谱中的最大吸光度处的波长作为激发波长，结果表明化合物10在480 nm和510 nm处有发射峰，在加入其它阴离子(Cl-, Br-, OH-)后，发射光谱没有明显变化。在加入氟离子溶液后，发射光谱的480 nm处的发射峰增强，而510 nm处的发射峰减弱。证明了化合物10对氟离子出现荧光增强的选择性作用。
为了研究该系列化合物的光谱性质，选取了对氟离子浓度最为敏感的化合物10作为代表，测定了随氟离子浓度不断变化该化合物的吸收光谱。如图4所示，可以看到在加入氟离子之前化合物10在460 nm处有宽吸收峰。随着氟离子的添加，化合物10吸收光谱的吸收峰逐渐降低，吸收峰由原来的460 nm逐渐蓝移至420 nm处，在氟离子浓度超过探针浓度的20倍后继续增加氟离子浓度吸收光谱不再变化。导致吸收光谱发生变化的原因可能是由于氟离子浓度上升和分子内香豆素羰基氧与咪唑环上的氢竞争形成氢键，而电负性较强的氟更易形成氢键，使原有分子内氢键减弱，而该氢键在一定程度上维持了分子的平面性和刚性，所以共轭体系减少，吸收峰下降，420 nm处吸收峰应为香豆素骨架的吸收峰。接着测定了化合物10受氟离子浓度上升影响的发射光谱。如图5所示，在加入氟离子之前化合物10在480 nm和510nm处有较强的发射峰。当氟离子浓度超过化合物10浓度25倍时，发射光谱也不再出现明显变化。随着氟离子浓度上升480 nm处的发射峰逐渐上升，而在510 nm处的吸收峰逐渐下降至消失。480 nm处发射峰的上升是由于香豆素荧光基团本身所具有的荧光发射。如上文所述分子共面性和刚性的下降，致使分子的共轭体系减少，香豆素与咪唑基团间自由旋转产生二面角，分子的扭曲程度上升，分子会将吸收的能量一部分通过分子振动的形式耗散。由于510 nm处的吸收峰是由于富电子的香豆素基团与缺电子引入缺电子基的咪唑环之间产生的ICT效应使分子的斯托克斯位移上升所造成的。随着氟离子的加入，分子的共面性被破坏，阻断了ICT效应的发生，故该处发射峰消失。
灵敏度是评价荧光探针的一个重要指标，为了测定目标化合物的灵敏度进行了job’s点实验。使用已配制的化合物10标准溶液，在加入低浓度氟离子下荧光发射光谱的510 nm处发射峰强度的变化。工作曲线如图6所示，选取低浓度下工作曲线呈线性关系较好的部分绘制了校准曲线，如图7所示。通过校准曲线的斜率计算得到化合物10的检出限为3.50 μmol/L（90%置信度），低于国家对饮用水中氟含量的标准（约为53.63 μmol/L）。
实施例3荧光探针化合物10的响应时间
将化合物10和与100倍当量的氟离子混合后，考察了荧光发射强度至稳定所需时间，如图8所示荧光强度随时间经过呈现逐渐增强的趋势，并在7 min时达到最大而后能长时间稳定在同一水平，且在前几分钟的荧光发射强度的改变表明了该目标化合物10能在5min之内快速识别氟离子，能满足实际样品中氟离子实时监测的响应时间要求，具有较高的灵敏度和选择性。
实施例4 荧光探针化合物8,9,10识别F-机理
氟离子竞争了咪唑环上的氢优先形成氢键，破坏了分子构型导致其光谱性质的变化，如图9所示。在不同极性的溶剂中测定了化合物10的荧光发射光谱。如图10所示，在极性弱的溶剂中化合物10发射波长较长的发射峰发射强度低且发射波长较短，在极性较强的溶剂中该发射峰的发射强度较大且较化合物10在弱极性溶剂中的峰产生了略微红移。由此推测发射波长较长的峰是因为产生了ICT效应。因为吸电子的氰基的引入增强了该效应，所以化合物10的发射光谱上才出现了一个明显的红移发射峰。由此推测光谱性质的变化是分子内氢键被破坏，导致分子失去平面性阻断了ICT过程的进行，因而红移发射峰消失。因为吸电子基团会增强ICT效应。产生红移的吸收峰也越强，故对氟离子的灵敏度也越高。
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