具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但绝不是对本发明的限制。

一种三唑类神经氨酸酶抑制剂，该抑制剂具有式(I)所示的结构：

其中，Ar选自 中的任意一种。

Ar为

一种如上述所述的三唑类神经氨酸酶抑制剂的制备方法，制备方法的方程式如下所示：

所述制备方法具体包括以下步骤：

(1)将取代苯胺和氯乙酰氯形成反应体系，反应后经后处理得到式(Ⅱ)中间体；

(2)将呋喃酰氯和氨基硫脲溶于有机溶剂中形成反应体系，反应后经后处理得到式(Ⅲ)中间体；

(3)取步骤(2)得到的式(Ⅲ)中间体溶于氢氧化钠溶液中形成反应体系，反应经后处理得到式(Ⅳ)中间体；

(4)取步骤(3)得到的式(Ⅳ)中间体和步骤(1)得到的式(Ⅱ)中间体与氢氧化钠溶液溶于有机溶剂中，反应经后处理得到式(Ⅰ)所示的抑制剂。

步骤(1)中，采用三乙胺作为缚酸剂，所述有机溶剂采用二氯甲烷。所述反应体系置于冰水浴中进行反应，使用氮气保护，反应温度为0℃，反应的时间为3-4.5h。后处理的过程具体为：用20ml二氯甲烷稀释反应，用1M盐酸、饱和碳酸氢钠溶液和盐水依次洗涤，采用旋蒸除去二氯甲烷得到式(Ⅱ)中间体。所述取代苯胺、氯乙酰氯、三乙胺和有机溶剂的添加量比为(4-8)mmol:(4-8)mmol:(4-8)mmol:(8-15)mL。

步骤(2)中，所述有机溶剂采用二氯甲烷，所述反应体系置于冰水浴中进行反应，反应温度为0℃，反应的时间为12-18h，后处理过程为：采用旋蒸除去二氯甲烷得到式(Ⅲ)中间体。所述2-呋喃甲酰氯、氨基硫脲和有机溶剂的添加量比为(4-8)mmol:(4-8)mmol:(15-25)mL。

步骤(3)中，所述氢氧化钠溶液为5％氢氧化钠溶液，所述反应体系置于油浴中进行反应，反应的温度为90-120℃，优选为110℃，反应的时间为2.5-4.5h，后处理的具体过程为：取出反应体系进行冷却，采用酸(采用盐酸)调节PH至4，析出沉淀，再将沉淀依次进行过滤、洗涤、干燥得到式(Ⅳ)中间体。

步骤(4)中，所述有机溶剂采用甲醇，所述反应体系置于室温中进行，反应温度为20-30℃，优选为25℃，反应时间为3～5h，后处理的具体过程为：采用酸(盐酸)调节PH至7，析出沉淀，再将沉淀依次进行过滤、洗涤、干燥和乙醇重结晶得到式(Ⅰ)所示的抑制剂。所述式(Ⅳ)中间体、式(Ⅱ)中间体、氢氧化钠和有机溶剂的添加量比为1mmol:(1.0-1.1)mmol:1mmol:(5-10)mL。各个步骤中涉及到的过滤、洗涤、干燥和无水乙醇重结晶这几个步骤均为常规操作，操作参数均根据实验室中常采用的参数进行选择达到所需要的目标值即可。

如上述所述的含有三唑类神经氨酸酶抑制剂在制备能够抑制神经氨酸酶活性的药物中的应用。

以下为具体示例：

实施例1

一种三唑类神经氨酸酶抑制剂的制备方法，其结构式如式I所示：

具体合成步骤如下：

(1)准确称量3-乙基苯胺0.61g(5mmol)和三乙胺0.51g(5mmol)于50mL圆底烧瓶中，加入10mL二氯甲烷，使用氮气保护，加入氯乙酰氯0.56g(5mmol)，置于冰水浴中0℃搅拌反应4小时，之后加入20mL二氯甲烷稀释反应，用1M盐酸、饱和碳酸氢钠溶液和盐水依次洗涤，采用旋蒸除去二氯甲烷得到式(Ⅱ)中间体。

(2)准确称量2-呋喃甲酰氯0.65g(5mmol)和氨基硫脲0.46g(5mmol)于50mL圆底烧瓶中，加入20mL二氯甲烷，置于冰水浴中0℃搅拌反应16h，反应完毕后，真空中除去二氯甲烷，得到式(Ⅲ)中间体。

(3)取式(Ⅲ)中间体0.93g(5mmol)于圆底烧瓶中，加入5％氢氧化钠溶液20mL，置于恒温油浴锅中，110℃反应4h。反应完毕后，取出将反应液冷却，采用盐酸调节PH至4静置析出大量沉淀，将沉淀过滤得到滤饼，滤饼用大量冰水洗涤多遍，之后在真空干燥箱中干燥，乙醇重结晶得到式(Ⅳ)中间体。

(4)取式(Ⅳ)中间体0.17g(1mmol)、氢氧化钠0.40g(1mmol)和2mL水于50mL圆底烧瓶中，加入式(Ⅱ)中间体0.20g(1mmol)和8mL甲醇，置于室温下25℃搅拌反应4h。反应完毕后，采用盐酸调节PH至7，静置析出沉淀，再将沉淀过滤，得到滤饼，用蒸馏水洗涤多次滤饼后干燥，在乙醇重结晶得式(Ⅰ)所示的抑制剂，具体结构式如式A所示，具体为N-(3-乙基苯基)-2-((5-(呋喃-2-基)-4H-1,2,4-三唑-3-基)硫基)乙酰胺，为白色固体，产率85％。

对制备得到的抑制剂进行抑制神经氨酸酶活性测试：

1、实验仪器和材料

多功能荧光酶标仪，SP-Max 3500FL型，上海闪谱生物科技有限公司；

超净工作台；

Bond A3Pipette手动单道可调试移液器，0.5-10ul，10-100ul，100-1000ul泰坦科技；

96孔板(黑色)，灭菌，康宁；

H5N1神经氨酸酶，购自北京义翘神州科技股份有限公司；酶抑制实验中使用的荧光底物2’-(4-甲基伞形酮)-α-D-乙酰神经氨酸钠水合物(4-MUNANA)(Sigma，M8639)，购自Sigma公司；2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)、氯化钙、氢氧化钠、无水乙醇，购自泰坦科技。

阳性对照药，奥司他韦酸(Oseltamivir carboxlate，简写为OSC)，上海贺康生物技术有限公司。

2、实验方法

将阳性对照药及目标化合物(即制备得到的N-(3-乙基苯基)-2-((5-(呋喃-2-基)-4H-1,2,4-三唑-3-基)硫基)乙酰胺)用DMSO溶解，初始浓度配制成1000μm/l，将其按照倍比稀释成6个浓度梯度，依次为200μm/l、40μm/l、8μm/l、1.6μm/l、0.32μm/l、0.064μm/l，每个浓度梯度依次配制三组；

2.1样品检测准备

a.缓冲液(33mM MES，4mM CaCl₂)每孔加入70μL于96孔酶标板中；

b.神经氨酸酶每孔加入10μL；

c.每孔加入10μL配好浓度的待测神经氨酸酶抑制剂样品或阳性对照药样品，同时设置三组空白试验对照；

d.神经氨酸酶底物(100μM·L^-1 4-MUNANA)每孔加入10μL。

2.2检测

a.将96孔板置于多功能荧光酶标仪中，震荡混匀1分钟；

b.温度设置为37摄氏度，孵育15分钟，使神经氨酸酶与待测样品充分混匀、相互作用；

c.取出96孔板，每孔再加入神经氨酸酶荧光底物10μL；

d.再次置于多功能荧光酶标仪中，震荡混匀1分钟；

e.于37摄氏度下孵育60分钟，取出，每孔加入150μL的终止液(14mM·L^-1NaOH的83％乙醇水溶液)，再次置于多功能荧光酶标仪中，震荡混匀1分钟，激发波长设置为355nm，发射波长设置为460nm，孵育结束后开始荧光强度(RFU)测定；

f.重复上述操作步骤，做3组平行实验。

注：96孔板中的第一个孔作为空白组，不加待测样品，加入10微升DMSO溶液。

算出每次平行实验中每个梯度浓度下的样品的抑制率的平均值，再通过Origin拟合出相应IC₅₀值。

2.3实验结果

将阳性对照药及目标化合物用DMSO溶液均配制成初始浓度1000μm/L的混合溶液，再将这两种混合溶液按照倍比稀释成6个浓度梯度，依次为200μm/l、40μm/l、8μm/l、1.6μm/l、0.32μm/l、0.064μm/l，每个浓度梯度依次配制三组。在96孔黑色荧光酶标板中加入神经氨酸酶缓冲液70μL，神经氨酸酶10μL，以及待测的每个梯度浓度的阳性对照药样品，同时设置三组空白试验对照。在多功能荧光酶标仪中震荡1分钟混匀，37℃孵育15min；取出96孔酶标板，每孔加入10μL的神经氨酸酶底物，震荡1分钟混匀，在37℃孵育60min后，取出，每孔加入150μL的终止液(14mM·L^-1NaOH的83％乙醇水溶液)，再次置于多功能荧光酶标仪中，震荡混匀1分钟，激发波长设置为355nm，发射波长设置为460nm，孵育结束后开始荧光强度(RFU)测定。平行进行三次实验。算出每次平行实验中每个梯度浓度下的样品的抑制率的平均值，再通过Origin拟合出相应IC₅₀值算出每个样品的抑制率，再通过Origin拟合出相应IC₅₀值。其IC₅₀值为0.11μM，阳性对照药的IC₅₀值为0.10μM。

N-(3-乙基苯基)-2-((5-(呋喃-2-基)-4H-1,2,4-三唑-3-基)硫基)乙酰胺，为白色固体，产率85％。

¹H NMR(500MHz,DMSO)δ14.43(s,1H),10.22(s,1H),7.86(s,1H),7.48(d,J＝10.00Hz,2H),7.13(d,J＝10.00Hz,2H),6.99(s,1H),6.66(s,1H),4.11(s,2H),2.56–2.52(m,2H),1.14(t,J＝15.00,10.00Hz,3H)。¹³C NMR(125MHz,DMSO)δ165.80,144.41,138.94,136.56,127.95,119.26,111.96,110.19,36.57,27.60,15.63.。HRMS(ESI):329.1070[M-H]+。

实施例2

一种三唑类神经氨酸酶抑制剂的制备方法，其结构式如下，采用类似实施例1的方法制备得到。

N-(3,4-二甲氧基苯基)-2-((5-(呋喃-2-基)-4H-1,2,4-三唑-3-基)硫基)乙酰胺

白色固体，产率67％，IC₅₀值为1.43μM。¹H NMR(500MHz,DMSO)δ14.46(s,1H),10.19(s,1H),7.87(s,1H),7.28(s,1H),7.07(d,J＝10.0Hz,1H),6.99(s,1H),6.88(d,J＝5.0Hz,1H),6.67(s,1H),4.08(s,2H),3.71(s,6H).。¹³C NMR(125MHz,DMSO)δ165.67,148.64,145.09,144.54,143.81,132.52,112.14,112.06,111.16,110.32,104.36,55.77,55.39,36.53.。HRMS(ESI):361.0966[M-H]+

实施例3

一种三唑类神经氨酸酶抑制剂的制备方法，其结构式如下，采用类似实施例1的方法制备得到。

2-((5-(呋喃-2-基)-4H-1,2,4-三唑-3-基)硫基)-N-(3-甲氧基苯基)乙酰胺

白色固体，产率75％，IC₅₀值为0.24μM。

¹H NMR(500MHz,DMSO)δ14.45(s,1H),10.31(s,1H),7.87(s,1H),7.29(s,1H),7.21(t,J＝15.0,5.0Hz,1H),7.11(d,J＝10.0Hz,1H),6.99(s,1H),6.72–6.56(m,2H),4.12(s,2H),3.72(s,3H).。¹³C NMR(125MHz,DMSO)δ166.13,159.58,144.48,140.05,129.62,127.96,119.30,112.00,111.44,110.30,108.98,104.97,54.97,36.61.。HRMS(ESI):331.0863[M-H]⁺

实施例4

一种三唑类神经氨酸酶抑制剂的制备方法，其结构式如下，采用类似实施例1的方法制备得到。

N-(4-氟-2-甲氧基苯基)-2-((5-(呋喃-2-基)-4H-1,2,4-三唑-3-基)硫基)乙酰胺

白色固体，产率79％，IC₅₀值为1.80μM。

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ14.44(d,J＝160.0Hz,1H),9.52(d,J＝40.0Hz,1H),7.90(t,J＝16.0Hz,2H),6.98(dd,J＝28.0,20.0Hz,2H),6.76–6.60(m,2H),4.15(d,J＝40.0Hz,2H),3.78(s,3H).¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ167.66,151.11,151.01,148.20,145.57,144.12,142.66,123.98,122.48,112.72,111.70,106.55,100.33,56.61,36.18.。HRMS(ESI):349.0769[M-H]⁺

实施例5

一种三唑类神经氨酸酶抑制剂的制备方法，其结构式如下，采用类似实施例1的方法制备得到。

2-((5-(呋喃-2-基)-4H-1,2,4-三唑-3-基)硫基)-N-(2-甲氧基-5-甲基苯基)乙酰胺

白色固体，产率68％，IC₅₀值为28.48μM。

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ14.43(d,J＝160.0Hz,1H),9.43(d,J＝28.0Hz,1H),7.86(dd,J＝44.0,12.0Hz,2H),6.92(dd,J＝16.0,8.0Hz,3H),6.66(d,J＝40.0Hz,1H),4.30–3.95(m,2H),3.70(s,3H),2.20(s,3H).。¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ167.03,148.28,147.32,145.57,144.10,142.72,129.56,127.43,124.84,121.68,112.72,112.10,111.41,56.19,36.32,20.98.。HRMS(ESI):345.1020[M-H]+

实施例6

一种三唑类神经氨酸酶抑制剂的制备方法，其结构式如下，采用类似实施例1的方法制备得到。

2-((5-(呋喃-2-基)-4H-1,2,4-三唑-3-基)硫基)-N-(3-甲氧基苯乙基)乙酰胺

白色固体，产率63％，IC₅₀值为9.04μM。

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.25(s,1H),7.85(s,1H),7.15(d,J＝8.0Hz,1H),6.97(s,1H),6.75(d,J＝4.0Hz,3H),6.61(s,1H),3.87(s,2H),3.72(s,3H),3.29(s,3H),2.68(s,2H).。¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ167.49,159.76,157.19,154.21,146.26,144.87,141.34,129.77,121.32,114.62,112.43,112.14,110.59,55.36,41.00,35.93,35.48.。HRMS(ESI):359.1170[M-H]⁺

实施例7

一种三唑类神经氨酸酶抑制剂的制备方法，其结构式如下，采用类似实施例1的方法制备得到。

N-(3-氟苯乙基)-2-((5-(呋喃-2-基)-4H-1,2,4-三唑-3-基)硫代)乙酰胺

黄色油状物，产率56％，IC₅₀值为8.06μM。

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.28(s,1H),7.86(s,1H),7.29(dd,J＝8.0,4.0Hz,1H),7.07–6.94(m,4H),6.67(s,1H),4.03(dd,J＝8.0,4.0Hz,1H),3.86(s,2H),2.73(t,J＝4.0Hz,2H),1.99(s,1H),1.18(t,J＝4.0Hz,1H).¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ169.35,167.10,163.17,160.24,142.31,142.25,130.09,124.78,115.41,115.25,112.94,112.78,112.01,40.22,35.43,34.57.。HRMS(ESI):347.0974[M-H]⁺

实施例8

一种三唑类神经氨酸酶抑制剂的制备方法，其结构式如下，采用类似实施例1的方法制备得到。

N'-(2-(((5-(呋喃-2-基)-4H-1,2,4-三唑-3-基)硫基)乙酰基)-4-甲氧基苯并肼

黄色固体，产率64％，IC₅₀值为12.16μM。

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ10.32(s,1H),7.86(d,J＝8.0Hz,4H),7.02(d,J＝8.0Hz,4H),6.67(s,1H),4.04(s,2H),3.81(s,3H).¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ168.22,165.37,162.52,157.43,153.17,150.59,144.92,129.86,124.91,114.18,112.47,110.74,55.88,34.21.。HRMS(ESI):374.0914[M-H]⁺

实施例9

一种三唑类神经氨酸酶抑制剂的制备方法，其结构式如下，采用类似实施例1的方法制备得到。

N-(2-(苯并[d][1,3]二氧杂-5-基)乙基)-2-((5-(呋喃-2-基)-4H-1,2,4-三唑-3-乙硫基乙酰胺

紫色油状物，产率63％，IC₅₀值为1.67μM。

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.27(s,1H),7.85(s,1H),6.97(s,1H),6.80(t,J＝36.0Hz,3H),6.67–6.60(m,2H),5.95(s,2H),3.86(s,2H),3.27(d,J＝4.0Hz,2H),2.62(s,2H).。¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ168.61,158.55,156.64,151.23,147.65,145.93,144.70,133.54,121.98,112.39,110.34,109.48,108.51,101.10,41.28,35.95,35.12.。HRMS(ESI):373.0960[M-H]⁺

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。