一种用于检测人体液中乙酰胆碱受体自身抗体的细胞爬片及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种用于检测人体液中乙酰胆碱受体自身抗体的细胞爬片及其制备方法和应用 (Cell climbing sheet for detecting acetylcholine receptor autoantibodies in human body fluid and preparation method and application thereof ) 是由 闫亚平 赵子越 郝文斌 封雪 李科 于 2021-09-01 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于检测人体液中乙酰胆碱受体自身抗体的细胞爬片及其制备方法和应用,属于生物技术领域。采用的方案包括：将乙酰胆碱受体的各个亚基与空载质粒按照一定的比例进行共同转染,再经过固定、洗涤、终止、洗涤、烘干处理,制得检测人体液中乙酰胆碱受体自身抗体的细胞爬片。该方法与放免法和酶联免疫法相比,具有较高的灵敏度；与现有技术的文献所报道的免疫荧光方法相比,在降低了背景的同时提高了检测的特异性。因此,无论从研究角度还是作为重症肌无力疾病的辅助诊断手段,本发明均具有良好的应用前景。(The invention discloses a cell climbing sheet for detecting an acetylcholine receptor autoantibody in human body fluid, and a preparation method and application thereof, and belongs to the technical field of biology. The adopted scheme comprises the following steps: and (3) co-transfecting each subunit of the acetylcholine receptor and the idle-load plasmid according to a certain proportion, and carrying out fixation, washing, termination, washing and drying treatment to prepare the cell climbing sheet for detecting the acetylcholine receptor autoantibody in the human body fluid. Compared with an radioimmunoassay and an enzyme-linked immunosorbent assay, the method has higher sensitivity; compared with the immunofluorescence method reported in the prior art document, the method reduces the background and improves the specificity of detection. Therefore, the invention has good application prospect both from the research perspective and as an auxiliary diagnosis means for myasthenia gravis.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于检测乙酰胆碱受体自身抗体的细胞爬片及其制备方法和应用。
背景技术
重症肌无力(myasthenia gravis，MG)是乙酰胆碱受体抗体(AchR-Ab)介导的神经-肌肉接头(NMJ)处传递障碍的自身免疫性疾病，病变主要累及NMJ突触后膜上乙酰胆碱受体(acetyl cholinergic receptor，AchR)。目前，检测重症肌无力自身抗体的方法主要有放免法，酶联免疫法等。现已有证据表明，有部分重症肌无力症状的患者样本通过放免法检测的结果为阴性，酶联免疫吸附法与放免法存在同样的问题。以细胞为底物的免疫荧光法(CBA，Cell Based Assay)克服了上述两种方法的缺点，通过在细胞表面表达出完整且有正确构像的AchR抗原，可检出放免法或酶联免疫法检测后阴性或低滴度重症肌无力患者，提高了重症肌无力患者血清的阳性检出率。因此，AchR免疫荧光方法的广泛应用可以为疾病的早期诊断及后续治疗提供有效的帮助。
Rapsyn是突触后膜乙酰胆碱受体缔合蛋白，由肌肉细胞表达，被认为是一种“生物锚定蛋白”，Rapsyn通过与乙酰胆碱受体互作，以催化它们的聚集，从而确保神经递质的传递(M K,Ramarao.J B,Cohen.Mechanism of nicotinic acetylcholine receptorcluster formation by rapsyn.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1998,95:4007-4012)。现有AchR自身抗体的CBA法，均是通过将Rapsyn与AchR的α、β、δ、ε和/或γ亚基按照一定比例进行瞬时或稳定转染，通过Rapsyn聚集作用，将AchR的各亚基表达于HEK293细胞表面，然后对过表达的细胞进行固定后检测患有重症肌无力症状的样本(Guang Zhao,Xiaoqing Wang,Xiaowen Yu,et al.Clinical application of clustered AchR for the detection ofSNMG.Scientific Reports.2015,5:10193.欧蒙医学实验诊断股份公司申请专利：用于检测针对乙酰胆碱受体的自身抗体的方法.管阳太申请专利：一种乙酰胆碱受体簇集稳定表达的细胞模型及应用方法)。但是，Rapsyn作为一种自身抗原，将其与AchR各亚基进行瞬时转染获得过表达AchR的抗原细胞均会有Rapsyn抗原的表达，从而在进行样本检测时，有可能无法区分Rapsyn与AchR抗体阳性(Agius MA,Zhu S,Kirvan CA,etal.Rapsynantibodies in myasthenia gravis.Ann N Y Acad Sci.1998,841:516-21)。有数据表明，在重症肌无力患者的血清中，Rapsyn自身抗体的阳性率高达15％。但是，目前却没有证据表明rapsyn抗体阳性和重症肌无力的严重程度或某一类亚型有关，与此同时，在一些其他类型的自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮中检测到了rapsyn抗体。因此，有必要提供一种仅含有过表达AchR各亚基(αβδε和/或γ亚基)的细胞爬片，在现有技术的基础上，增加AchR自身抗体检测的特异性。
1995年，A.Vincent等人研究发现，含有P3A+的α亚基不能与MIR mAbs和α-BuTX结合，从而认为含有P3A+的α亚基不能组装成有功能的AchR(C.F.Newland,D.Beeson,A.Vincent et al.Functional and non-functional isoforms of the human muscleacetylcholine receptor.Journal of Physiology.1995,489:767-778)。2002年，Shigeaki Suzuki等研究团队使用重组P3A+的α亚基刺激来自于MG患者和健康人血清中的T细胞，结果表明存在特异识别P3A+序列的T细胞，并且这些T细胞可在患有胸腺瘤和继发性疾病的重症肌无力患者血清中检测到(Shigeaki Suzukia,Kortaro Tanaka,HidekataYasuoka,et al.Autoreactive T cells to the P3A+isoform of AchR a subunit inmyasthenia gravis.Journal of Neuroimmunology.2002,137:177-186)。因此，基于不同方法得到的关于AchRα亚基P3A+是否有功能的结论存在着不一致的情况。
因此，现有技术的缺陷和不足总结如下：
1、现有的研究结果对于AchRα亚基P3A序列在检测阳性样本中是否有必要无明确的定论；
2、Rapsyn是一种自身抗原，它作为辅助蛋白促进AchR各亚基的正确折叠，将其与AchR各亚基进行瞬时转染获得过表达AchR的抗原细胞均会有Rapsyn抗原的表达，在进行样本检测时，有可能无法区分Rapsyn与AchR抗体阳性，从而会有假阳性结果出现；
3、免疫荧光法作为一种可供使用的辅助检测手段，目前尚无商品化的免疫荧光法检测试剂盒。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于检测人体液中乙酰胆碱受体自身抗体的细胞爬片及其制备方法和应用。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开的一种用于检测乙酰胆碱受体自身抗体的细胞爬片的制备方法，包括：将乙酰胆碱受体的各个亚基的重组真核表达载体与一个无外源基因连入的真核表达载体按照一定的比例混合，进行共同转染，再经过固定、洗涤、终止、洗涤、烘干处理，制得检测乙酰胆碱受体自身抗体的细胞爬片。
进一步地，使用时，待检测的样本为包含抗体的体液，所述体液优选地选自全血、血清、脑脊液和唾液。
优选地，所述将乙酰胆碱受体的各个亚基的重组真核表达载体与一个无外源基因连入的真核表达载体混合，按照一定的比例进行共转，具体操作为：
将乙酰胆碱受体的各个亚基基因α1(P3A-)、β1、δ1、ε和γ通过分子克隆方法分别连至一个空载质粒，分别构建得到各个亚基基因α1(P3A-)、β1、δ1、ε和γ的重组载体；
再将上述各个亚基基因α1(P3A-)、β1、δ1、ε和γ的重组载体与一个无外源基因连入的真核表达载体混合，获得共转质粒，将该共转质粒转染至已经铺好细胞的爬片上。
进一步优选地，各个亚基基因α1(P3A-)、β1、δ1、ε和γ的重组载体与一个无外源基因连入的真核表达载体的转染质量比为2:1:1:1:1:(20～60)。
进一步优选地共转质粒的总质量为1ug～10ug，对应转染所用转染试剂的质量为2ug～20ug。
进一步优选地已经铺好细胞的爬片上所铺细胞的密度为30％～40％。
进一步优选地所述空载质粒选择pCDNA3.1或其他常用的过表达外源基因的真核细胞表达载体，所述无外源基因连入的真核表达载体选择17-T2A(质粒图谱见图3)或其他常用的过表达外源基因的真核细胞表达载体。
优选地，所述固定是将共同转染处理后的爬片采用细胞固定液进行处理，所述洗涤是采用PBS进行洗涤处理。
优选地，所述终止是将第一次洗涤后的爬片用(NH4)2SO4溶液进行处理。
本发明还公开了采用上述的制备方法制得的用于检测乙酰胆碱受体自身抗体的细胞爬片。
本发明还公开了上述的用于检测乙酰胆碱受体自身抗体的细胞爬片在制备检测重症肌无力症的试剂盒中的应用。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明公开细胞爬片的制备方法，将AchR的各亚基的重组真核表达载体与一个无外源基因连入的真核表达载体按照一定的比例混合，进行共转，通过固定、洗涤、终止、洗涤、烘干，制成AchR检测用细胞爬片。本发明将AchR各亚基的重组真核表达载体与17-T2A空载体进行混合后共转，得到表达于真核细胞表面的有功能的多聚体，通过验证，该多聚体可以正确识别阳性样本中的抗体。因此，本发明公开的方法是一种不需要Rapsyn作为辅助蛋白的检测AchR受体抗体的细胞爬片的制备方法。该方法与放免法和酶联免疫法相比，具有较高的灵敏度；与现有技术的文献所报道的免疫荧光方法相比，在降低了背景的同时提高了检测的特异性。因此，无论从研究角度还是作为重症肌无力疾病的辅助诊断手段，本发明均具有良好的应用前景。
进一步地，在固定细胞爬片时，通过使用(NH4)2SO4溶液进行终止处理，能够使细胞爬片长期稳定保存，阳性信号和背景均维持在较好的水平。
附图说明
图1为本发明的实施例1质粒组合5、6、7、8的结果图；
图2为本发明的实施例2质粒组合1、2、5、6的结果图。
图3为17-T2A的质粒图谱。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
实施例1
步骤1、重组载体的构建
通过PCR或人工合成的方法，将AchR的各亚基基因α1(P3A+)、α1(P3A-)、β1、δ1、δ2、δ3、δ4、ε、γ以及Rapsyn(longer)，(其中，α1(P3A+)、α1(P3A-)、δ1、δ2、δ3、δ4序列如SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.2、SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.4、SEQ.ID.NO.5、SEQ.ID.NO.6所示，其余序列在NCBI上的序列号为：NM_000747.3、NM_000080.4、NM_005199.5、NM_005055.5)通过分子克隆的方法连至pCDNA3.1上，构建好的重组载体经测序正确后大提备用；
步骤2、细胞转染
(1)293T细胞培养：DMEM高糖培养基与FBS按9:1比例配制成10％FBS-DMEM高糖培养基，待细胞铺满时按1:5～1:6传代，置37℃，5％CO2的细胞培养箱中过夜培养；
(2)待细胞密度为30％～40％时，将各基因按照表1的组合进行转染：
取步骤1得到的重组载体pCDNA3.1-α1(P3A+)、pCDNA3.1-α1(P3A-)、pCDNA3.1-β1、pCDNA3.1-δ1、pCDNA3.1-δ2、pCDNA3.1-δ3、pCDNA3.1-δ4、pCDNA3.1-ε、pCDNA3.1-γ、pCDNA3.1-rapsyn(longer)，其中，pCDNA3.1-α1(P3A+)/pCDNA3.1-α1(P3A-)、pCDNA3.1-β1、pCDNA3.1-δ1/pCDNA3.1-δ2/pCDNA3.1-δ3/pCDNA3.1-δ4、pCDNA3.1-ε、pCDNA3.1-γ与pCDNA3.1-rapsyn(longer)质粒按照质量比为2:1:1:1:1:1的比例进行转染，转染质粒总量为：7ug，4h后更换新鲜培养液，48h后固定细胞。
其中，转染方法还可以使用lipofectamin2000、lipofectamin3000或电转(电转选用低场强0.4cm电转杯，电转条件1500V～2000V、25μF、200Ω)。
表1不同种质粒的组合条件的尝试。
表1
步骤3爬片固定
(1)洗涤：将生长48h的细胞用PBS洗涤2次，
(2)固定：加入1％甲醛固定5min；
(3)洗涤：甲醛固定后的爬片用PBS洗涤2次。
4、实验结果
(1)按照表1的质粒组合进行转染，发现组合5可以出现明显的阳性信号，其他组合无信号或信号较弱，对应的免疫荧光法结果图1所示(只呈现了质粒组合5的结果)。图1中是以1个阳性血为例，介绍质粒组合5、6、7、8的实验结果，质粒组合1、2、3、4因无阳性信号因此未附图。
5、结论
(1)在本实验条件下，α1(P3A+)和α1(P3A-)分别与其余的β1、δ1、ε、γ和rapsyn共同转染，α1(P3A-)可以做出阳性信号，而α1(P3A+)不能做出，本发明明确了使用本方法制备细胞爬片时α亚基的序列需要是P3A-；
(2)δ2、δ3、δ4是缺失不同长度的δ1亚基，只有当δ1与其他亚基共转时，阳性信号明显，其余序列缺失的亚基信号较弱或无信号，本发明明确了使用本方法制备细胞爬片时δ亚基的序列需要是1554bp。
α1亚基不同的剪切变体：
核苷酸序列表中SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2均为AchRα1亚基，SEQ.ID.NO.1缺失SEQ.ID.NO.2的233-307bp，严重影响AchR的正确表达，多余的233bp-307bp的表达会使AchR丧失对抗体的结合能力。
δ亚基不同的剪切变体：
核苷酸序列表中SEQ.ID.NO.3～SEQ.ID.NO.6均为AchR的δ亚基，4个亚基具有不同的长度，与SEQ.ID.NO.3相比，SEQ.ID.NO.4缺失序列199-243bp，SEQ.ID.NO.5缺失510-820bp，SEQ.ID.NO.6缺失1-270bp，322-355bp，δ亚基前半段不同的序列缺失均影响AchR的正确表达，从而导致其对样本中AchR抗体的结合能力下降。在本发明中，对δ亚基来说，该亚基的前半段1-270、199-243、322-355、510-820bp的核酸序列对于AchR的完整表达或对于AchR能正确识别血清中抗AchR的抗体的能力来说，是必须的。
如SEQ.ID.NO.3所示的δ亚基剪切变体1(1554bp)；如SEQ.ID.NO.4所示的δ亚基剪切变体2(1509bp)，缺少第199-243位碱基，比SEQ.ID.NO.3少45bp；如SEQ.ID.NO.5所示的δ亚基剪切变体3(972bp)缺少第510-820位碱基，比SEQ.ID.NO.3的δ1少310bp；如SEQ.ID.NO.6所示的δ亚基剪切变体4(1251bp)：缺少第1-271碱基和第322-353碱基，比SEQ.ID.NO.3的δ1少303bp。
实施例2
1、重组载体的构建
通过PCR或人工合成的方法，将Rapsyn(shorter，NCBI上的序列号为：NM_032645.5)，基因通过分子克隆方法连至pCDNA3.1上，其余所需载体均使用实施例1所构建好的载体，构建好的重组载体经测序正确后大提备用；
2、细胞转染
(1)293T细胞培养：DMEM高糖培养基与FBS按9:1比例配制成10％FBS-DMEM高糖培养基，待细胞铺满时按1:5～1:6传代，置37℃，5％CO2的细胞培养箱中过夜培养；
(2)待细胞密度为30％～40％时，将各基因按照表2和表3的组合进行转染：
转染体系1(表1)：
取实施例1和实施例2步骤1得到的重组载体pCDNA3.1-α1(P3A-)、pCDNA3.1-β1、pCDNA3.1-δ1、pCDNA3.1-ε、pCDNA3.1-γ、pCDNA3.1-rapsyn(longer)、pCDNA3.1-rapsyn(shorter)，转染质粒总量为7ug。其中，pCDNA3.1-α1(P3A-)、pCDNA3.1-β1、pCDNA3.1-δ1、pCDNA3.1-ε、pCDNA3.1-γ与pCDNA3.1-rapsyn(longer)/pCDNA3.1-rapsyn(shorter)质粒按照2:1:1:1:1:1的比例进行转染；
转染体系2(表2)：
取实施例1和实施例2步骤1得到的重组载体pCDNA3.1-α1(P3A-)、pCDNA3.1-β1、pCDNA3.1-δ1、pCDNA3.1-ε、pCDNA3.1-γ、pCDNA3.1-rapsyn(longer)、pCDNA3.1-rapsyn(shorter)与17-T2A，转染质粒总量为6ug。其中，pCDNA3.1-α1(P3A-)、pCDNA3.1-β1、pCDNA3.1-δ1、pCDNA3.1-ε、pCDNA3.1-γ与17-T2A/pCDNA3.1-rapsyn(longer)/pCDNA3.1-rapsyn(shorter)按照2:1:1:1:1:24的比例进行转染，4h后更换新鲜培养液，48h后固定细胞。
其中，17-T2A的质粒结构图谱如图3所示，该质粒长度为6131bp。
其中，转染方法还可以使用lipofectamin2000、lipofectamin3000或电转(电转选用低场强0.4cm电转杯，电转条件1500V～2000V、25μF、200Ω)或其他常用的转染方法进行转染。
为了保证AchR各亚基的表达，表2记载的AchR各亚基均使用较高质粒量进行转染。
表2
在转染体系中引入空载17-T2A后，表3记载的AchR各亚基均使用较低的质粒量进行转染。
表3
3、爬片固定
(1)洗涤：将生长48h的细胞用PBS洗涤2次，
(2)固定：加入1％甲醛固定5min；
(3)洗涤：甲醛固定后的爬片用PBS洗涤2次。
4、实验结果
以检测一个阳性样本和一个阴性样本为例，实验结果如下表4和图2所示，质粒组合6取得了好的效果，质粒组合3和质粒组合4因在阳性样本上无阳性信号而未附图。
表4
基因
阳性信号
背景(指阴性样本中是否有疑似阳性信号)
质粒组合1
有
有
质粒组合2
有
有
质粒组合3
无
无
质粒组合4
无
无
质粒组合5
无
无
质粒组合6
有
无
上表4中：
质粒组合1：
pCDNA3.1-α1+pCDNA3.1-β1+pCDNA3.1-δ1+pCDNA3.1-ε+pCDNA3.1-γ+pCDNA3.1-rapsyn(1239bp)
质粒组合2：
pCDNA3.1-α1+pCDNA3.1-β1+pCDNA3.1-δ1+pCDNA3.1-ε+pCDNA3.1-γ+pCDNA3.1-rapsyn(1062bp)
质粒组合3：
pCDNA3.1-α1+pCDNA3.1-β1+pCDNA3.1-δ1+pCDNA3.1-ε+pCDNA3.1-γ+pCDNA3.1-rapsyn(1239bp)
质粒组合4：
pCDNA3.1-α1+pCDNA3.1-β1+pCDNA3.1-δ1+pCDNA3.1-ε+pCDNA3.1-γ+pCDNA3.1-rapsyn(1062bp)
质粒组合5：
pCDNA3.1-α1+pCDNA3.1-β1+pCDNA3.1-δ1+pCDNA3.1-ε+pCDNA3.1-γ
质粒组合6：
pCDNA3.1-α1+pCDNA3.1-β1+pCDNA3.1-δ1+pCDNA3.1-ε+pCDNA3.1-γ+17-T2A
结果分析：
由图2阳性样本结果图可以看出，在四种质粒的组合上，信号强度以及阳性信号形态基本一致。因此，得到如下结论：
(1)通过在转染体系中引入空载17-T2A，可以促进AchR的正确表达，进而识别阳性样本中的抗体；
(2)为了控制阴性样本的背景，在降低质粒量的同时，引入空载17-T2A，可以促进AchR的正确表达，进而识别阳性样本中的抗体；
(3)通过在转染体系中引入空载17-T2A，得到了和含有rapsyn质粒共转的质粒组合一样的效果，阳性信号强度和信号数量基本一致。
在本发明的一个进一步的进展中，将硫酸铵应用于细胞洗涤后的终止，可以有效延长细胞爬片的保质期。
所述的烘干方法包括微波炉加热烘干、金属浴加热烘干、烘箱加热烤干等可以干燥的方法。
实施例3
1、293T细胞培养：DMEM高糖培养基与FBS按9:1比例配制成10％FBS-DMEM高糖培养基，待细胞铺满时按1:5～1:6传代，置37℃，5％CO2的细胞培养箱中过夜培养；
2、待细胞密度为30％～40％时，取实施例1构建好的载体按如下三种方式的组合进行转染，4h后更换新鲜培养液，48h后固定细胞。
(1)成人型+胎儿型：pCDNA3.1-α1(P3A-)、pCDNA3.1-β1、pCDNA3.1-γ、pCDNA3.1-δ1、pCDNA3.1-ε、17-T2A，质粒按照2:1:1:1:1:24的比例进行转染，转染质粒总量为：6ug；
(2)成人型：pCDNA3.1-α1(P3A-)、pCDNA3.1-β1、pCDNA3.1-γ、pCDNA3.1-δ1、17-T2A，质粒按照2:1:1:1:24的比例进行转染，转染质粒总量为：6ug；
(3)胎儿型：pCDNA3.1-α1(P3A-)、pCDNA3.1-β1、pCDNA3.1-δ1、pCDNA3.1-ε，17-T2A，质粒按照2:1:1:1:24的比例进行转染，转染质粒总量为：6ug；
3、按照实施例3爬片的处理方式对上述已转染好的细胞进行处理；
4、对40例ELISA结果为阳性的AchR患者进行免疫荧光法检测，使用胎儿型+成人型亚基组合；胎儿型亚基组合、成人型亚基组合的荧光爬片进行验证；
5、结果如下表5所示
表5
结果分析：
由表5结果可知，单独的胎儿型亚基组合阳性率为85％，单独的成人型亚基组合阳性率为90％，胎儿型和成人型亚基的组合检出率为92.5％。因此，在检测AchR疑似样本时，使用组合：pCDNA3.1-α1(P3A-)、pCDNA3.1-β1、pCDNA3.1-γ、pCDNA3.1-δ1、pCDNA3.1-ε、17-T2A检测具有更高的灵敏度，。
实施例4
使用实施例3获得的胎儿型和成人型亚基组合的细胞爬片对已检出的37例血清进行IgG抗体的分型，得到的结果如下表6所示：
表6
抗体分型
IgG1
IgG1、IgG3
IgG1、IgG4
IgG1、IgG2、IgG3、IgG4
阳性病例数
22
10
2
3
由上述结果可知，AchR阳性患者中，IgG1亚型的病人所占比例最多。Maria IsabelLeite等人在seronegative myasthenia gravis病人中筛到的AchR阳性血，主要也是IgG1亚型(Maria Isabel Leite,Saiju Jacob,Stuart Viegas,et al.IgG1antibodies toacetylcholine receptors in‘seronegative’myasthenia gravis.Brain.2008,131,1940-1952)。
实施例5
将实施例2的组合6按照如下步骤对细胞爬片进行处理。
1、洗涤：将生长48h的细胞用PBS洗涤2次，
2、固定：加入1％甲醛固定5min；
3、洗涤：甲醛固定后的爬片用PBS洗涤2次；
4、终止：使用硫酸铵溶液终止爬片5min；
5、洗涤：终止后的爬片用PBS洗涤2次；
6、烘干：使用金属浴干燥5min。
保质期数据如下表7所示：
表7
爬片处理
未使用硫酸铵处理
硫酸铵终止
4℃保质期(天)
7
180天或更长
37℃保存(天)
3
21天
由上表结果可知，经硫酸铵处理后的细胞爬片保质期明显增加。
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
序列表
<110> 陕西脉元生物科技有限公司
<120> 一种用于检测人体液中乙酰胆碱受体自身抗体的细胞爬片及其制备方法和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1374
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggagccct ggcctctcct cctgctcttt agcctttgct cagctggcct cgtcctgggc 60
tccgaacatg agacccgtct ggtggcaaag ctatttaaag actacagcag cgtggtgcgg 120
ccagtggaag accaccgcca ggtcgtggag gtcaccgtgg gcctgcagct gatacagctc 180
atcaatgtgg atgaagtaaa tcagatcgtg acaaccaatg tgcgtctgaa acagcaatgg 240
gtggattaca acctaaaatg gaatccagat gactatggcg gtgtgaaaaa aattcacatt 300
ccttcagaaa agatctggcg cccagacctt gttctctata acaatgcaga tggtgacttt 360
gctattgtca agttcaccaa agtgctcctg cagtacactg gccacatcac gtggacacct 420
ccagccatct ttaaaagcta ctgtgagatc atcgtcaccc actttccctt tgatgaacag 480
aactgcagca tgaagctggg cacctggacc tacgacggct ctgtcgtggc catcaacccg 540
gaaagcgacc agccagacct gagcaacttc atggagagcg gggagtgggt gatcaaggag 600
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ccaaatatca tgtttttctc cacaatgaaa agaccatcca gagaaaagca agacaaaaag 1080
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<210> 2
<211> 1449
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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atggagccct ggcctctcct cctgctcttt agcctttgct cagctggcct cgtcctgggc 60
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<212> DNA
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agcctgaaac aggatgccaa ggagaaccgc acctaccccg tggagtggat catcattgat 300
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