具体实施方式

以下，对用于实施本发明的方式详细地进行说明。但是，本发明并不限定于以下的实施方式。

＜含细胞外基质组合物＞

本实施方式的含细胞外基质组合物包含经片段化的细胞外基质成分(片段化细胞外基质成分)和键合或吸附于经片段化的细胞外基质成分的化合物。

本实施方式的含细胞外基质组合物可适合地用作用于形成三维组织体的支架材料等。

细胞外基质成分是在三维组织体中填埋至少一部分细胞间的间隙的材料。细胞外基质成分是由多个细胞外基质分子形成的细胞外基质分子的集合体。细胞外基质分子可以是在生物中存在于细胞外的物质。作为细胞外基质分子，只要不对细胞的生长及细胞集合体的形成造成不良影响，就可以使用任意的物质。作为细胞外基质分子，可举出胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白、波连蛋白、弹性蛋白、细胞粘合素、巢蛋白、纤维蛋白、及蛋白多糖等，但并不限定于这些。细胞外基质成分可以单独使用其中的1种，也可以组合使用。细胞外基质成分例如可以包含胶原，也可以由胶原构成。在细胞外基质成分包含胶原的情况下，胶原作为细胞粘附的支架发挥功能，进一步促进三维的细胞结构体的形成。需要说明的是，只要不对细胞的生长及细胞集合体的形成造成不良影响，细胞外基质分子可以是上述的细胞外基质分子的修饰体及突变体，也可以是化学合成肽等多肽。细胞外基质分子可以具有胶原特征性的由Gly-X-Y表示的重复序列。在此，Gly表示甘氨酸残基，X和Y各自独立地表示任意的氨基酸残基。多个Gly-X-Y分别可以相同也可以不同。通过具有由Gly-X-Y表示的重复序列，对分子链的配置的束缚少，作为支架材料的功能更为优异。在具有由Gly-X-Y表示的重复序列的细胞外基质分子中，由Gly-X-Y表示的序列的比例在全部氨基酸序列中可以为80％以上，优选为95％以上。另外，细胞外基质分子也可以是具有RGD序列的多肽。RGD序列是指由Arg-Gly-Asp(精氨酸残基-甘氨酸残基-天冬氨酸残基)表示的序列。通过具有RGD序列，细胞粘附得到进一步促进，作为支架材料更为合适。作为包含由Gly-X-Y表示的序列和RGD序列的细胞外基质分子，可举出胶原、纤连蛋白、波连蛋白、层粘连蛋白、钙黏着蛋白等。

作为胶原，例如可举出纤维性胶原及非纤维性胶原。纤维性胶原是指成为胶原纤维主成分的胶原，具体而言，可举出I型胶原、II型胶原、III型胶原等。作为非纤维性胶原，例如可举出IV型胶原。

作为蛋白多糖，可举出硫酸软骨素蛋白多糖、硫酸乙酰肝素蛋白多糖、硫酸角质素蛋白多糖、硫酸皮肤素蛋白多糖，但并不限定于这些。

细胞外基质成分可以包含选自胶原、层粘连蛋白和纤连蛋白中的至少1种，优选包含胶原。胶原优选为纤维性胶原，更优选为I型胶原。作为纤维性胶原，可以使用市售的胶原，作为其具体例，可举出日本Ham株式会社制的猪皮来源的I型胶原。

细胞外基质成分可以是动物来源的细胞外基质成分。作为成为细胞外基质成分的来源的动物种，例如可举出人、猪、牛等，但并不限定于这些。细胞外基质成分可以使用一种动物来源的成分，也可以将多种动物来源的成分并用。成为细胞外基质成分的来源的动物种与进行三维组织化的细胞的来源可以相同也可以不同。

片段化细胞外基质成分可以通过将上述的细胞外基质成分片段化而得到。“片段化”是指使细胞外基质分子的集合体成为更小的尺寸。片段化可以在切断细胞外基质分子内的键的条件下进行，也可以在不切断细胞外基质分子内的键的条件下进行。经片段化的细胞外基质成分可以包含通过施加物理性的力对上述的细胞外基质成分进行解纤而得到的成分、即经解纤的细胞外基质成分。解纤是片段化的一个方式，例如是在不切断细胞外基质分子内的键的条件下进行的。

作为将细胞外基质成分片段化的方法，没有特别限制。作为对细胞外基质成分进行解纤的方法，例如可以通过施加超声波式均化器、搅拌式均化器、及高压式均化器等物理性的力来对细胞外基质成分进行解纤。在使用搅拌式均化器的情况下，可以将细胞外基质成分直接均化，也可以在生理盐水等水性介质中进行均化。另外，通过调整进行均化的时间、次数等，也可以得到毫米尺寸、纳米尺寸的解纤细胞外基质成分。解纤细胞外基质成分也可以通过反复进行冷冻融解进行解纤而得到。

片段化细胞外基质成分可以至少一部分地包含经解纤的细胞外基质成分。另外，片段化细胞外基质成分也可以仅由经解纤的细胞外基质成分构成。即，片段化细胞外基质成分可以是经解纤的细胞外基质成分。经解纤的细胞外基质成分优选包含经解纤的胶原成分(解纤胶原成分)。解纤胶原成分优选维持胶原来源的三重螺旋结构。通过使片段化胶原成分分散在水性介质中，在水性介质中容易与细胞接触，可促进三维组织体的形成。

作为片段化细胞外基质成分的形状，例如可举出纤维状。纤维状是指由丝状的细胞外基质成分构成的形状、或者丝状的细胞外基质成分在分子间交联而构成的形状。片段化细胞外基质成分的至少一部分可以为纤维状。在纤维状的细胞外基质成分中包括将多个丝状细胞外基质分子集合而形成的细丝状物(细纤维)、细纤维进一步集合而形成的丝状物、将这些丝状物解纤而得到的物质等。在纤维状的细胞外基质成分中，RGD序列不被破坏地得以保存，能够更有效地作为用于细胞粘附的支架材料发挥功能。

片段化细胞外基质成分的平均长度可以为100nm以上且400μm以下，也可以为100nm以上且200μm以下。在一个实施方式中，从容易形成厚的组织的观点出发，片段化细胞外基质成分的平均长度可以为5μm以上且400μm以下，可以为10μm以上且400μm以下，可以为22μm以上且400μm以下，也可以为100μm以上且400μm以下。在另一实施方式中，从组织形成容易稳定的观点和再分散性更为优异的观点出发，片段化细胞外基质成分的平均长度可以为100μm以下，可以为50μm以下，可以为30μm以下，可以为15μm以下，可以为10μm以下，也可以为1μm以下，且可以为100nm以上。片段化细胞外基质成分整体中，大部分的片段化细胞外基质成分的平均长度优选在上述数值范围内。具体而言，优选片段化细胞外基质成分整体中的95％的片段化细胞外基质成分的平均长度在上述数值范围内。片段化细胞外基质成分优选为平均长度在上述范围内的片段化胶原成分，更优选平均长度在上述范围内的解纤胶原成分。

片段化细胞外基质成分的平均直径可以为50nm～30μm，可以为4μm～30μm，可以为5μm～30μm。片段化细胞外基质成分优选为平均直径在上述范围内的片段化胶原成分，更优选平均直径在上述范围内的解纤胶原成分。

上述的平均长度和平均直径的范围从组织形成的观点出发是最优化的，因此期望在后述的干燥工序后将片段化细胞外基质成分再次悬浮于水性介质中进行组织形成的阶段收束于上述的平均长度或平均直径的范围内。

片段化细胞外基质成分的平均长度及平均直径可以通过利用光学显微镜测定各片段化细胞外基质成分并进行图像分析而求出。在本说明书中，“平均长度”是指所测定的试样的长度方向的长度的平均值，“平均直径”是指所测定的试样的与长度方向正交的方向的长度的平均值。

经片段化的细胞外基质成分的至少一部分可以在分子间或分子内交联。经片段化的细胞外基质成分可以在构成经片段化的细胞外基质成分的分子内交联，也可以在构成经片段化的细胞外基质成分的分子间交联。

作为进行交联的方法，例如可举出通过施加热、紫外线、放射线等进行的物理交联、通过交联剂、酶反应等进行的化学交联等方法，但其方法并没有特别限定。交联(物理交联和化学交联)可以是介由共价键的交联。

在细胞外基质成分包含胶原成分的情况下，交联可以在胶原分子(三重螺旋结构)之间形成，也可以在由胶原分子形成的胶原细纤维之间形成。交联可以是通过热进行的交联(热交联)。热交联例如可以通过使用真空泵在减压下进行加热处理来实施。在进行胶原成分的热交联的情况下，细胞外基质成分可以通过胶原分子的氨基与同一或其他胶原分子的羧基形成肽键(-NH-CO)而交联。

细胞外基质成分也可以通过使用交联剂来使其交联。交联剂例如可以为能够使羧基与氨基交联的交联剂、或者能够使氨基彼此交联的交联剂。作为交联剂，例如从经济性、安全性及操作性的观点出发，优选醛类、碳二亚胺类、环氧化物类和咪唑系交联剂，具体而言，可举出戊二醛、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺磺酸盐等水溶性碳二亚胺。

交联度的定量可以根据细胞外基质成分的种类、进行交联的手段等适当选择。交联度可以为1％以上、2％以上、4％以上、8％以上、或12％以上，且可以为30％以下、20％以下、或15％以下。通过使交联度在上述范围内，细胞外基质分子能够适度分散，并且干燥保存后的再分散性良好。

在细胞外基质成分中的氨基用于交联的情况下，交联度可以基于非专利文献2等中记载的TNBS法进行定量。基于TNBS法的交联度优选在上述范围内。基于TNBS法的交联度是细胞外基质所具有的氨基中用于交联的氨基的比例。

交联度也可以通过对羧基进行定量来计算。例如，在不溶性于水的细胞外基质成分的情况下，可以通过TBO(甲苯胺蓝O)法进行定量。通过TBO法得到的交联度可以在上述的范围内。

含细胞外基质组合物中的经片段化的细胞外基质成分(片段化细胞外基质成分)的含量以含细胞外基质组合物总量为基准，可以为1质量％以上、3质量％以上、10质量％以上、20质量％以上、30质量％以上、40质量％以上、50质量％以上、60质量％以上、70质量％以上、80质量％以上、90质量％以上、95质量％以上、或98质量％以上，且可以为99质量％以下、95质量％以下或90质量％以下。

本实施方式的含细胞外基质组合物包含键合或吸附于片段化细胞外基质成分的化合物。化合物只要是能够键合或吸附于含细胞外基质组合物中所含的经片段化的细胞外基质成分的化合物即可，可以是生物分子。本说明书中，能够键合或吸附与可用化合物涂布解纤细胞外基质成分含义相同。另外，在涂布解纤细胞外基质成分的情况下，可以整面涂布，也可以涂布一部分。化合物可以根据经片段化的细胞外基质成分的种类适当选择。化合物例如可以是包含与经片段化的细胞外基质成分同种或不同种的细胞外基质分子的细胞外基质成分。作为化合物的具体例，例如可举出硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素、纤连蛋白、肝素、蛋白多糖、透明质酸、硫酸乙酰肝素蛋白多糖、硫酸软骨素蛋白多糖、层粘连蛋白、巢蛋白、细胞粘合素、弹性蛋白、纤维蛋白，但并不限定于这些。例如，化合物可以为选自硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、及纤连蛋白中的至少1种。在片段化细胞外基质成分为片段化胶原成分的情况下，化合物可以是硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素、肝素或纤连蛋白。键合或吸附有化合物的片段化细胞外基质成分具有片段化细胞外基质成分单独所不具有的功能，或者可增强片段化细胞外基质成分单独时的功能。例如，硫酸软骨素的情况下，细胞彼此的粘附力提高。肝素的情况下，细胞生长变得容易。纤连蛋白的情况下，片段化细胞外基质成分与细胞的粘附性提高。

化合物的含量相对于片段化细胞外基质成分100质量份，可以为0.5质量份以上且10质量份以下，可以为1.0质量份以上且8.0质量份以下，可以为1.5质量份以上且4.0质量份以下。化合物的含量例如可以基于后述的实施例中记载的吸附率等来计算。

含细胞外基质组合物可以仅由片段化细胞外基质成分和上述化合物构成，也可以包含除片段化细胞外基质成分和上述化合物以外的成分(其他成分)。

从容易称量的观点出发，含细胞外基质组合物的形态可以为固体状或粉末状。含细胞外基质组合物可以不包含水分。含细胞外基质组合物中的水分例如可以通过冷冻干燥法除去。不包含水分并不意味着不包含任何水分子，而是指不包含能够通过冷冻干燥法等干燥方法常识性地达到的程度的水分。

一个实施方式的含细胞外基质组合物可以在水性介质中分散。“水性介质”是指以水作为必须构成成分的液体。作为水性介质，只要细胞外基质成分能够稳定地存在，就没有特别限制。例如作为水性介质，可举出磷酸缓冲生理盐水(PBS)等生理盐水、Dulbecco’sModified Eagle培养基(DME M)、血管内皮细胞专用培养基(EGM2)等液体培养基，但不限于此。

在水性介质中能够分散例如通过以下的方法来判定。即，在将含细胞外基质组合物50mg添加到超纯水5mL中并悬浮时，在超纯水中分散有含细胞外基质组合物的情况(不发生凝聚等的情况)下，可以判定为在水性介质中能够分散。使含细胞外基质组合物在超纯水中分散时的温度可以是培养温度(例如37℃)以下的温度，也可以是室温。分散的状态是指目视未产生凝聚、沉降等的状态。需要说明的是，能够分散例如也可以通过吸光度测定来判别。

水性介质的pH优选不对细胞的生长及细胞集合体的形成造成不良影响的范围。从减轻投入细胞时对细胞的负荷的观点出发，水性介质的pH例如可以为7.0以上，且可以为8.0以下。具体而言，水性介质的pH可以为7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0。水性介质优选在上述pH的范围内具有缓冲能力，更优选为液体培养基。液体培养基没有特别限制，可以根据所培养的细胞的种类选择适当的培养基。作为该培养基，例如可举出Eagle’s MEM培养基、DMEM、Modified Eagle培养基(MEM)、Minimum Essential培养基、RPMI、及GlutaMax培养基等。培养基可以是添加有血清的培养基，也可以是无血清培养基。此外，液体培养基也可以是将两种以上的培养基混合而成的混合培养基。

＜含细胞外基质组合物的制造方法＞

本实施方式的含细胞外基质组合物的制造方法具备使经片段化的细胞外基质成分与可键合或吸附于经片段化的细胞外基质成分的化合物接触的工序(接触工序)。作为接触工序，可举出将含有经片段化的细胞外基质成分的水性介质和含有化合物的水性介质混合、在含有经片段化的细胞外基质成分的水性介质中添加化合物等方法，但并不限于这些。另外，接触工序中也可以包含在使经片段化的细胞外基质成分与化合物接触后孵育一定时间的工序。

经片段化的细胞外基质成分可以通过上述方法得到。经片段化的细胞外基质成分可以通过将细胞外基质成分在水性介质中进行片段化而得到。即，本实施方式的制造方法可以具备在接触工序之前将细胞外基质成分在水性介质中进行片段化的工序(片段化工序)。水性介质可以与上述水性介质相同。片段化工序可以是在接触工序之前将细胞外基质成分在水性介质中进行解纤的工序。

经片段化的细胞外基质成分可以是上述例示过的成分，可以含有经片段化的胶原成分，也可以含有经解纤的胶原成分。可键合或吸附于经片段化的细胞外基质成分的化合物可以使用上文所述的化合物。

本实施方式的制造方法可以具备在片段化工序前对细胞外基质成分进行加热而将细胞外基质成分的至少一部分交联的工序，也可以具备在片段化工序后且接触工序前对细胞外基质成分进行加热而将细胞外基质成分的至少一部分交联的工序。

在进行交联的工序中，加热细胞外基质成分时的温度(加热温度)及时间(加热时间)可以适当确定。加热温度例如可以为100℃以上，且可以为200℃以下。加热温度具体而言，可以为例如100℃、110℃、120℃、130℃、140℃、150℃、160℃、170℃、180℃、190℃、200℃等。加热时间(在上述加热温度下进行保持的时间)可以根据加热温度适当设定。对于加热时间，例如在100℃～200℃下进行加热的情况下，可以为6小时以上且72小时以下，更优选为24小时以上且48小时以下。在进行交联的工序中，可以在不存在溶剂的条件下进行加热，另外也可以在减压条件下进行加热。

本实施方式的制造方法在片段化工序后可以具备将经片段化的细胞外基质成分干燥的干燥工序。

在干燥工序中，将经片段化的细胞外基质成分干燥。干燥例如可以通过冷冻干燥法实施。通过在片段化工序后进行干燥工序，从包含片段化细胞外基质成分和水性介质的液体中除去水性介质。除去水性介质并不意味着在经片段化的细胞外基质成分中没有附着任何水分，而是指未附着有通过上述的常规的干燥方法能够常识性地达到的程度的水分。

含细胞外基质组合物可以适合地用作用于形成三维组织体的支架材料。因此，含细胞外基质组合物适合用于三维组织体形成用途。

＜三维组织体形成剂＞

含细胞外基质组合物适合作为用于形成三维组织体的支架材料等，因此在本发明的一个实施方式中，提供一种三维组织体形成剂，其包含上述的含细胞外基质组合物。

本实施方式的三维组织体形成剂包含上述的解纤细胞外基质成分，因此能够形成更厚的三维组织体。

三维组织形成剂在进行保存时可以为粉末的状态，另外在三维组织体的形成阶段，优选为分散于水性介质的分散液的状态。

＜三维组织体＞

本实施方式的三维组织体包含上述的含细胞外基质组合物和细胞。细胞的至少一部分可以与含细胞外基质组合物中的解纤细胞外基质成分接触。作为接触的一个方式，可以进行粘附。“三维组织体”是指细胞介由细胞外基质成分三维地配置的细胞的集合体，是指通过细胞培养而人工制作的集合体。三维组织体的形状没有特别限制，例如可举出片状、球体状、椭圆体状、长方体状等。在此，生物体组织包含血管、汗腺、淋巴管、皮脂腺等，构成比三维组织体复杂。因此，三维组织体与生物体组织能够容易地区别。

细胞没有特别限定，例如可以是人、猴、狗、猫、兔、猪、牛、小鼠、大鼠等动物来源的细胞。细胞的来源部位也没有特别限定，可以是骨、肌肉、内脏、神经、脑、骨、皮肤、血液等来源的体细胞，也可以是生殖细胞。此外，细胞可以是诱导多能性干细胞细胞(iPS细胞)、胚胎干细胞(ES细胞)，另外也可以是原代培养细胞、传代培养细胞及细胞株细胞等培养细胞。具体而言，作为细胞，例如可举出神经细胞、树突状细胞、免疫细胞、血管内皮细胞(例如人脐带静脉来源的血管内皮细胞(HUVEC))、血管周皮细胞、淋巴管内皮细胞、成纤维细胞、大肠癌细胞(例如人大肠癌细胞(HT29))、肝癌细胞等癌细胞、上皮细胞(例如人牙龈上皮细胞)、角化细胞、心肌细胞(例如人iPS细胞来源的心肌细胞(iPS-CM))、肝细胞、胰岛细胞、组织干细胞、平滑肌细胞(例如主动脉平滑肌细胞(Aorta-SMC)等，但并不限定于这些。细胞可以包含选自血管内皮细胞、癌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、及上皮细胞中的一种或多种细胞。细胞可以单独使用一种，也可以将多种细胞组合使用。

作为细胞，优选包含分泌细胞外基质分子的细胞外基质分泌细胞。作为细胞外基质分泌细胞，例如可举出分泌纤维性胶原等胶原的胶原分泌细胞。作为胶原分泌细胞，例如可举出成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞等间充质细胞，优选为成纤维细胞。作为优选的成纤维细胞，例如可举出人皮肤来源的成纤维细胞(NHDF)、人心脏成纤维细胞(NHCF)和人牙龈成纤维细胞(HGF)。

在三维组织体包含细胞外基质分泌细胞作为细胞的情况下，三维组织体可以包含内源性细胞外基质。“内源性细胞外基质”是指构成三维组织体的细胞外基质产生细胞所产生的细胞外基质。

在三维组织体包含胶原分泌细胞作为细胞的情况下，三维组织体可以包含内源性胶原。“内源性胶原”是指构成三维组织体的胶原产生细胞所产生的胶原。内源性胶原可以是纤维性胶原，也可以是非纤维性胶原。

在三维组织体包含细胞外基质分泌细胞作为细胞的情况下，三维组织体可以包含：包含细胞外基质分泌细胞的细胞、含细胞外基质组合物、和内源性细胞外基质成分。在该情况下，包含细胞外基质分泌细胞的细胞中的至少一部分可以与片段化细胞外基质成分和/或内源性细胞外基质成分接触。以往的三维组织体的细胞外基质(胶原等)的浓度低且细胞密度高。因此，存在如下问题：在培养中或培养后，三维组织体由于细胞的牵引力而收缩，或在培养中或培养后在细胞所产生的酶的作用下，三维组织体容易地分解。在一个实施方式的三维组织体中，细胞外基质(胶原等)的浓度高于以往的组织体，不易引起收缩，是稳定的。

三维组织体可以包含细胞外基质分泌细胞和除细胞外基质分泌细胞以外的细胞作为细胞。作为除细胞外基质产生细胞以外的细胞，可举出血管内皮细胞(例如人脐带静脉来源的血管内皮细胞(HUVEC))、大肠癌细胞(例如人大肠癌细胞(HT29))、肝癌细胞等癌细胞、心肌细胞(例如人iPS细胞来源的心肌细胞(iPS-CM))、上皮细胞(例如人牙龈上皮细胞)、角化细胞、淋巴管内皮细胞、神经细胞、肝细胞、组织干细胞、胚胎干细胞、人工多能性干细胞、粘附性细胞(例如免疫细胞)、平滑肌细胞(例如主动脉平滑肌细胞(Aorta-SMC))等。构成上述三维组织体的细胞优选还包含选自血管内皮细胞、癌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和上皮细胞中的一种或多种细胞。

三维组织体中的经片段化的细胞外基质成分与上述化合物的总含量以经片段化的细胞外基质成分、上述化合物和细胞的总质量为基准，可以为0.01质量％以上且90质量％以下，可以为10质量％以上且90质量％以下，可以为10质量％以上且80质量％以下，可以为10质量％以上且70质量％以下，可以为10质量％以上且60质量％以下，可以为1质量％以上且50质量％以下，可以为10质量％以上且50质量％以下，可以为10质量％以上且30质量％以下，可以为20～30质量％。经片段化的细胞外基质成分和上述化合物的总含量例如可以通过常规的MS成像来测定。

在三维组织体含有胶原的情况下，三维组织体中的胶原含有率以经片段化的细胞外基质成分、上述化合物和细胞的总质量为基准，可以为0.01～90质量％，优选为0.33～90质量％，优选为5～90质量％，优选为10～90质量％，优选为10～80质量％，优选为10～70质量％，优选为10～60质量％，优选为1～50质量％，优选为10～50质量％，更优选为10～30质量％，更优选为20～30质量％。

在此，“三维组织体中的胶原”是指构成三维组织体的胶原，可以是内源性胶原，也可以是片段化胶原成分来源的胶原(外源性胶原)。即，在三维组织体包含内源性胶原成分和片段化胶原成分的情况下，构成上述三维组织体的胶原含有率是指内源性胶原成分和上述片段化胶原成分的总浓度。上述胶原含有率可以根据所得到的三维组织体的体积和经脱细胞化的三维组织体的质量来计算。

另外，作为对三维组织体中的胶原量进行定量的方法，例如可举出以下那样的对羟基脯氨酸进行定量的方法。在溶解有三维组织体的溶解液中混合盐酸(HCl)，在高温下孵育规定的时间后恢复至室温，将离心分离后的上清液稀释至规定的浓度，由此制备样品。将羟基脯氨酸标准溶液与样品同样地进行处理后，阶段性地进行稀释而制备标准溶液。对样品和标准溶液分别用羟基脯氨酸分析缓冲液和检测试剂进行规定的处理，测定570nm的吸光度。通过将样品的吸光度与标准溶液进行比较来计算胶原量。需要说明的是，也可以将三维组织体直接悬浮在高浓度的盐酸中，将溶解后的溶解液离心分离，回收上清液，用于胶原定量。另外，所溶解的三维组织体可以为直接从培养液中回收的状态，也可以在回收后进行干燥处理，在除去液体成分的状态下使其溶解。但是，在将直接从培养液中回收的状态的三维组织体溶解而进行胶原定量的情况下，由于预想由于三维组织体所吸收的培养基成分以及由于实验手法的问题而导致的培养基残留的影响，三维组织体重量的测量值会产生偏差，因此从稳定地测量组织体的重量和每单位重量中所占的胶原量的观点出发，优选以干燥后的重量为基准。

作为对胶原量进行定量的方法，更具体而言，例如可举出以下方法。

(样品的制备)

将进行了冷冻干燥处理的三维组织体的总量与6mol/l HCl混合，用加热块在95℃下孵育20小时以上后，恢复至室温。以13000g离心分离10分钟后，回收样品溶液的上清液。在后述的测定中，以结果收束于标准曲线的范围内的方式用6mol/l HCl进行适当稀释后，用100μL的超纯水稀释200μL，由此制备样品。样品使用35μL。

(标准溶液的制备)

在螺口试管中加入125μL的标准溶液(1200μg/mL醋酸溶液)和125μL的12mol/lHCl进行混合，用加热块在95℃下孵育20小时后，恢复至室温。以13000g离心分离10分钟后，用超纯水稀释上清液，制作300μg/mL的S1，将S1阶段性地稀释，制作S2(200μg/mL)、S3(100μg/mL)、S4(50μg/mL)、S5(25μg/mL)、S6(12.5μg/mL)、S7(6.25μg/mL)。也准备仅4mol/l HCl90μL的S8(0μg/mL)。

(分析)

将35μL的标准溶液和样品分别加入到平板(QuickZyme Total Collagen Assay试剂盒附带、QuickZyme Biosciences公司)中。将75μL的分析缓冲液(上述试剂盒附带)加入到各孔中。用密封件封闭平板，在摇动20分钟的同时在室温下孵育。将密封件剥离，将75μL的检测试剂(试剂A：B＝30μL：45μL，上述试剂盒附带)加入到各孔中。用密封件封闭平板，通过摇动混合溶液，在60℃下孵育60分钟。在冰上充分冷却，剥离密封件，测定570nm的吸光度。通过将样品的吸光度与标准溶液进行比较来计算胶原量。

另外，三维组织体中所占的胶原可以通过其面积比或体积比确定。“通过面积比或体积比确定”是指，例如在使三维组织体中的胶原为能够通过已知的染色方法(例如使用了抗胶原抗体的免疫染色、或马松三色染色)等与其他组织构成物能够区别的状态的基础上，使用肉眼观察、各种显微镜和图像分析软件等，计算在三维组织体整体中所占的胶原的存在区域的比率。在通过面积比确定的情况下，并不限定是通过三维组织体中的怎样的截面或表面来确定面积比，例如在三维组织体为球状体等的情况下，可以通过从其大致中心部通过的剖视图来确定。

例如，在通过面积比确定三维组织体中的胶原的情况下，其面积的比例以上述三维组织体整体的面积为基准为0.01～99％，优选为1～99％，优选为5～90％，优选为7～90％，优选为20～90％，更优选为50～90％。“三维组织体中的胶原”如上所述。在三维组织体包含外源性胶原的情况下，构成上述三维组织体的胶原的面积的比例是指将内源性胶原和外源性胶原合起来的面积的比例。上述胶原的面积的比例例如可以将所得到的三维组织体用马松三色染色，作为蓝色染色的胶原的面积与从三维组织体的大致中心部通过的截面的整体面积的比例来计算。

上述三维组织体在胰蛋白酶的浓度为0.25％、温度为37℃、pH为7.4、反应时间为15分钟的条件下进行胰蛋白酶处理后的残留率优选为70％以上，更优选为80％以上，进一步优选为90％以上。这样的三维组织体在培养中或培养后不易发生由酶引起的分解，是稳定的。上述残留率例如可以根据胰蛋白酶处理前后的三维组织体的质量来计算。

上述三维组织体可以在胶原酶的浓度为0.25％、温度为37℃、pH为7.4、反应时间为15分钟的条件下进行胶原酶处理后的残留率可以为70％以上，更优选为80％以上，进一步优选为90％以上。这样的三维组织体在培养中或培养后不易发生由酶引起的分解，是稳定的。

上述三维组织体的厚度优选为10μm以上，更优选为100μm以上，进一步优选为1000μm以上。这样的三维组织体为更接近生物体组织的结构，适合作为实验动物的替代品和移植材料。三维组织体的厚度的上限没有特别限制，例如可以为10mm以下，可以为3mm以下，可以为2mm以下，可以为1.5mm以下，也可以为1mm以下。

在此，“三维组织体的厚度”在三维组织体为片状或长方体状的情况下，是指与主面垂直的方向上的两端的距离。在上述主面存在凹凸的情况下，厚度是指上述主面的最薄部分的距离。

另外，在三维组织体为球体状的情况下，厚度是指其直径。另外，在三维组织体为椭圆体状的情况下，厚度是指其短径。在三维组织体为大致球体状或大致椭圆体状且表面存在凹凸的情况下，厚度是指从三维组织体的重心通过的直线与上述表面交叉的2点间的距离中的最短的距离。

＜三维组织体的制造方法＞

本实施方式的三维组织体的制造方法具备：第一工序，在水性介质中使上述的含细胞外基质组合物与细胞接触，及第二工序，对上述的含细胞外基质组合物所接触的细胞进行培养。在本实施方式的三维组织体的制造方法中，重要的是，片段化细胞外基质成分与细胞接触(即第一工序)前，片段化细胞外基质成分与化合物接触，化合物键合或吸附于片段化细胞外基质成分。由此，与仅在细胞培养液中添加化合物来对细胞进行培养的情况相比，能够赋予或增强对片段化细胞外基质成分有用的功能。另外，由于化合物键合或吸附于片段化细胞外基质成分，因此还具有能够抑制所使用的化合物的量的效果。

在三维组织体的制造方法中，细胞优选为包含胶原产生细胞的细胞。通过使用包含胶原分泌细胞的细胞，能够得到更稳定且细胞均匀地分布的三维组织体。得到这样的三维组织体的机理的详细情况并不清楚，但推测如下。

在利用了以往的支架的三维组织体的制造方法中，由于向预先准备的支架注入目标细胞，因此难以使细胞均匀地分布到支架的内部。在细胞为包含细胞外基质产生细胞(胶原产生细胞等)的细胞的情况下，首先，细胞粘附于含细胞外基质组合物。之后，细胞自身产生构成细胞外基质成分的蛋白(例如纤维性胶原等胶原)。所产生的蛋白粘附于含细胞外基质组合物，由此作为含细胞外基质组合物间的交联剂发挥作用，在细胞均匀存在的环境下，构成细胞外基质成分的蛋白等的结构化进展。其结果，能够得到更稳定且细胞均匀地分布的三维组织体。但是，上述推测并不是为了限定本发明。

另外，在专利文献1～3中记载的制造方法中，用于制造三维组织体的工序数多，需要1小时左右的作业时间。根据本实施方式的制造方法，能够以较短的作业时间制造三维组织体。此外，根据本实施方式的制造方法，能够简便地制造三维组织体。在专利文献2所记载的制造方法中，为了制造厚度为1mm左右的三维组织体，需要细胞至少为10⁶cells。根据本实施方式的制造方法，能够以较少的细胞数制造厚度为1mm以上的尺寸大的三维组织体。

第一工序中，在水性介质中，使含细胞外基质组合物与细胞接触。在水性介质中，使含细胞外基质组合物与细胞接触的方法没有特别限制。例如，可举出在包含细胞的培养液中加入含细胞外基质组合物的方法、在含细胞外基质组合物中加入水性介质和细胞的方法、或者在预先准备的水性介质中分别加入含细胞外基质组合物和细胞的方法。

第一工序中，可以使用包含胶原产生细胞及除胶原产生细胞以外的其他细胞的细胞。作为胶原产生细胞及除胶原产生细胞以外的其他细胞，可以分别使用上文所述的细胞。通过将胶原产生细胞及除胶原产生细胞以外的其他细胞一起使用来制造三维组织体，能够制造各种模型组织。例如，在使用了NHCF和HUVEC的情况下，能够得到在内部具有毛细血管的三维组织体。在使用了NHCF和大肠癌细胞的情况下，能够得到大肠癌的模型组织。另外，在使用了NHCF和iPS-CM的情况下，能够得到显示心悸搏动的心肌的模型组织。

第一工序中的含细胞外基质组合物的浓度可以根据目标三维组织体的形状、厚度、培养器的尺寸等适当确定。例如，第一工序中的水性介质中的含细胞外基质组合物的浓度可以为0.1～90质量％，也可以为1～30质量％。

第一工序中的含细胞外基质组合物的量相对于1×10⁵cells的细胞可以为0.1～100mg，也可以为1～50mg。

在第一工序中，含细胞外基质组合物与细胞的质量比(含细胞外基质组合物/细胞)优选为1/1～1000/1，更优选为9/1～900/1，进一步优选为10/1～500/1。

在将胶原产生细胞与其他细胞一起使用的情况下，第一工序中的胶原产生细胞的细胞数与其他细胞的比率之比(第一工序中的胶原产生细胞/其他细胞之比)可以为9/1～99/1，可以为50/50～80/20，可以为20/80～50/50，也可以为10/90～50/50。

在第一工序后且第二工序前，可以进一步包含使水性介质中的含细胞外基质组合物和细胞一起沉降的工序。通过进行这样的工序，三维组织体中的含细胞外基质组合物和细胞的分布变得更均匀。作为具体的方法，没有特别限制，例如可举出对包含含细胞外基质组合物和细胞的培养液进行离心操作的方法。

第一工序可以在水性介质中形成细胞层之后进行。即，第一工序可以通过在水性介质中形成细胞层之后使含细胞外基质组合物接触来进行。通过在使细胞层与含细胞外基质组合物接触之前形成，能够制作下层部的细胞密度高的三维组织体。另外，通过在使包含胶原产生细胞的细胞的层与含细胞外基质组合物接触之前形成，能够制作包含胶原产生细胞的细胞的下层部的细胞密度高的三维组织体。根据所使用的细胞的种类(例如主动脉平滑肌细胞)，通过该方法，能够制作更接近生物体的组织。

在第二工序之后，还可以包含使细胞接触并对细胞进行培养的工序作为第三工序。上述细胞与第一工序中使用的细胞可以为同种，也可以为不同种。例如，在第一工序中使用的细胞包含除胶原产生细胞以外的细胞的情况下，第三工序中使用的细胞可以包含胶原产生细胞。另外，例如，在第一工序中使用的细胞包含胶原产生细胞的情况下，第三工序中使用的细胞可以包含除胶原产生细胞以外的细胞。第一工序中使用的细胞和第三工序中使用的细胞这两者可以包含胶原产生细胞，第一工序中使用的细胞和第三工序中使用的细胞这两者可以包含除胶原产生细胞以外的细胞。通过第三工序，能够制作双层结构的三维组织体。例如，在使用主动脉平滑肌细胞和血管内皮细胞的情况、以及使用了人皮肤来源的成纤维细胞和人表皮角化细胞的情况下，通过该方法，能够制作更接近生物体的组织。另外，例如，在使用了人牙龈成纤维细胞和牙龈上皮细胞的情况下，通过该方法，能够制作没有组织收缩和组织破裂的双层结构的三维组织体。

对含细胞外基质组合所物接触过的细胞进行培养的方法没有特别限制，可以根据要培养的细胞的种类以适当的培养方法进行。例如，培养温度可以为20℃～40℃，也可以为30℃～37℃。培养基的pH可以为6～8、也可以为7.2～7.4。培养时间可以为1天～2周，也可以为1周～2周。

培养基没有特别限制，可以根据要培养的细胞的种类选择合适的培养基。作为培养基，例如可举出Eagle’s MEM培养基、DMEM、Modified Eagle培养基(MEM)、MinimumEssential培养基、RPMI、及GlutaMax培养基等。培养基可以是添加有血清的培养基，也可以是无血清培养基。此外，液体培养基也可以是将两种以上的培养基混合而成的混合培养基。

第二工序中的培养基中的细胞密度可以根据目标三维组织体的形状、厚度、培养器的尺寸等适当确定。例如，第二工序中的培养基中的细胞密度可以为1～10⁸cells/ml，也可以为10³～10⁷cells/ml。另外，第二工序中的培养基中的细胞密度可以与第一工序中的水性介质中的细胞密度相同。

上述三维组织体在培养中的收缩率优选为20％以下，更优选为15％以下，进一步优选为10％以下。上述收缩率例如可以通过以下的式子算出。式中L1表示培养后第1天的三维组织体的最长部分的长度，L3表示培养后第3天的三维组织体中的对应部分的长度。

收缩率(％)＝{(L1-L3)/L1}×100

通过上述的制造方法，例如可以制造包含细胞及细胞外基质成分的三维组织体，其中，胶原的含有率以上述三维组织体为基准为10质量％～90质量％。

实施例

以下，基于实施例对本发明具体地进行说明，但本发明并不限定于这些实施例。

＜试验例1：经解纤的胶原成分的制作＞

将日本Ham株式会社制的猪皮来源的I型胶原冻结干燥体以胶原含量达到1质量％的方式悬浮于超纯水中。使用超声波式均化器，在4℃的条件下重复10次20秒的循环，将悬浮液均化。将得到的液体用孔径为35μm的过滤器过滤，得到经解纤的胶原成分(sCMF)。

sCMF的平均长度(长度)为14.8±8.2μm(N＝20)。

＜试验例2：经解纤的胶原成分(sCMF)与生物体分子的吸附＞

准备以下化合物1～4。

化合物1：氨基荧光素标记透明质酸钠(PG Research，FAHA-H1)

化合物2：氨基荧光素标记硫酸乙酰肝素钠(PG Research，FAHS-P1)

化合物3：氨基荧光素标记硫酸软骨素A钠(PG Research，FACS-A1)

化合物4：罗丹明标记纤连蛋白(Cytoskelton，Inc.，Rhodamine fibronectin)

用磷酸缓冲生理盐水(PBS)稀释化合物1～4，制备以0.04mg/ml的浓度含有化合物1～4中的任一种的溶液。

向1mg sCMF中加入所制备的溶液1mL，得到混合液。将该混合液在室温(15～25℃)、20rpm的条件下搅拌60分钟。搅拌结束后，对混合液进行离心分离，除去上清液后，用PBS清洗，制作试验用样品。将使用化合物1～4中的任一种制作的试验液的观察结果示于图1。

通过相位差(Ph)观察和荧光观察，确认了在分别使用氨基荧光素标记硫酸乙酰肝素钠、氨基荧光素标记硫酸软骨素A钠、及罗丹明标记纤连蛋白制作的试验用样品中，sCMF与化合物键合、或吸附。另一方面，在使用氨基荧光素标记透明质酸钠制作的试验用样品中，未确认到sCMF与化合物键合或吸附。

＜试验例3：生物体分子的吸附率评价＞

准备将化合物1(HA)、化合物2(CS)及化合物3(HS)分别以达到0.04mg/ml的浓度的方式用PBS稀释而制备的溶液(分别称为溶液1～3)。

用PBS稀释溶液1～3，以使化合物1～3的浓度达到0.1mg/ml、0.05mg/ml、0.025mg/ml、或0.0125mg/ml的方式准备标准曲线制作用的溶液。使用分光荧光光度计(日本分光，FP-8500)测定标准曲线制作用的溶液的荧光强度，制作标准曲线。

将1mg sCMF加入到1.5ml样品管(WATSON，131-7155C)中，加入1ml溶液1～3中的任一个，使用ROTATOR(TAITEC，RT-50)，在室温下以20rpm的速度搅拌1小时。将得到的混合液通过离心分离器(eppendorf，minispin)在3500rpm、5分钟的条件下进行离心，利用分光荧光光度计测定上清液200μL的荧光强度。将得到的结果对照于标准曲线，由此算出上清液的荧光试剂的浓度。在将该值设为X时，通过由(0.04-X)/0.04×100表示的式子计算吸附率。将吸附率的测定结果示于表1。

表1

＜试验例4：吸附稳定性评价＞

将1mg sCMF加入到1.5ml样品管(WATSON，131-7155C)中，加入1ml含化合物2的溶液(制作8管)。使用ROTATOR(TAITEC，RT-50)，在室温下以20rpm的速度搅拌1小时。利用离心分离器(eppendorf，minispin)以3500rpm离心5分钟，利用分光荧光光度计(日本分光，FP-8500)测定各上清液的200μl的荧光强度。将得到的荧光强度对照于标准曲线，算出上清液的荧光试剂的浓度。将其记为X。将各上清液吸出，加入1ml PBS。在5、20、40、60、120、300、1440或5760分钟后，逐个用离心分离机以3500rpm离心5分钟，利用分光荧光光度计测定各上清液的200μl的荧光强度。将得到的荧光强度对照于标准曲线，算出上清液的荧光试剂的浓度。将其记为Y。根据吸附稳定性指标：(X-Y)/X×100的式子评价吸附稳定性。图2是表示5760分钟后的试验结果的显微镜照片。

表2

如表2所示，显示了即使在经过4天(5760分钟)后，化合物2仍键合和/或吸附于sCMF。

＜试验例5：使用了sCMF-FN的三维组织体的评价1＞

在5ml的0.04％的纤连蛋白(SIGMA，F2006-5MG)的50mM tris-HCl溶液中加入5mg的sCMF，使用ROTATOR(TAITEC，RT-50)在室温下以20rpm的速度搅拌1小时。搅拌在即将与细胞混合之前结束上述搅拌时间。用离心分离器(eppendorf，minispin)以3500rpm的条件离心5分钟。将上清液吸出，加入300μL的培养基。将通过这些操作制作的sCMF称为sCMF-FN。

将1.0×10⁶cells的NHDF(Lonza，CC-2509)和5.0×10⁵cells的HUVEC(Lonza，C2517A)混合到上述sCMF-FN中，接种于24孔插入件(costar，3470-clear)中。

将其以1100g离心分离15分钟，使sCMF-FN和细胞沉降，在1mL的混合培养基(DMEM(Nacalai Tesque，08489-45)50％/EBM-2(Nacalai Tesque，Lonza，CC-3202)50％)中培养1天。将由此得到的培养物转移到6孔平板(IWAKI、3810-006)中，在12mL的混合培养基中培养6天。使用CD31(Dako，M0823)和Alexa 647(invitrogen，A21235)进行免疫染色，使用共聚焦定量图像细胞仪CQ(YOKOGAWA)进行荧光观察，使用图像分析软件(Image J，NIH)根据MIP图像测定毛细血管的直径。毛细血管的直径的测定不是自动的，而是通过手动对着直径画线，测定其长度。代替sCMF-FN，使用sCMF，以同样的步骤进行实验。将所制作的三维组织体的观察结果示于图5。通过使用sCMF-FN制作的三维组织体，与使用sCMF制作的三维组织体相比，能够得到形成有更粗的血管网的三维组织体。

＜试验例6：使用了sCMF-FN的三维组织体的评价2＞

与试验例5同样地制作三维组织体。使用三维组织体，通过株式会社AppliedMedical Service分别制作CD31的免疫染色和甲苯胺蓝染色的切片。

使用显微镜拍摄所制作的切片图像。利用图像分析软件(Image J，NIH)以N＝20测定甲苯胺蓝(TB)染色的切片中染成蓝色的核的长径。CD31的免疫染色切片中，根据整体的图像测定CD31免疫染色部分(茶色)为圆形、且内部为空洞(白色)的图形的数量。将所制作的三维组织体的观察结果示于图6及图8。图7表示三维组织体中的核的长度的测定结果。通过使用sCMF-FN制作的三维组织体，与使用sCMF制作的三维组织体相比，得到了形成有更粗的管腔的三维组织体。这是通过使有助于细胞间的粘附性的纤连蛋白混合这样的方法无法预期的效果，是通过纤连蛋白键合或吸附于解纤细胞外基质而发挥的预料不到的效果。