一种平颏海蛇来源内毒素中和肽及其编码序列与应用
阅读说明：本技术 一种平颏海蛇来源内毒素中和肽及其编码序列与应用 (Neutralizing peptide of endotoxin from sea snake with flat chin, coding sequence and application thereof ) 是由 张黎明 王博 柳国艳 贺茜 王倩倩 王蓓蕾 王超 邹帅军 张培培 于 2021-07-28 设计创作，主要内容包括：本发明涉及海洋生物医药领域,具体是一种新型平颏海蛇来源内毒素中和肽及其编码序列与应用。本发明获得的内毒素中和肽Hc-ENP有显著的LPS拮抗能力,炎性因子释放与炎性相关酶表达水平测定实验中,Hc-ENP能够显著抑制炎性因子的释放,降低炎性相关酶表达水平,发挥抗炎效应。并且,本发明获得的内毒素中和肽Hc-ENP能够有效拮抗不同来源LPS的致炎效应,有广谱的抗炎效果。本发明中涉及的平颏海蛇来源内毒素中和肽Hc-ENP在抗革兰阴性菌药物、抗炎药物等方面有很大的应用价值。(The invention relates to the field of marine biomedicine, in particular to a novel neutralizing peptide for endotoxin from sea snakes with flat chin, a coding sequence and application thereof. The endotoxin neutralizing peptide Hc-ENP obtained by the invention has obvious LPS antagonistic capability, and in the test for measuring the release of inflammatory factors and the expression level of inflammatory related enzymes, Hc-ENP can obviously inhibit the release of inflammatory factors, reduce the expression level of inflammatory related enzymes and play a role in anti-inflammatory effect. In addition, the endotoxin neutralizing peptide Hc-ENP obtained by the invention can effectively antagonize the inflammatory effect of LPS from different sources, and has broad-spectrum anti-inflammatory effect. The neutralizing peptide Hc-ENP of endotoxin from sea snake with flat chin has great application value in the aspects of gram negative bacteria resisting medicine, anti-inflammatory medicine, etc.)
技术领域
本发明属于海洋生物医药领域，具体涉及一种新型平颏海蛇来源内毒素中和肽及其编码序列与应用。
背景技术
海蛇属蛇目眼镜蛇科海蛇亚科，是一类分布广泛、种类丰富的有毒海洋生物。已有大量研究表明，海蛇毒中富含多种生物活性物质，包括海蛇毒素蛋白和一些活性强烈、具有良好开发前景的新功能多肽和蛋白。我国海域优势种海蛇为平颏海蛇和青环海蛇，自古以来，中医中就有利用海蛇毒抗炎和抗菌的应用，而前期海蛇毒腺转录组结果表明，平颏海蛇毒腺中含有很多与炎性通路相关的组分，尽管如此，目前对海蛇毒中抗炎和抗菌活性肽的组成、序列信息、表达水平等尚未有系统的了解。
内毒素LPS是革兰阴性菌细胞壁的重要组成部分，可分为类脂A、O抗原和核心多糖三部分。LPS各部分在不同菌株、甚至不同生长环境下的同种菌株之间都有差异，O抗原是LPS中最易变化的部分，而类脂A是结构变化最小的部分，在不同菌株之间较为保守，同时，类脂A也是LPS最重要的致病成分。
内毒素LPS与革兰阴性菌感染后的全身性炎症反应关系密切，是一系列炎症反应重要的刺激因子。在革兰阴性菌被杀灭或裂解后，细胞壁上的LPS会大量释放到周围介质中，高浓度的LPS可引起机体发热、败血症、感染性休克等，最终诱发机体多器官功能衰竭而导致死亡。因此，探寻可特异性结合LPS的活性分子是目前抗革兰阴性菌感染的重要思路。根据文献报道，LPS主要通过激活MAPK、NF-κB、TLRs等信号通路来诱发炎症反应，前期的平颏海蛇毒腺转录组结果显示，在这3条炎性通路中均有大量的unigenes注释，因此我们推测平颏海蛇毒腺中存在影响LPS促炎作用的活性分子，以LPS为靶分子在海蛇毒腺噬菌体展示库中淘选能与之结合的活性分子是可行的。
目前，国内外尚无对平颏海蛇来源内毒素中和肽的研究报道，本发明中涉及的平颏海蛇来源内毒素中和肽是我们首次发现，且是平颏海蛇抗炎和抗菌系统的重要活性组分。该多肽在抗革兰阴性菌感染、抗内毒素炎症的研究中具有良好的应用前景。
发明内容
本发明目的在于提供一种新型平颏海蛇来源内毒素中和肽及其编码序列与应用。本发明通过构建平颏海蛇毒腺噬菌体多肽展示库，以内毒素(LPS)为靶分子，对该噬菌体展示库进行淘选，通过测定和分析，获得了一条能结合内毒素的21肽即命名为Hc-ENP。将该海蛇来源21肽合成后，活性检测发现，其具有明确的内毒素中和能力。本发明的另一目的在于提供上述海蛇来源内毒素中和肽在制备抗革兰阴性菌感染、抗炎药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种平颏海蛇来源的内毒素中和肽，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示。
所述的平颏海蛇来源内毒素中和肽是首次发现的具有明显抗炎活性的海蛇来源内毒素中和肽，该多肽理论分子量2523.15，理论等电点10.76，富含碱性氨基酸，在中性环境中呈现明显的正电荷。
本发明还提供了一种如上所述的平颏海蛇来源内毒素中和肽的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1：
5’-GGTGTTAAAGCTGCGAAGAAATTTAAAATTAACATCCTGAAAAAACTGTTCAACATCTACTGG-3’；
SEQ ID NO.2：
Gly-Val-Lys-Ala-Ala-Lys-Lys-Phe-Lys-Ile-Asn-Ile-Leu-Lys-Lys-Leu-Phe-Asn-Ile-Tyr-Trp(单字母：GVKAAKKFKINILKKLFNIYW)。
本发明利用噬菌体展示技术，在平颏海蛇毒腺m13噬菌体展示库中淘选获得了一条来源于海蛇毒腺的21肽，其cDNA序列如序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其编码蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。该多肽理论分子量2523.15，理论等电点10.76，富含碱性氨基酸，在中性环境中呈现明显的正电荷，该多肽序列是第一次在海蛇中发现。
本发明选择的平颏海蛇(Hydrophis curtus)采集自海南岛周边海域，并经毒腺中标志基因测序鉴定。
平颏海蛇毒腺M13噬菌体多肽展示库的构建主要包括如下步骤：
(1)分离平颏海蛇毒腺，提取总RNA，逆转录合成双链cDNA，酶切后去除小片段，然后将其连接到经过改造的M13噬菌粒载体pFJ；
(2)将上述重组质粒转化到宿主菌E.coli TG1中，涂布于氨苄抗性平板培养过夜，次日刮下混匀后，加入15％终浓度的甘油，分装后冻存于-80℃，此即为转化有重组噬菌粒载体的TG1甘油菌文库；
(3)将上述一定体积的甘油菌文库接种于液体培养基，培养至OD600＝0.5，加入适量体积M13KO7辅助噬菌体感染扩增，过夜培养后，菌液上清中获得的噬菌体分子即为平颏海蛇毒腺M13噬菌体多肽展示文库。
本发明以LPS为靶分子，对上述噬菌体多肽展示库进行淘选，主要步骤如下：
(1)包被液(甲醇/乙醇/氯仿/NaHCO3/Na2CO3混合溶液)稀释LPS至终浓度100μg/mL，免疫管中加入1mL LPS溶液，4℃过夜包被；
(2)免疫管封闭后，加入稀释后的平颏海蛇毒腺M13噬菌体多肽展示文库孵育；
(3)免疫管漂洗后，加入适量洗脱缓冲液，室温孵育后，将洗脱液转移至新的EP管，加入1/5体积的中和缓冲液，保存备用；
(4)将洗脱后的噬菌体分子加入对数生长期的TG1，感染后涂布于氨苄抗性平板培养过夜；
(5)次日刮下混匀后，加入适量体积M13KO7辅助噬菌体感染扩增，过夜培养后，将上清中所得噬菌体分子作为新一轮噬菌体多肽淘选文库，重复前述淘选步骤。
通过4轮淘选，在平颏海蛇毒腺M13噬菌体展示库中淘选获得了一条21肽，其cDNA序列如序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其编码蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ IDNO.2所示。该多肽的cDNA序列和氨基酸序列均为首次在海蛇类毒腺中发现。
本发明进一步通过化学方式合成了该21肽，经HPLC纯化后鉴定，纯度超过95％，质谱鉴定实际分子量与理论值相符。
本发明的第二方面，提供一种如上所述的内毒素中和肽在制备抗革兰阴性菌感染药物中的应用。
本发明还提供所述的内毒素中和肽的cDNA序列在制备抗革兰阴性菌感染药物中的应用。
本发明的第三方面，提供一种如上所述的内毒素中和肽在制备抗炎药物中的应用。
进一步的，所述的抗炎药物是抗内毒素炎症药物。所述的内毒素中和肽能够显著抑制TNF-α、IL-6、IL-1β、NO等炎性因子的释放，降低NOS、COX2等炎性相关酶表达水平，发挥抗炎效应。
进一步的，所述的内毒素中和肽显著抑制LPS刺激引起的细胞炎性因子水平升高。
进一步的，所述的内毒素中和肽抑制细胞内iNOS和COX2表达升高。随着Hc-ENP浓度的增加，细胞中iNOS、COX2蛋白表达量逐渐降低，iNOS mRNA、COX2 mRNA水平也逐渐下降，当Hc-ENP浓度达到10μg/mL时，对iNOS、COX2蛋白表达的抑制率超过90％。
进一步的，所述的内毒素中和肽抑制细胞内NOS活力。随着Hc-ENP浓度的增加，细胞NOS活力，NO释放量逐渐下降，当Hc-ENP浓度达到10μg/mL时，对细胞NOS活力抑制率达81％，NO释放量降低92％。
进一步的，所述的内毒素中和肽有效拮抗不同来源LPS的致炎效应，有广谱的抗炎效果。在不同来源LPS处理组中，10μg/mL Hc-ENP均可显著降低细胞炎性因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)和NO的释放量，差异有统计学意义(P<0.05)。
进一步的，所述的不同来源LPS来自E.coli O55:B5(大肠杆菌)、Pseudomonasaeroginosa(铜绿假单胞菌)、Klebsiella pneumoniae(肺炎克雷伯杆菌)、Salmonellatyphimurium(伤寒沙门菌)。
本发明还提供所述的内毒素中和肽的cDNA序列在制备抗炎药物中的应用。
本发明优点在于：
1、本发明获得的内毒素中和肽Hc-ENP能高亲和力结合LPS，呈现“快结合、慢解离”的结合解离模式，且其具有显著的LPS拮抗能力。在炎性因子释放与炎性相关酶表达水平测定实验中，Hc-ENP能够显著抑制TNF-α、IL-6、IL-1β、NO等炎性因子的释放，降低NOS、COX2等炎性相关酶表达水平，发挥抗炎效应。
2、本发明获得的内毒素中和肽Hc-ENP能够有效拮抗不同来源LPS的致炎效应，有广谱的抗炎效果。
3、本发明首次通过平颏海蛇毒腺噬菌体多肽展示库淘选获得了一种平颏海蛇内毒素中和肽，并发现其具有显著的抗炎活性，在制备抗革兰阴性菌药物、抗炎药物等方面有很大的应用价值。
附图说明
图1为本发明中海蛇来源21肽的相关结构参数；其中：(A)为多肽的二级结构预测图，主要为α螺旋；(B)为多肽的亲疏水性分析曲线图。
图2中的(A)为本发明中海蛇来源21肽化学合成后经HPLC纯化后的谱图，(B)为多肽经纯化后的质谱分析图。
图3为本发明中海蛇来源21肽与LPS的结合动力学常数测定曲线和参数值，计算可得，多肽与LPS的结合力常数KD值为1.46×10-8M；根据此曲线可知，多肽与LPS呈现“快结合、慢解离”的结合解离模式。
图4为本发明中海蛇来源21肽对内毒素中和效果的柱状图，随着浓度增加，中和能力呈线性升高。
图5为本发明中内毒素中和肽Hc-ENP对细胞的毒性测定，Hc-ENP作用两种细胞24h后，细胞存活率均高于80％。
图6为本发明中内毒素中和肽Hc-ENP对细胞炎性因子的抑制效应曲线；其中：(A)TNF-αmRNA；(B)IL-6mRNA；(C)IL-βmRNA；(D)TNF-α含量；(E)IL-6含量；(F)IL-β含量。
图7为本发明中内毒素中和肽Hc-ENP对细胞内iNOS和COX2表达水平的抑制作用图；其中：(A)细胞内iNOS蛋白表达水平；(B)细胞内iNOS mRNA水平；(C)COX2蛋白表达水平；(D)COX2 mRNA水平。
图8为本发明中内毒素中和肽Hc-ENP对细胞内NOS活力和NO释放量的抑制作用图；其中：(A)细胞NO释放量；(B和C)细胞内NOS活力。
图9为本发明中内毒素中和肽Hc-ENP对不同来源LPS致炎作用的抑制效果图。其中：(A)TNF-α含量；(B)IL-6含量；(C)IL-β含量；(D)NO含量；图中LPS①-④分别来源于O55:B5大肠杆菌，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeroginosa)，肺炎克雷伯杆菌(Klebsiellapneumoniae)，伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。但下列实施例不应看作对本发明范围的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1：平颏海蛇来源21肽的生物信息学分析
根据平颏海蛇来源21肽的基因编码序列进行生物信息学分析，通过Expasy(https://web.expasy.org/protparam/)预测多肽相关理化性质为：①氨基酸数：21个；②理论相对分子质量：2523.15；③理论等电点：10.76；④碱性氨基酸：6个；⑤稳定性系数：30.51。
通过Expasy(https://web.expasy.org/protscale/)进行多肽的亲疏水性分析，通过PSIPRED软件预测多肽的二级结构，图1中的A图为多肽的二级结构预测图，可以看到，多肽的二级结构主要为α-螺旋；从图1中的B图可以看到，多肽的氨基端呈现亲水性，羧基端呈现疏水性。
实施例2：多肽化学合成、纯化和质谱鉴定
委托生工生物工程股份有限公司进行化学合成，合成后经HPLC纯化，对21肽进行质谱分析，从图2上看，合成的多肽纯度大于95％，符合要求实际分子量为2522.75，与理论值2523.15相符，结构正确，可用于进一步效应研究。
实施例3：多肽与LPS的结合能力测定
利用生物膜干涉技术(Bio-Layer Interferometry，BLI)检测合成多肽与LPS的结合能力。本次使用的BLI探针为链霉亲和素探针(SA Biosensor，Pall)，基本原理为通过SA捕获biotin的方式，将生物素标记的21-肽固定到SA探针，然后与溶液中不同浓度的LPS(25/50/100/200/400nM)进行反应，测定Kon和Koff，得到抗体亲和力数据(KD＝Koff/Kon)。如图3所示，结合解离曲线由下至上分别为不同浓度LPS(25/50/100/200/400nM)；经计算可得(表1)，KD值为1.46×10-8M，表明该多肽与LPS具有较强的结合能力，且呈现“快结合，慢解离”的结合-解离模式。
表1
KD(M)
KD Error
kon(1/ms)
kon Error
kdis(1/s)
kdis Error
1.46E-08
3.32E-10
1.24E+05
1.67E+03
1.81E-03
3.31E-05
实施例4：多肽对内毒素的中和效果检测
进一步，使用Toxin SensorTM显色LAL内毒素测定试剂盒来检测合成多肽对内毒素的中和能力。首先配制不同浓度梯度的多肽溶液，加入到去内毒素离心管中(20μL)，向每个管中加入等体积试剂盒提供的LPS溶液(稀释后0.5EU/mL)，将该混合溶液在37℃下恒温孵育30min，使多肽与LPS充分结合；向每个管中加入20μL LAL试剂，将其在37℃下孵育10min；再向每个管中加入20μL发色底物试剂，在37℃下温育6min；之后，依次加入100μL的显色稳定剂1、2、3，显色后分加到96孔板中于545nm处测定吸收光值。
％LPS中和能力＝(Ablank—Asample)/Ablank×100(blank组为纯内毒素组)。从图4可以看到，在1-40μg/mL的浓度范围内，随着多肽浓度的增加，LPS中和率逐渐升高，提示海蛇来源的21肽具有内毒素中和能力。
实施例5：内毒素中和肽(Hc-ENP)细胞毒性检测
将RAW264.7、L929细胞按照1×104细胞/孔接种于96孔板中，过夜培养。配制1mg/mL Hc-ENP母液，用完全培养基稀释Hc-ENP，使其终浓度分别为0、5、10、20、40μg/mL，同时设置空白孔(无细胞)和对照孔(不加样品)，继续培养24h后按照CCK-8细胞毒性检测试剂盒要求检测细胞活性。从图5上看，随着Hc-ENP浓度增加，RAW264.7和L929细胞24h的存活率均高于80％，表明Hc-ENP在0-40μg/mL浓度下对两种细胞均无明显的细胞毒性。
实施例6：Hc-ENP抑制细胞内炎性因子水平升高检测
将RAW264.7细胞接种于培养皿中，待细胞生长至80-90％时换液，配制不同浓度Hc-ENP(0、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL)分别与100ng/mL LPS混合，加入到各孔中，继续培养一定时间后，通过荧光定量PCR和ELISA实验分别检测不同处理组细胞炎性因子水平。从图6上看，与LPS模型组相比，随着Hc-ENP浓度的增加，RAW 264.7细胞中TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA水平逐渐下降，细胞上清中TNF-α、IL-6、IL-1β炎性因子的浓度也逐渐降低，该趋势具有剂量依赖性，当Hc-ENP浓度为10μg/mL时，对细胞炎性因子的抑制率超过90％。这一结果表明，Hc-ENP能显著抑制LPS刺激引起的细胞炎性因子水平升高。
实施例7：Hc-ENP对细胞内iNOS和COX2表达升高的抑制作用
将RAW264.7细胞接种于培养皿中，待细胞生长至80-90％时换液，配制不同浓度Hc-ENP(0、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL)分别与100ng/mL LPS混合，加入到各孔中，继续培养一定时间后，收集细胞，检测iNOS、COX2蛋白水平。同时按照前述步骤检测细胞iNOS、COX2 mRNA水平。从图7上看，相较于对照组，LPS模型组细胞中iNOS、COX2蛋白表达量显著升高。随着Hc-ENP浓度的增加，细胞中iNOS、COX2蛋白表达量逐渐降低，iNOS mRNA、COX2 mRNA水平也逐渐下降，当Hc-ENP浓度达到10μg/mL时，对iNOS、COX2蛋白表达的抑制率超过90％。
实施例8：Hc-ENP对细胞内NOS活力的抑制作用
将RAW264.7细胞接种于培养皿中，待细胞生长至80-90％时换液，配制不同浓度Hc-ENP分别与100ng/mL LPS混合，加入到各孔中；继续培养8h后，弃培养基，根据前述NOS活力检测试剂盒要求依次加入各成分，反应30min后荧光酶标仪测定荧光强度，计算各组细胞中NOS的相对活力。同样方法处理细胞后，用荧光显微镜观察细胞内荧光情况。如图8所示，相较于对照组，LPS模型组细胞NOS活力和NO释放量显著升高。随着Hc-ENP浓度的增加，细胞NOS活力，NO释放量逐渐下降，当Hc-ENP浓度达到10μg/mL时，对细胞NOS活力抑制率达81％，NO释放量降低92％。
实施例9：Hc-ENP对不同来源LPS的拮抗能力测定
本实施案例中，前期淘选与效应实验均使用来源于E.coli O111:B4的LPS，为进一步探究Hc-ENP对其它来源LPS致炎作用的拮抗效果，选择目前市售的4种革兰阴性菌来源的LPS，分别为E.coli O55:B5(大肠杆菌)、Pseudomonas aeroginosa(铜绿假单胞菌)、Klebsiella pneumoniae(肺炎克雷白杆菌)、Salmonella typhimurium(伤寒沙门菌)。通过检测LPS刺激后，RAW264.7细胞炎性因子和NO的释放量来评价Hc-ENP的拮抗效果。具体方法如下：
配制4种LPS母液(1mg/mL)，用完全培养基稀释至终浓度为100ng/mL备用。细胞培养步骤同前，将10μg/mL Hc-ENP分别与4种LPS混合，加入到各孔中，继续培养一定时间后，吸取上清，分别检测上清中各炎性因子的浓度。从图9上看，在不同来源LPS处理组中，10μg/mL Hc-ENP均可显著降低细胞炎性因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)和NO的释放量，差异有统计学意义(P<0.05)。该结果表明，以来源于E.coli O111:B4的LPS为靶分子淘选获得的Hc-ENP，对不同来源的LPS均有明确的拮抗作用。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
序列表
<110> 中国人民解放军海军特色医学中心
<120> 一种平颏海蛇来源内毒素中和肽及其编码序列与应用
<130> /
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
ggtgttaaag ctgcgaagaa atttaaaatt aacatcctga aaaaactgtt caacatctac 60
tgg 63
<210> 2
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
Gly Val Lys Ala Ala Lys Lys Phe Lys Ile Asn Ile Leu Lys Lys Leu
1 5 10 15
Phe Asn Ile Tyr Trp
20