尖吻蝮蛇抗凝血因子xi多肽及其应用
阅读说明：本技术 尖吻蝮蛇抗凝血因子xi多肽及其应用 (Agkistrodon acutus anticoagulant factor XI polypeptide and application thereof ) 是由 孔毅 郑益政 刘云杨 李正阳 蒋帅 贾志萍 于 2021-09-22 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物化学中的多肽领域,涉及尖吻蝮蛇抗凝血因子XI多肽及其应用,该多肽由尖吻蝮蛇(Deinagkistrodon acutus)蛇毒腺转录组数据库中筛选得到一段Kunitz型多肽序列,对其进行构建表达得到具有抗血栓活性的多肽,其可以用于制备作为抗血栓药物的应用。(The invention belongs to the field of polypeptides in biochemistry, and relates to agkistrodon acutus anticoagulant factor XI polypeptide and application thereof.)
技术领域
本发明属于生物化学中的多肽药物技术领域，涉及由尖吻蝮蛇(Deinagkistrodonacutus)蛇毒腺转录组数据库中筛选得到一段Kunitz型多肽序列，对其进行构建表达得到具有抗血栓活性的多肽，尤其涉及该多肽的制备方法以及作为抗血栓药物的应用。
背景技术
随着全球人口老龄化及人们的不良生活习惯，血栓性疾病已成为危害人类健康的常见疾病，心脑血管疾病的发病率和死亡率逐年上升。传统抗栓药物如肝素或华法林在临床应用中虽具有良好的抗栓效果，但常伴有出血等不良反应。因此，研发出血风险小的抗血栓药物具有非常重要的价值。
研究表明，凝血因子XI(factorXI,FXI)严重缺乏的患者患缺血性中风和深静脉血栓的风险相对较低，且一般无自发性出血。因此，以FXI为靶点研发安全有效且出血风险低的抗栓药物成为目前研发热点。
尖吻蝮蛇发现于中国东南部，是一种医学上有重要研究意义的蛇，它的毒液由多种生物活性蛋白和多肽组成，主要引起受害者的凝血功能障碍，导致组织损伤、水肿、坏死、止血失衡、出血和急性肾功能衰竭。其中所含的抗凝血生物活性蛋白如MSP(J.Huanget.al,2019)，Pt-A(Glu-Asn-Trp)(S.S.Tang et.al,2013)，Pt-B(Glu-Gln-Trp)(Ding Bet.al,2015)，ACH-11(Chen M et.al,2015)，DAA-8(Kong Y et.al,2018)，SLPC(Jin H Aet.al,2021)已被进行报道及研究。未发现有来源于尖吻蝮蛇的抑制凝血因子XI的多肽。
发明内容
本发明目的在于提供一种全新的抑制凝血因子XI的多肽。
技术方案
一种具有抗血栓活性的多肽及其制备方法与应用。
该多肽具有较强的抗血栓活性，具有治疗血栓性疾病的价值。该多肽来源于尖吻蝮蛇(Deinagkistrodon acutus)蛇毒腺转录组信息，命名为DAKS1-10，对其进行构建表达得到目的多肽。
本发明所提供的DAKS1-10的氨基酸序列为：
所述的多肽在制备抗血栓药物中的应用。
本发明提供的多肽DAKS1，经测试对凝血因子XI有较强抑制活性，IC50为21.92±0.73nM。
本发明提供的多肽DAKS1，经测试可剂量依赖性的延长三氯化铁诱导的小鼠颈动脉血栓形成时间。
本发明提供的多肽DAKS1，经测试在2.6mg/kg剂量下对MCAO模型小鼠大脑损伤起保护作用。
本发明提供的多肽DAKS1，经测试在3.25mg/kg和6.5mg/kg剂量下没有出血风险。
有益效果
1、本发明从尖吻蝮蛇毒腺转录组数据库中筛选得到一段Kunitz型多肽序列，命名为DAKS1，为全新序列，对其进行克隆表达，
体外药效实验证实：
(1)DAKS1对凝血因子XI有较强抑制活性，IC50为21.92±0.73nM；
(2)该多肽DAKS1剂量依赖性的延长APTT(活化部分凝血活酶时间)，对PT(凝血酶原时间)无影响。
动物体内实验证实：
(1)该多肽DAKS1可剂量依赖性的延长三氯化铁诱导的小鼠颈动脉血栓形成时间，
(2)对MCAO模型小鼠大脑损伤起保护作用；
(3)该多肽经小鼠断尾出血实验，与生理盐水组比，DAKS1在3.25mg/kg和6.5mg/kg剂量下没有明显出血风险。
总之，本发明多肽DAKS1具有抗凝血作用，同时在一定剂量下无出血风险，可以用于脑损伤(如中风，脑中卒)等疾病预防与治疗。具有安全有效等特点，适合于抗血栓药物研究与开发。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明的发明范围。
图1为DAKS1经纯化后电泳图；
图2为DAKS1对凝血因子XI的IC50图，a为不同浓度的405nm的吸收值；b为抑制率。
具体实施方式
实施例1：DAKS系列多肽的发现
取五步蛇毒液腺，使用磁珠富集mRNA，进行片段化，随机引物合成cDNA第一链以及第二链，使用QIAQuickPCR试剂盒纯化。琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，PCR扩增，完成文库构建。使用Illumina Hiseq 4000测序。使用Trinity(2.4.0版)进行转录组无参de novo分析。Blast注释和Pfam分析，以“Kunitz”为关键词搜索得到10条序列，命名为DAKS 1-DAKS10。序列信息如下：
实施例2：DAKS系列多肽对凝血因子XI的抑制作用
重组质粒pPIC9k/DAKS构建：采用无缝克隆(克隆位点NotI)将DAKS序列克隆到pPIC9k中，使用SacI线性化后电转入毕赤酵母GS115中，经PCR和测序鉴定阳性菌落，挑取阳性菌落到生长培养基BMGY中，28.5℃，220r/min振荡培养，当菌液OD600在4-6左右时，4000r/min，离心5min，将菌体转入表达培养基BMMY中，加入终浓度1％甲醇诱导，72h后离心收上清，经纯化得到DAKS目的蛋白。测DAKS系列多肽对凝血因子XIa的抑制活性，吸取100μLFXIa(1nM)与50μL DAKS(1-10)于96孔板中混合均匀，37℃孵育1h，加入50μL底物(FXIa发色底物为S2366，终浓度为0.25mM，在405nm波长下持续检测1h，每分钟扫描一次。阴性对照：50μLTBS-BSA缓冲液+100μLHFXIa+50μL底物，空白对照：50μL样品+100μLTBS-BSA缓冲液+50μL底物(所有孔均设置复孔)。绘制吸光度值-反应时间曲线，曲线的斜率即为酶促反应的速度V，阴性反应速度V0，样品反应速度Vi，抑制率＝(V0-Vi)/V0×100％。
结论：多肽DAKS1对凝血因子XIa的抑制活性最强。
实施例2：本发明提供的多肽DAKS1的克隆表达及纯化
重组质粒pPIC9k/DAKS1构建：采用无缝克隆(克隆位点NotI)将DAKS1序列克隆到pPIC9k中，使用SacI线性化后电转入毕赤酵母GS115中，经PCR和测序鉴定阳性菌落，挑取阳性菌落到生长培养基BMGY中，28.5℃，220r/min振荡培养，当菌液OD600在4-6左右时，4000r/min，离心5min，将菌体转入表达培养基BMMY中，加入终浓度1％甲醇诱导，72h后离心收上清，经纯化得到目的蛋白。SDS-PAGE电泳分析显示，重组DAKS1蛋白获得高效表达，DAKS1蛋白为6.5kDa，与预期重组蛋白的大小一致。
实施例3：本发明提供的多肽DAKS1对凝血因子XI的抑制作用
本实施例所述的多肽DAKS1是通过在毕赤酵母中重组表达、镍柱亲和层析获得。用发色底物法检测该重组多肽对凝血因子XI的抑制作用。
吸取100μLFXIa(1nM)与50μL DAKS1(0-500nM)于96孔板中混合均匀，37℃孵育1h，加入50μL底物(FXIa发色底物为S2366，终浓度为0.25mM，在405nm波长下持续检测1h，每分钟扫描一次。阴性对照：50μLTBS-BSA缓冲液+100μLHFXIa+50μL底物，空白对照：50μL样品+100μLTBS-BSA缓冲液+50μL底物(所有孔均设置复孔)。绘制吸光度值-反应时间曲线，曲线的斜率即为酶促反应的速度V，阴性反应速度V0，样品反应速度Vi，抑制率＝(V0-Vi)/V0×100％。使用软件Graphpad Prism 6.0进行数据处理(图2a，b)。
结论：DAKS1对凝血因子XI有较强抑制活性，IC50为21.92±0.73nM.
实施例4：本发明提供的多肽DAKS1的抗凝活性
本实施例中，用活化部分凝血活酶时间(APTT)及凝血酶原时间(PT)法检测本发明提供的多肽(DAKS1)的抗凝活性。本实施例所述的多肽(DAKS1)是通过在毕赤酵母中重组表达、经镍柱亲和层析获得(见实施例2)。
活化部分凝血活酶时间(APTT)测定：将40μL PPP和10μL样品溶液(空白对照组用生理盐水)在测试杯中混匀，37℃孵育3min。加入50μLAPTT试剂，37℃继续孵育3min。将测试杯放于测试区，加入磁珠，然后加入50μL已经在37℃预热5min的CaCl2溶液，立即开始反应。待测试杯中小磁珠停止转动，表示实验结束，读取血凝仪上纤维蛋白形成时间。通过计算该重组多肽延长凝血时间的倍数值分析其延长APTT的能力，计算公式为：延长APTT倍数＝(测定的各浓度APTT值-空白对照组APTT值)/空白对照组APTT值。
凝血酶原时间(PT)测定：将40μL PPP和10μL样品溶液在测试杯中混匀，37℃孵育3min。将测试杯放于测试区，加入磁珠，然后加入100μL已经预热5min的PT试剂，立即开始反应。待测试杯中小磁珠停止转动，表示实验结束，读取血凝仪上纤维蛋白形成时间。
结论：多肽DAKS1剂量依赖性的延长APTT，对PT无影响
实施例5：本发明提供的多肽DAKS1对三氯化铁诱导的小鼠颈动脉血栓形成的抑制作用
小鼠(C57BL/6J，雄性，18-22g)腹腔注射水合氯醛(5％，10ml/kg)麻醉。麻醉成功后将小鼠按仰卧位固定在加热垫(37℃)上保持体温。在小鼠颈部正中切口，逐步分离筋膜和肌肉，暴露出颈动脉，并钝性分离出颈动脉约5mm左右。将适合宽度的橡胶条(4×10mm)放置于动脉下，使之与周围的组织分离开，保持颈动脉干净，小鼠尾静脉给药DAKS1(0.26,1.3and 2.6mg/kg)或生理盐水10min后，放置于激光散斑仪(Moor FLPI-2MoorInstruments)下观察颈动脉血流情况，将浸有6％FeCl3溶液的滤纸条(1*2mm)放置于颈动脉上3min后移除，并用生理盐水冲洗颈动脉3次，继续观察并记录颈动脉血流30min。观察用mFLPI2MeasV2-0软件，分析数据用moorFLPIReviewV50软件。
结论：DAKS1剂量依赖性的延长三氯化铁诱导的小鼠颈动脉血栓形成时间
实施例6：本发明提供的多肽DAKS1对MCAO模型小鼠的保护作用
小鼠(C57BL/6J，雄性，18-22g)腹腔注射水合氯醛(5％，10ml/kg)麻醉，仰卧固定在加热垫上(37℃)，在小鼠颈部正中切口，逐步分离筋膜和肌肉，暴露出颈动脉，分离颈内动脉和颈外动脉，结扎近端颈总动脉和颈外动脉，用聚赖氨酸涂层尼龙单丝(A4-162020，北京西浓，中国)从颈总动脉插入左侧颈内动脉，以闭塞左侧大脑中动脉的起始处。一小时后，尾静脉注射DAKS1(2.6mg/kg)。10分钟后，取出闭塞细丝以允许再灌注，24h后小鼠取脑，于-20℃冰箱冷冻20min后切成2mm宽脑片，置于2％TTC染液中染色30min(T8877-5G,Sigma)。
结论：该多肽经小鼠MCAO模型实验，与生理盐水组相比，DAKS1在2.6mg/kg剂量下对缺血性中风有保护作用。
实施例7：本发明提供的多肽DAKS1对小鼠断尾出血的影响
小鼠(C57BL/6J，雄性，18-22g)腹腔注射水合氯醛(5％，10ml/kg)麻醉，尾静脉注射给药DAKS1(3.25mg/kg和6.5mg/kg)或生理盐水10min后，,将小鼠放置于固定器中，将其尾部垂直，用尺测量，并在距尾尖3mm处作标记，然后用手术剪在鼠尾标记处剪断，并将其尾尖浸入37℃生理盐水中。剪断尾尖开始计时20min，另取一个秒表记录剪断尾尖后累积的血流时间(血流停止时同时暂停计时，再出现流血时继续计时)，如果出血时间t大于20min则记为20min，t即为出血时间。
结论：该多肽经小鼠断尾出血实验，与生理盐水组比，DAKS1在3.25mg/kg和6.5mg/kg剂量下没有明显出血风险。
序列表
<110> 中国药科大学
<120> 尖吻蝮蛇抗凝血因子XI多肽及其应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 57
<212> PRT
<213> DAKS1(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
Ala Val Cys Ser Gln Glu Ala Met Thr Gly Pro Cys Arg Ala Val Met
1 5 10 15
Pro Arg Trp Tyr Phe Asp Met Tyr Lys Lys Lys Cys Ile Arg Phe Ile
20 25 30
Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Glu Ser Glu Glu Tyr
35 40 45
Cys Met Ala Val Cys Lys Lys Met Ile
50 55
<210> 2
<211> 57
<212> PRT
<213> DAKS2(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
Asp Arg Cys His Ser Ser Lys Met Val Gly Pro Cys Arg Ala Ser Phe
1 5 10 15
His Arg Trp Trp Tyr Asn Ala Thr Ser Gln Thr Cys Gln Glu Phe Ile
20 25 30
Phe Gly Gly Cys Lys Gly Asn Ala Asn Asn Phe Phe Ser Glu Gln Asp
35 40 45
Cys Phe Gln Thr Cys Ala Arg Val Ala
50 55
<210> 3
<211> 57
<212> PRT
<213> DAKS3(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
Glu Phe Cys Ala Ala Pro Gln Met Val Gly Pro Cys Arg Ala Ser Phe
1 5 10 15
His Arg Trp Tyr Phe Asp Leu Glu Ser Arg Thr Cys Lys Met Phe Val
20 25 30
Tyr Gly Gly Cys His Gly Asn Lys Asn Asn Tyr Leu Phe Glu Glu His
35 40 45
Cys Trp Asn Gln Cys Thr Gly Asp Gly
50 55
<210> 4
<211> 56
<212> PRT
<213> DAKS4(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 4
Asp Leu Cys Gln Leu Pro Gln Glu Glu Gly Pro Cys Asp Leu Lys Leu
1 5 10 15
Pro Arg Trp Phe Tyr Asn Pro Lys Thr Asp Arg Cys Gln Lys Phe Asp
20 25 30
Phe Gly Gly Cys Ala Gly Asn Ala Asn Asn Phe Lys Arg Arg Arg Trp
35 40 45
Cys Arg Leu Arg Cys Arg Lys Arg
50 55
<210> 5
<211> 57
<212> PRT
<213> DAKS5(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 5
Asp Ile Cys Gln Leu Lys Lys Glu Asp Gly Pro Cys Arg Asn Phe Val
1 5 10 15
Leu Lys Trp Tyr Phe Asp Pro Lys Thr Ala Ser Cys Ala Arg Phe Trp
20 25 30
Tyr Gly Asp Cys Gly Gly Asn Glu Asn Arg Phe Asn Thr Gln Lys Asp
35 40 45
Cys Glu Lys Val Cys Val Ser Ala His
50 55
<210> 6
<211> 57
<212> PRT
<213> DAKS6(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 6
Ser Tyr Cys Val Asp Met Pro Asp Thr Gly Pro Cys Glu Gly Ser Leu
1 5 10 15
Pro Arg Trp Tyr Tyr Asn Pro Leu Thr Glu Lys Cys Gly Arg Phe Thr
20 25 30
Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Lys Asn Asn Phe Glu Gln Glu Glu Thr
35 40 45
Cys Met Glu Ile Cys Arg Gly Val Thr
50 55
<210> 7
<211> 57
<212> PRT
<213> DAKS7(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 7
Asp His Cys Leu Ala Pro Tyr Lys Val Gly Arg Cys Arg Gly Ser Phe
1 5 10 15
His Arg Trp Tyr Tyr Asn Pro Glu Ile Glu Gln Cys Gln Gln Phe Ile
20 25 30
Phe Gly Gly Cys Asn Pro Asn Lys Asn Asn Tyr Val Arg Lys Glu Glu
35 40 45
Cys Asn Leu Ala Cys Lys Lys Val Gly
50 55
<210> 8
<211> 57
<212> PRT
<213> DAKS8(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 8
Ala Phe Cys Leu Leu Glu Asn Asp Pro Gly Val Cys Arg Gly Leu Ile
1 5 10 15
Pro Arg Tyr Phe Tyr Asn Lys Glu Ser Gln Gln Cys Glu Lys Phe Gln
20 25 30
Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Gln Asn Asn Phe Lys Ser Leu Gln Glu
35 40 45
Cys Gln Asn Thr Cys His Asp Arg Val
50 55
<210> 9
<211> 57
<212> PRT
<213> DAKS9(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 9
Ser Ile Cys Ala Leu Lys Ala Asp Ser Gly Pro Cys Lys Ala Leu His
1 5 10 15
Thr Arg Tyr His Phe Asp Ile His Thr Arg His Cys Glu Ser Phe Asn
20 25 30
Phe Gly Gly Cys Gln Gly Asn Glu Asn Asn Phe Leu Thr Leu Glu Glu
35 40 45
Cys Gln Gln Thr Cys Val Ile Lys Asp
50 55
<210> 10
<211> 57
<212> PRT
<213> DAKS10(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 10
Leu Phe Leu Leu Pro Ser Leu Cys Val Met Pro Met Asp Arg Gly Leu
1 5 10 15
Cys Lys Ala Asn Glu Lys Arg Phe Phe Tyr Asn Gln Thr Thr Gly Arg
20 25 30
Cys Arg Pro Phe Ser Tyr Thr Gly Cys Gly Gly Asn Glu Asn Asn Phe
35 40 45
Thr Ser Arg Lys Ala Cys Val Gln Met
50 55
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：T细胞受体及其应用