具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现对IL-2多肽作定点突变后的新型IL-2突变体能够降低与IL-2Rβγ二聚体的结合，保留其生物学活性，并优先刺激调节性T细胞增殖。因此，本发明的IL-2突变体可以用于自身免疫性疾病的治疗，但没有利用天然IL-2进行免疫治疗产生的各种副作用。在此基础上完成了本发明。

本发明的IL-2突变体

在本发明中，通过定点突变使得IL-2多肽发生氨基酸残基改变，进而改变IL-2与其受体的结合能力或亲和力，但能保留生物学活性。本发明的IL-2突变体能够刺激调节性T细胞(Treg)增殖，并且相比于野生型IL-2，其副作用还显著降低，从而能够实现更好的治疗目的。

本发明的IL-2突变体优选用真核细胞表达，通过细胞培养获得。可以选择酵母，昆虫细胞，动物细胞，也可以选择转基因动物。在具体的实施方式中，所述宿主细胞为真核细胞；优选酵母、昆虫细胞、动物细胞；动物细胞优选哺乳动物细胞，包括但不限于CHO细胞、293细胞、SP/20细胞、NS0细胞。任选地，本发明的IL-2突变体可选无细胞表达，体外合成等技术手段获得。

当采用酵母细胞或昆虫细胞作为宿主细胞时，可能得到的IL-2突变体的糖型是非人的。本领域技术人员知晓可以进一步将非人糖型改造成人糖型。

在其它实施方式中，也可以使用原核细菌表达发酵或体外无细胞合成获得IL-2突变体。

本发明的IL-2突变体是在对应于野生型IL-2的第90位发生突变。因此，在具体的实施方式中，本发明的IL-2突变体在对应于野生型IL-2蛋白的90位发生以下氨基酸残基突变：N90A、N90G、N90V、N90I、N90M、N90L、N90F、N90Y、N90W、N90H、N90R、N90K、N90Q、N90D、N90E、N90P、N90T、N90B、N90C、N90S、N90Z和N90I；优选N90T、N90S、N90V、N90I、N90M、N90L；更优选N90T、N90S；最优选N90T。

基于本领域的常规作法，也可以消除IL-2多肽中原有的O-糖位点，去除O糖不影响IL-2生物学活性，O糖结构复杂，分析困难，为了减少生产质控的复杂性，通常可以利用基因工程突变技术消除该糖基化位点。因此，本发明的IL-2突变体可以在对应于野生型IL-2蛋白的3位发生以下氨基酸残基突变：T3A、T3G、T3Q、T3E、T3N、T3D、T3R、T3K和T3P；优选T3A。在IL-2基因产物的提纯和复性过程中，如二硫键配错或分子间形成二硫键都会降低IL-2的活性。现已有应用点突变，将第125号位半胱氨酸突变为亮氨酸或丝氨基，使只能形成一种二硫键，保证了在IL-2复性过程的活性。还有报道用蛋白工程技术生产新型rIL-2，将IL-2分子第125位半胱氨酸改为丙氨酸，改构后IL-2比活性比天然IL-2明显增加。因此，本发明的IL-2突变体可以在对应于野生型IL-2蛋白的125位发生以下氨基酸残基突变：C125L、C125A、C125S；优选C125S。

“对应于”

本文所用的术语“对应于”具有本领域普通技术人员通常理解的意义。具体地说，“对应于”表示两条序列经同源性或序列相同性比对后，一条序列与另一条序列中的指定位置相对应的位置。因此，例如，“对应于野生型IL-2”表示将某条氨基酸序列与野生型IL-2的氨基酸序列进行比对，找到该氨基酸序列上与野生型IL-2相对应的位点。

本发明的融合蛋白或缀合物

基于本发明的IL-2突变体，本领域技术人员知晓可以将本发明的IL-2突变体与非IL-2的其它功能部分制成融合蛋白或缀合物。在本文中，缀合物是指一种水溶性聚合物共价连接突变体IL-2多肽的残基。在具体的实施方式中，所述非IL-2功能部分包括但不限于：Fc片段、人血清白蛋白(HSA)、抗HSA抗体及片段、转铁蛋白、人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端肽(CTP)、类弹性蛋白多肽(elastin-like peptide，ELP)和抗原结合部分，还包括细胞因子，具体为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等。

基于本领域的常规操作，本领域技术人员知晓如何获得包含本发明的IL-2突变体的融合蛋白或缀合物。例如，可以将本发明的IL-2突变体与其它非IL-2功能部分直接连接，也可以通过连接物连接。所述连接物可以是AAA或GS的重复序列，包括但不限于G3S的重复序列或G4S的重复序列；例如(G3S)4。

进一步地，还可以对所述IL-2突变体或融合蛋白缀合物聚乙二醇修饰(PEG化)、聚唾液酸化修饰(PSA化)、饱和脂肪酸修饰、透明质酸修饰(Hyaluronic acid，HA)或聚氨基酸修饰(proline-alamine-serine polymer，PAS化)形成缀合物。

本发明的双特异性抗体或三特异性抗体

疾病的发生通常由多种致病因素导致，对多个靶点同时进行阻断可能会实现更好的治疗效果，因此双特异性抗体(bispecific antibody，BsAb)应运而生。肿瘤免疫疗法是目前治疗肿瘤的新方向。双特异性抗体可结合两种不同的抗原，因而在肿瘤治疗领域的开发前景十分广阔。双特异性抗体最初是利用化学偶联法或杂交瘤杂交法来制备。如今，DNA重组技术的迅速发展使得双特异性抗体的结构发生了革命性变化，主要分为含有Fc区的IgG型和不含Fc区的非IgG型两大类。IgG型双特异性抗体的结构与单克隆抗体类似，蛋白相对分子质量较大，血浆半衰期长。非IgG型双特异性抗体的结构形式更加多样，蛋白相对分子质量较小，组织渗透性更强，但血浆半衰期较短。

基于本发明的IL-2突变体，本领域技术人员知晓可以将本发明的IL-2突变体与抗体结构域共价连接。在具体的实施方式中，所述抗体结构域包括但不限于：IgG型抗体和非IgG型抗体。在优选的实施方式中，所述抗体结构域可以是抗体或其活性抗体片段，Fab分子、scFv分子和VHH分子、免疫球蛋白分子、受体蛋白分子或配体蛋白分子；所述免疫球蛋白分子可以是IgG分子。

基于本领域的常规操作，本领域技术人员知晓如何获得包含本发明的IL-2突变体的双特异性抗体。例如，可以将本发明的IL-2突变体与其它非IL-2功能部分直接连接，也可以通过连接物连接。所述连接物可以是AAA或GS的重复序列，包括但不限于G₃S的重复序列或G₄S的重复序列；例如(G₃S)₄。

任选的本发明的突变体可以与T细胞表面抗原抗体进行偶连，还可以与肿瘤细胞表面抗原抗体进行偶连。优选地，本发明的突变体可以与T细胞表面抗原抗体偶连。

任选的本发明的突变体可以与T细胞表面抗原抗体进行偶连，形成双特异性抗体，还可以与肿瘤细胞表面抗原抗体进行偶连，形成双特异性抗体。任选的本发明的突变体可以与T细胞表面抗原抗体进行偶连，形成三特异性抗体，还可以与肿瘤细胞表面抗原抗体进行偶连，形成三特异性抗体。任选的本发明的突变体可以与T细胞表面抗原抗体或肿瘤细胞表面抗原抗体进行偶连，形成三特异性抗体。

本发明的药物组合物及其给药方式

在本发明的IL-2突变体的基础上，本发明还提供了药物组合物。在具体的实施方式中，本发明的药物组合物包含本发明的IL-2突变体或权利要求5所述的融合蛋白或缀合物或权利要求7所述的双特异性抗体或三特异性抗体以及任选的药学上可接受的辅料。

任选地，本发明的组合物进一步包含一种药学上可接受的赋形剂。如果希望的话，可以添加药学上可接受的赋形剂到本发明的IL-2突变体多肽、融合蛋白或缀合物、双特异性抗体或三特异性抗体中以形成一种组合物。

本发明的IL-2突变体的用途以及使用方法

如上所述，本发明的IL-2突变体能够降低突变体IL-2蛋白对中等亲和力IL-2受体的亲和力，同时保留了IL-2的生物学活性，从而更好地刺激调节性T细胞(Treg)增殖。因此，本发明的IL-2突变体、融合蛋白、缀合物、双特异性抗体或三特异性抗体、药物组合物可以制备成相应的药物。所述药物可以用于体外扩增调节性T细胞(Treg)或治疗利用IL-2作免疫治疗的疾病。在具体的实施方式中，所述疾病是系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫性疾病、糖尿病、人类免疫缺陷病毒HIV感染、丙型肝炎病毒HCV感染、风湿性关节炎，特应性皮炎等。

本发明的优点：

1.本发明的IL-2突变体蛋白降低了与IL-2Rβγ二聚体的结合。

2.本发明的IL-2突变体的结构与天然IL-2更接近，避免了突变对蛋白其它结构位点的影响，保留了生物学活性；

3.本发明的白介素2突变体蛋白可以用于自身免疫性疾病的治疗，但没有利用天然IL-2进行免疫治疗产生的各种副作用。

4.相比于现有技术中的其它IL-2突变体，本发明的IL-2突变体的免疫原性更低；

5.本发明的IL-2突变体便于生产和质量控制，一般不需要体外再修饰的过程，减少步骤提高生产效率；

6.本发明的IL-2突变体便于与其它分子组成双功能或多功能的融合蛋白或免疫组合物；

7.本发明的IL-2突变体可以用于免疫治疗，但不会导致天然IL-2导致的血管(或毛细管)渗漏综合征(VLS)；和

8.本发明的IL-2突变体的体内半衰期显著延长。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

实施例1.突变体白介素-2(IL-2)蛋白的合成

通过分子克隆手段分别将包括人IgG4Fc编码序列的IL-2突变体IL-2-gmB2-hIgG4Fc(SEQ ID NO:1)及野生型IL2-N-hIgG4Fc(SEQ ID NO:2)的编码序列构建至真核表达载体中以制备IL-2-gmB2-hIgG4Fc及野生型IL2-N-hIgG4Fc表达载体。使用Freestyle培养基培养的293E细胞进行IL-2突变体分子的瞬时转染表达。转染前24小时，在1L细胞培养瓶中接种0.5×10⁶细胞/ml的293E细胞150ml，37℃5％CO2温箱中120rpm摇床培养。转染时先取150μl的293fectin加入到2.85ml的OptiMEM中，充分混匀后，室温孵育2分钟；同时分别将用于表达IL-2分子的质粒150μg使用OptiMEM稀释至3ml。将上述稀释后的转染试剂及质粒充分混合，室温孵育15分钟，然后将混合物全部加入细胞中，混匀，37℃5％CO₂温箱中120rpm摇床培养7天。收集细胞培养上清，将上清用0.22微米的滤膜过滤，然后利用Q-HP离子交换层析柱(GE)进行纯化，利用20mM Tris 0-500mM NaCl，pH 8.0线性洗脱，按体积连续收集样品。利用4～20％梯度胶(金斯瑞公司)进行SDS-PAGE检测各收集组分，并根据电泳纯度进行合样。

实施例2.受体蛋白的制备

为研究IL-2突变体分子与IL-2Rα受体及IL-2Rβγ异源二聚化受体的结合能力，制备了人源的IL-2Rα受体及IL-2Rβγ异源二聚化受体蛋白。

人源IL-2Rα受体的设计为将IL-2Rα胞外结构域编码序列与6×His Tag编码序列相连(SEQ ID NO:3)，克隆至真核表达载体中。使用Freestyle培养基培养的293E细胞进行IL-2Rα受体的瞬时转染表达。转染前24小时，在1L细胞培养瓶中接种0.5×10⁶细胞/ml的293E细胞150ml，37℃5％CO2温箱中120rpm摇床培养。转染时先取150μl的293fectin加入到2.85ml的OptiMEM中，充分混匀后，室温孵育2分钟；同时将用于表达IL-2Rα受体的质粒150μg使用OptiMEM稀释至3ml。将上述稀释后的转染试剂及质粒充分混合，室温孵育15分钟，然后将混合物全部加入细胞中，混匀，37℃5％CO2温箱中120rpm摇床培养7天。收集细胞培养上清，将上清用0.22微米的滤膜过滤，然后利用Ni-NTA亲和层析柱(GE)进行纯化，在20mMPB-0.5M NaCl-100mM咪唑条件下洗脱。利用4～20％梯度胶(金斯瑞公司)进行SDS-PAGE检测纯化蛋白质。

人源IL-2Rβγ异源二聚化受体的设计利用CH1和CL配对的特性完成异源配对。hIL2Rβ(SEQ ID NO:4)和hIL2Rγ(SEQ ID NO:5)，分别克隆至真核表达载体中。使用Freestyle培养基培养的293E细胞进行IL-2Rβγ异源二聚化受体的瞬时转染表达。转染前24小时，在1L细胞培养瓶中接种0.5×10⁶细胞/ml的293E细胞150ml，37℃5％CO2温箱中120rpm摇床培养。转染时先取150μl的293fectin加入到2.85ml的OptiMEM中，充分混匀后，室温孵育2分钟；同时将用于表达IL-2Rβγ异源二聚化受体(命名：hIL2Rβ,γECD-His)的质粒各75μg使用OptiMEM稀释至3ml。将上述稀释后的转染试剂及质粒充分混合，室温孵育15分钟，然后将混合物全部加入细胞中，混匀，37℃5％CO2温箱中120rpm摇床培养7天。收集细胞培养上清，将上清用0.22微米的滤膜过滤，然后利用MabSelect SuRe亲和层析柱(GE)进行纯化，在20mM枸橼酸-枸橼酸纳，pH3.0条件下洗脱，用1M Tris base调节pH至中性。利用4～20％梯度胶(金斯瑞公司)进行SDS-PAGE检测纯化蛋白质。

实施例3.利用biacore检测结合受体的亲和力实验

为研究IL-2突变体相对于野生型与受体的亲和力，在以下条件下使用重组单体IL-2Rα亚基通过Biacore 8K(GE)测定IL-2突变体分子IL-2-gmB2-hIgG4Fc及野生型IL2-N-hIgG4Fc对人IL-2Rα亚基的亲和力：将人IL-2Rα亚基固定化于CM5芯片上(190RU)。在25℃在HBS-EP缓冲液中将IL-2-gmB2-hIgG4Fc及野生型IL2-N-hIgG4Fc用作分析物。对于IL-2Rα，分析物浓度为200nM降至1.526nM(1:2稀释)，流动为30μl/分(结合时间180秒，解离时间300秒)。对于IL-2Rα，再生用20mM NaOH,30ul/min进行10秒。对于IL-2Rα，使用1:1结合，RI≠0，R最大值＝全局拟合数据。

结果如图1所示；其中IL-2-gmB2-hIgG4Fc的R最大值为25，IL2-N-hIgG4Fc的R最大值为25。因此，相对于野生型IL2-N-hIgG4Fc，IL-2-gmB2-hIgG4Fc保留了与IL-2Rα二聚体的亲和力。

在以下条件下使用重组hIL2Rβ,γECD-His异二聚体通过Biacore 8K(GE)测定IL-2突变体分子IL-2-gmB2-hIgG4Fc及野生型IL2-N-hIgG4Fc对人IL-2Rβγ异二聚体的亲和力：将IL-2-gmB2-hIgG4Fc及野生型IL2-N-hIgG4Fc固定化于Protein A芯片上(100RU)。25℃在HBS-EP缓冲液中将重组hIL2Rβ,γECD-His异二聚体用作分析物。对于IL-2-gmB2-hIgG4Fc及野生型IL2-N-hIgG4Fc，分析物浓度为100nM降至0.78nM(1:2稀释)，流动为30μl/分(结合时间180秒，解离时间300秒)。对于IL-2-gmB2-hIgG4Fc及野生型IL2-N-hIgG4Fc，再生用10mM Glycine(pH 1.5),30ul/min,30秒。对于IL-2-gmB2-hIgG4Fc及野生型IL2-N-hIgG4Fc，使用1:1结合，RI≠0，R最大值＝局部拟合数据。

结果如图2所示；其中IL-2-gmB2-hIgG4Fc的R最大值为1.7，IL2-N-hIgG4Fc的R最大值为4.0。如图2所示，IL-2-gmB2-hIgG4Fc相对于野生型IL2-N-hIgG4Fc降低了与IL-2Rβγ二聚体的亲和力。因此，IL-2-gmB2-hIgG4Fc相对于野生型IL2-N-hIgG4Fc保留了与IL-2Rα的亲和力并降低了与IL-2Rβγ二聚体的亲和力。

实施例4.利用NK92细胞进行细胞增殖分析

NK92细胞是一株从一位患有急进性非霍奇金淋巴瘤的50岁白人男性外周血单核细胞衍生来的IL-2依赖型NK细胞株。其细胞表面表达IL-2受体α、β和γ链，该细胞表面标志物与调节性T细胞表面标志物相同。因此，本发明人利用NK92细胞在细胞增殖分析中评估IL-2-gmB2-hIgG4Fc及野生型IL2-N-hIgG4Fc的活性。

收获处于对数生长期的NK92细胞，用基础培养基MEM-α清洗一遍，将其(5000个/孔)与不同浓度的IL-2-gmB2-hIgG4Fc及野生型IL2-N-hIgG4Fc在实验培养基(来自Gibco(货号32561-037)的MEM-α培养基，添加12.5％胎牛血清和12.5％的马血清)中，于37℃、5％二氧化碳培养箱中共培养48h。每孔加入100μl ATP检测底物CellTiter-Glo(来自promega(货号G7571))，于酶标仪(购自Molecular Devices(型号I3x))下终点法检测全波长荧光值。

结果如图3所示；采用细胞增殖分析测量IL-2-gmB2-hIgG4Fc及野生型IL2-N-hIgG4Fc的活性，发现所有测试品均以剂量依赖性方式诱导NK92细胞生长。因此，相对于野生型IL2-N-hIgG4Fc，IL-2-gmB2-hIgG4Fc保留了生物学活性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海盖浦生物科技有限公司

<120> 一种增殖调节性T细胞的突变体蛋白

<130> P2020-0861

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 377

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val

1 5 10 15

Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

225 230 235 240

Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu

245 250 255

Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile

260 265 270

Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe

275 280 285

Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu

290 295 300

Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys

305 310 315 320

Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Thr Val Ile

325 330 335

Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala

340 345 350

Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe

355 360 365

Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

370 375

<210> 2

<211> 377

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val

1 5 10 15

Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

225 230 235 240

Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu

245 250 255

Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile

260 265 270

Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe

275 280 285

Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu

290 295 300

Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys

305 310 315 320

Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile

325 330 335

Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala

340 345 350

Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe

355 360 365

Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

370 375

<210> 3

<211> 257

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Asp Ser Tyr Leu Leu Met Trp Gly Leu Leu Thr Phe Ile Met Val

1 5 10 15

Pro Gly Cys Gln Ala Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro

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His Ala Thr Phe Lys Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn

35 40 45

Cys Glu Cys Lys Arg Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr

50 55 60

Met Leu Cys Thr Gly Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys

65 70 75 80

Gln Cys Thr Ser Ser Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro

85 90 95

Gln Pro Glu Glu Gln Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro

100 105 110

Met Gln Pro Val Asp Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro

115 120 125

Pro Pro Trp Glu Asn Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val

130 135 140

Gly Gln Met Val Tyr Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His

145 150 155 160

Arg Gly Pro Ala Glu Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg

165 170 175

Trp Thr Gln Pro Gln Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln

180 185 190

Phe Pro Gly Glu Glu Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu

195 200 205

Ser Glu Thr Ser Cys Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr

210 215 220

Glu Met Ala Ala Thr Met Glu Thr Ser Ile Phe Thr Thr Glu Tyr Gln

225 230 235 240

Asp Asp Asp Asp Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser His His His His His

245 250 255

His

<210> 4

<211> 356

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro

20 25 30

Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu

35 40 45

Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp

50 55 60

Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln

65 70 75 80

Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu

85 90 95

Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly

100 105 110

Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser His His His His His His Asp Asp Asp Asp Lys Ala Val

130 135 140

Asn Gly Thr Ser Gln Phe Thr Cys Phe Tyr Asn Ser Arg Ala Asn Ile

145 150 155 160

Ser Cys Val Trp Ser Gln Asp Gly Ala Leu Gln Asp Thr Ser Cys Gln

165 170 175

Val His Ala Trp Pro Asp Arg Arg Arg Trp Asn Gln Thr Cys Glu Leu

180 185 190

Leu Pro Val Ser Gln Ala Ser Trp Ala Cys Asn Leu Ile Leu Gly Ala

195 200 205

Pro Asp Ser Gln Lys Leu Thr Thr Val Asp Ile Val Thr Leu Arg Val

210 215 220

Leu Cys Arg Glu Gly Val Arg Trp Arg Val Met Ala Ile Gln Asp Phe

225 230 235 240

Lys Pro Phe Glu Asn Leu Arg Leu Met Ala Pro Ile Ser Leu Gln Val

245 250 255

Val His Val Glu Thr His Arg Cys Asn Ile Ser Trp Glu Ile Ser Gln

260 265 270

Ala Ser His Tyr Phe Glu Arg His Leu Glu Phe Glu Ala Arg Thr Leu

275 280 285

Ser Pro Gly His Thr Trp Glu Glu Ala Pro Leu Leu Thr Leu Lys Gln

290 295 300

Lys Gln Glu Trp Ile Cys Leu Glu Thr Leu Thr Pro Asp Thr Gln Tyr

305 310 315 320

Glu Phe Gln Val Arg Val Lys Pro Leu Gln Gly Glu Phe Thr Thr Trp

325 330 335

Ser Pro Trp Ser Gln Pro Leu Ala Phe Arg Thr Lys Pro Ala Ala Leu

340 345 350

Gly Lys Asp Thr

355

<210> 5

<211> 381

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

20 25 30

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

35 40 45

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

50 55 60

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

65 70 75 80

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

85 90 95

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

100 105 110

Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser His His His His His His Asp Asp Asp Asp Lys Leu Asn Thr

130 135 140

Thr Ile Leu Thr Pro Asn Gly Asn Glu Asp Thr Thr Ala Asp Phe Phe

145 150 155 160

Leu Thr Thr Met Pro Thr Asp Ser Leu Ser Val Ser Thr Leu Pro Leu

165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

Leu Phe Ser Glu Glu Ile Thr Ser Gly Cys Gln Leu Gln Lys Lys Glu

225 230 235 240

Ile His Leu Tyr Gln Thr Phe Val Val Gln Leu Gln Asp Pro Arg Glu

245 250 255

Pro Arg Arg Gln Ala Thr Gln Met Leu Lys Leu Gln Asn Leu Val Ile

260 265 270

Pro Trp Ala Pro Glu Asn Leu Thr Leu His Lys Leu Ser Glu Ser Gln

275 280 285

Leu Glu Leu Asn Trp Asn Asn Arg Phe Leu Asn His Cys Leu Glu His

290 295 300

Leu Val Gln Tyr Arg Thr Asp Trp Asp His Ser Trp Thr Glu Gln Ser

305 310 315 320

Val Asp Tyr Arg His Lys Phe Ser Leu Pro Ser Val Asp Gly Gln Lys

325 330 335

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340 345 350

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370 375 380