基于光源调制的高分辨率单细胞蛋白定量检测方法
阅读说明：本技术 基于光源调制的高分辨率单细胞蛋白定量检测方法 (High-resolution single-cell protein quantitative detection method based on light source modulation ) 是由 陈健 张婷 陈德勇 王军波 于 2021-08-19 设计创作，主要内容包括：本发明提出了一种基于光源调制的高分辨率单细胞蛋白定量检测方法,包括如下步骤：步骤1：将用荧光抗体标记的细胞或荧光抗体溶液体积等量注入压缩微通道；步骤2、所述染色的细胞或抗体溶液通过压缩微通道的检测区域时,由交流激光源对细胞或抗体溶液进行照射激发；步骤3、细胞或抗体溶液在步骤2的激发下发出荧光,由光电倍增管检测管(PMT)检测荧光信号；步骤4、得到调制荧光信号的幅度被解调为荧光脉冲,根据脉冲荧光强度的上升稳定和下降现象,得到三个关键时间参数和一个稳定期的荧光强度参数；步骤5、利用压缩微通道形成的相应校准曲线,将原始荧光参数转化为单细胞蛋白浓度；用原始时间参数计算出细胞拉伸长度,进而求得细胞直径。最后单细胞直径结合单细胞蛋白浓度得到单细胞蛋白的数量。(The invention provides a high-resolution single-cell protein quantitative detection method based on light source modulation, which comprises the following steps: step 1: injecting the cells marked by the fluorescent antibody or the fluorescent antibody solution into the compressed micro-channel in equal volume; step 2, when the dyed cell or antibody solution passes through a detection area of a compressed micro-channel, the cell or antibody solution is irradiated and excited by an alternating-current laser source; step 3, the cell or antibody solution emits fluorescence under the excitation of the step 2, and a fluorescence signal is detected by a photomultiplier tube (PMT); step 4, demodulating the amplitude of the obtained modulated fluorescence signal into a fluorescence pulse, and obtaining three key time parameters and a fluorescence intensity parameter of a stabilization period according to the rising stabilization and falling phenomena of the fluorescence intensity of the pulse; step 5, converting the original fluorescence parameters into the concentration of the single-cell protein by using a corresponding calibration curve formed by compressing the micro-channel; and calculating the cell stretching length by using the original time parameters, and further calculating the cell diameter. Finally, the number of the single cell protein is obtained by combining the single cell diameter with the single cell protein concentration.)
技术领域
本发明涉及蛋白质检测技术领域，尤其是一种基于光源调制的高分辨率单细胞蛋白定量检测方法。
背景技术
在单细胞水平测量蛋白质有助于细胞类型分类和细胞状态评估，这在包括肿瘤发展和免疫反应在内的细胞异质性领域起着关键作用。
传统的定量检测单细胞蛋白质方法主要包括荧光流式细胞术和质谱流式细胞术。其中荧光流式细胞术是表征单细胞蛋白表达的最为普遍的方法，在对细胞蛋白分析时，首先将分散的单细胞用带荧光的特异性抗体标记后，在流体聚焦作用下排成一列，依次进入检测区域，荧光标记过的细胞蛋白被激发出荧光，可通过相对荧光强度来反映蛋白的相对含量，同时还能保持单细胞的完整性，该方法的缺陷在于需要使用具有明确定义的表面结合位点的校准珠子将原始荧光信号转化为单细胞水平的表面抗原的定量数，由于缺乏具有明确定义的内部结合位点的相应校准珠，而无法获得单个细胞的特定细胞内蛋白的定量数量；质谱流式细胞术是流式细胞技术与电感耦合质谱分析技术的结合，它采用金属元素偶联的特异抗体标记细胞表面或内部的蛋白，以单细胞的形式进样，再用感应耦合等离子质谱检测单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱的数据转换为细胞待测蛋白含量，并通过专业分析软件对获得的大量数据进行分析，该方法的缺点在于检测速度低且灵敏度低。
基于微流控定量检测单细胞蛋白的方法大致包括微孔/微腔阵列检测方法、微流控流式细胞术两种。微孔/微腔阵列检测方法主要是通过加工微孔或者通过控制微流道开闭构成微腔室，将单个细胞捕获在单个腔室中，通过对细胞进行培养或者裂解，获得单细胞的特定蛋白，最后对微腔室内的蛋白进行检测，即可得到单细胞层面的蛋白含量水平，尽管这些微流体方法基于大阵列并具有高通量的特点，但它们与流式细胞术(单细胞蛋白质分析的金标准)不兼容。微流式细胞术是利用微流控技术在芯片上实现传统流式细胞仪对单细胞蛋白分析的一种方法，是将待测细胞与荧光标记的特异性抗体混合后通入微沟道，通过检测荧光强度来实现细胞特异性蛋白的检测。但是该方法与传统流式细胞术问题相似，已经报道的微型流式细胞术同样因标定方法限制而无法定量检测细胞内蛋白。另外，还有一种微流体流式细胞仪来定量估计特定的细胞内蛋白质。然而，这种定量微流体流式细胞仪受到高电和光噪声的影响，导致检测含量较少的单细胞蛋白质性能受到影响。
因此发展一种高通量、高分辨率的定量检测单细胞蛋白质装置与方法是非常有必要的。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明利用光学调制解调的原理，提出一种基于微压缩通道的定量检测单细胞蛋白的方法。该方法相较于现有技术，有三方面改进目标：
(1)提高了定量单细胞蛋白检测的分辨率。目前已有的基于微压缩通道的定量单细胞蛋白检测方法可得到细胞内蛋白质含量，受限于低频的1/f噪声，导致检测分辨率低，难以检测单细胞内含量少但具有重要意义的胞内蛋白。
(2)提高了定量单细胞蛋白检测的检测效率。目前已有的定量单细胞蛋白检测方法如荧光流式细胞术因为受限于分辨率，很多单细胞荧光脉冲都淹没在噪声中，导致检测过程中损失了很多细胞的数据，大大影响了单细胞蛋白的检测效率。
本发明的技术方案为：一种基于光源调制的高分辨率单细胞蛋白定量检测方法，包括如下步骤：
步骤1：将用荧光抗体标记的细胞或荧光抗体溶液体积等量注入压缩微通道；
步骤2、所述染色的细胞或抗体溶液通过压缩微通道的检测区域时，由交流调制的激光源对细胞或抗体溶液进行照射激发；
步骤3、细胞或抗体溶液在步骤2的激发下发出荧光，由光电倍增管检测管(PMT)检测荧光信号；此时PMT探测到的荧光信号是高频激光作用下的高频荧光信号，也就是调制好的荧光信号；
步骤4、得到调制荧光信号的幅度被解调为荧光脉冲，根据脉冲荧光强度的上升稳定和下降现象，得到的三个关键时间参数为上升时间Tr，平稳时间Ts和下降时间Td，荧光参数为荧光强度If；
步骤5、利用压缩微通道形成的相应校准曲线，将原始荧光参数转化为单细胞蛋白浓度；用原始时间参数计算出细胞拉伸长度，进而求得细胞直径。最后单细胞直径结合单细胞蛋白浓度得到单细胞蛋白的数量。
进一步的，所述步骤2，使用具有正弦波的激光源将经过检测区域的荧光抗体标记的单细胞荧光信号调制到高频，即高频激光在细胞穿行过程中对单个细胞多次照射，得到的单个细胞荧光信号由高频正弦波构成，正弦波幅值的大小反映荧光强度的大小。
进一步的，所述步骤3，在解调步骤中，调制信号随后由锁定放大器借助与激光同频的参考信号解调此调制信号以获得荧光脉冲，其中高阶低通滤波器用于进一步去除噪声并提高信噪比。
进一步的，所述步骤4，基于曲线拟合，得到三个对应的时间参数Tr，Ts，Td和代表荧光强度的If参数；压缩微通道内的细胞拉伸长度Lc从关键时间和几何参数转换关系如下：
其中Wd表示了窗口的宽度，Ls表示具有方形横截面的压缩微通道的边长；
然后进一步获得细胞直径Dc如下：
抗体溶液的每个梯度浓度的荧光强度的平均值和标准偏差形成校准曲线，基于校准方程，以实验得到的荧光信号强度作为输入，荧光强度被转化为单个细胞的特定蛋白质浓度Cp；
最后，基于细胞直径Dc和蛋白质浓度Cp，进一步获得了单细胞水平的特定蛋白质数量np。
有益效果：
从以上技术方案的阐述可以看出本发明：基于狭窄交叉通道的细胞及细胞核生物电学特性检测方法具有以下有益效果：
(1)本发明的方法定量单细胞蛋白检测的分辨率高。与已有方法相比，经过光学调制原理可以有效降低电噪声和光噪声，检测到在细胞中表达更少但具有重要意义的蛋白。
(2)本发明的方法定量单细胞蛋白检测的检测效率高。与已有方法相比，通过提高检测的分辨率，在同等数量的待测细胞条件下，能够检测到更多有效信号，减少样品的损失，缩短检测时间，提高检测的效率。
(3)与已有方法相比，得益于光学调制能够有效地降低电和光噪声，利用此原理进行蛋白质定量检测被证明可以有效地将检测分辨率从每个细胞约1000个细胞内蛋白质提高到每个细胞约100个细胞内蛋白质。
附图说明
图1：本发明的检测方法原理示意图；
图2(A)：调制细胞信号；
图2(B)：解调细胞脉冲；
图3：校准曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅为本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。本发明实施例提供了一种基于压缩微通道和光学调制的高分辨率量化单细胞细胞内蛋白质装置及方法。
本发明的原理示意图及操作流程如图1所示。根据本发明的一个实施例，一种基于压缩微通道和光学调制的高分辨率量化单细胞细胞内蛋白质装置包括：微流控芯片、显微镜的载物台、压力控制仪等；含有矩形横截面压缩通道的微流控芯片平稳放置于一台倒置荧光显微镜的载物台上，在软管与通道的连接下，用压力控制仪对通道施加一定的负压，压缩通道可使细胞适当压缩通过该通道，当细胞通过压缩通道时，只有遮光薄膜形成的狭缝处可透光，通过透光狭缝，激光器在信号发生器的控制下，以特定功率和频率发射高频交流激光照射被测物，从而激发出来的荧光可通过该透光狭缝被探测，激发出来的荧光是经过高频激光调制过的交流荧光信号，该信号被光电倍增管收集并送到锁相放大器中解调，同时，用于控制激光器的信号也送到锁相放大器中作为参考信号用于解调，解调过后的信号即可被送到信号采集卡中采集，从而对探测到的信号进行分析。图1显示了基于压缩微通道和光学调制的高分辨率量化单细胞细胞内蛋白方法的示意图，可利用荧光调制对单细胞蛋白质进行高分辨率和高通量定量。具体包括如下步骤：
步骤1：将用荧光抗体标记的细胞(见图1中的(A))或荧光抗体溶液(见图1中的(B))体积等量注入压缩微通道；
步骤2、所述染色的细胞或抗体溶液通过压缩微通道的检测区域时，由交流调制的激光源对细胞或抗体溶液进行照射激发；
步骤3、细胞或抗体溶液在步骤2的激发下发出荧光，由光电倍增管检测管(PMT)检测荧光信号(见图1中的(C))。此时PMT探测到的荧光信号是高频激光作用下的高频荧光信号，也就是调制好的荧光信号；
步骤4、得到调制荧光信号的幅度(见图1中的(D))被解调为荧光脉冲，根据脉冲荧光强度的上升稳定和下降现象，得到的三个关键时间参数为上升时间Tr，平稳时间Ts和下降时间Td，荧光参数为荧光强度If(见图1中的(E))。
步骤5、利用压缩微通道形成的相应校准曲线(见图1中的(F))，将原始时间和荧光参数转化为细胞拉伸长度和单细胞蛋白浓度(见图1中的(G))，然后进一步转化为细胞直径和单细胞蛋白的数量(见图1中的(H))。
该微流体平台的关键组成部分是对单细胞的荧光脉冲进行调制和解调的过程，从而提高了单细胞蛋白质分析的检测分辨率(见图1中的(D)和(E))。为了避免低频1/f噪声，在调制步骤中，使用具有正弦波的激光源将经过检测区域的荧光抗体标记的单细胞荧光信号调制到高频，即高频激光在细胞穿行过程中对单个细胞多次照射，得到的单个细胞荧光信号由高频正弦波构成，正弦波幅值的大小反映荧光强度的大小(见图1中的)(D))。在解调步骤中，调制信号随后由锁定放大器借助与激光同频的参考信号解调此调制信号以获得荧光脉冲，其中高阶低通滤波器用于进一步去除噪声并提高信噪比。
具体来说，细胞通过频率为1kHz，激光载波频率选择20kHz，保证了载波频率比细胞通过频率高10倍以上，才能有效地将单个细胞的荧光信号调制到更高的频域，从而远离低频噪声，同时由于后续采集用到PMT，其中放大电路带宽最大为20kHz/200kHz，载波频率若超过这个频率光信号则不能被有效放大。为了有效的提高检测的分辨率，基于光学调制的蛋白检测部分还需要对控制高频激发光的信号发生器电压设置进行优化，包括控制电压的直流偏置和交流电压幅值，利用控制变量的方式在合适范围内逐步提高控制电压的直流偏置和交流幅值，交流振幅的增加意味着激光强度的增强，从而导致信噪比的提高，因此，交流振幅应尽可能高，同时考虑到高激光功率对压缩微通道潜在的热损伤，选择1Vpp的交流振幅作为最佳参数，对应此交流幅值，当直流偏置为交流幅度的一半时，载波保持完整的正弦波形，直流分量最小，产生最低水平的噪声，因此，在本发明中，在1Vpp的交流幅度下，选择了0.5V的直流偏置。然后将调制的荧光信号通过带有带通滤波器的光电倍增管将特定波长的荧光信号放大，由于移动单个细胞的持续时间估计为～10ms，通过时间常数设置为0.5ms的锁相放大器进行解调，保证了完整的单细胞波形，然后通过数据采集卡以80kHz的采样率对解调信号进行采样，PMT噪声估计为～10ns，因此采集单细胞脉冲后再次采用时间常数为0.5ms的低通滤波器和40点中值滤波器进一步去除噪声。
本实施例的原始数据处理方法如下：原始数据为将调制的荧光信号(见图2(A))，左图为一系列单细胞信号，右图展示的是左图以矩形框内的单个细胞信号放大图像，调制信号解调得到的单细胞脉冲(见图2(B))，同样的，左图为一系列单细胞信号，右图为左图矩形框内单个细胞脉冲放大图像，通过将采集到的单细胞脉冲拟合为梯形，代表单个细胞的每个脉冲被分为上升域、稳定域和下降域(见图2(B))。更具体地，基于曲线拟合，得到三个对应的时间参数Tr，Ts，Td和代表荧光强度的If参数。压缩微通道内的细胞拉伸长度Lc从关键时间和几何参数转换关系如下：
其中Wd表示了窗口的宽度，Ls表示具有方形横截面的压缩微通道的边长。
然后进一步获得细胞直径Dc如下：
抗体溶液的每个梯度浓度的荧光强度的平均值和标准偏差形成校准曲线(见图3)。在这些校准曲线中，荧光强度与荧光标记抗体的浓度呈线性相关，因此使用线性拟合来获得相应的校准方程。基于校准方程，以实验得到的荧光强度作为输入，荧光强度被转化为单个细胞的特定蛋白质浓度(Cp)(见图1中的(G))。
最后，基于细胞直径(Dc)和蛋白质浓度(Cp)，进一步获得了单细胞水平的特定蛋白质(np)数量(见图1中的(H))。
根据本发明的一个实施例，本发明中基于由信号发生器控制的激光源，不限于控制光源的仪器、光源的类型、数量或光路结构，也不限于激光聚焦的形式、形状或深度，只要满足形成适合的激光光斑区域，即可达到检测要求。
根据本发明的一个实施例，本发明中压缩微通道，不限于微流控通道的形状、尺寸或材料，只要满足细胞能够在压缩通道中进行合适的变形，能够符合校准模型，即可达到检测要求。
根据本发明的一个实施例，该发明中使用负压驱动细胞溶液通过通道，但是也可以使用其他方式，如在细胞溶液注入通道端施加正压。
尽管上面对本发明说明性的具体实施方式进行了描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，且应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
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