景天庚酮糖作为营养补给物的应用
阅读说明：本技术 景天庚酮糖作为营养补给物的应用 (Use of sedoheptulose as a nutritional supplement ) 是由 A·哈舍米 O·瓦格纳 C·纳吉 R·马尔库莱斯库 于 2014-03-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了景天庚酮糖作为营养补给物的应用。(The invention discloses the use of sedoheptulose as a nutritional supplement.)
本申请是2014年3月21日提交的、2015年11月12日进入中国国家阶段的、题为“景天庚酮糖作为营养补给物的应用”的中国申请201480028500.4的分案申请。
技术领域
本发明涉及营养补充领域。
背景技术
营养补充剂，也称为食品补充剂或营养补充剂，是制备用来在人类饮食中补充饮食和提供营养物质，如可能在人们饮食中缺失或不足的维生素、矿物质、纤维、脂肪酸，或氨基酸。有些国家规定膳食补充剂为食品，而在其他国家，它们被定义为药物或天然保健品。
含有维生素或膳食矿物质的补充剂包括在食品法典(国际公认的关于食品的标准、规范、准则，以及食品制备和食品安全的集合)的食品类别。这些文本是由食品法典委员会(由联合国粮食和农业组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)主办的组织)起草的。
美国人平均每星期消耗了惊人的千克糖(主要是葡萄糖)，考虑到蔗糖形式的高度精炼糖(砂糖)，葡萄糖(玉米糖)和高果糖玉米糖浆被加工成如此多的食物，如面包，早餐麦片，蛋黄酱，花生酱，番茄酱，通心面酱，和过多的微波膳食和饮料，因此这并不奇怪。
糖的主要缺点之一是，它提高了胰岛素水平，抑制生长激素的释放，从而使免疫系统下降。糖进入血液的流入扰乱身体的血糖平衡，引发胰岛素的释放，其中身体使用胰岛素以保持血糖在恒定和安全水平。胰岛素还促进脂肪的存储，这样，当你吃含糖量高的甜食时，你的行为会导致增重快和甘油三酯水平升高，这两者都与心血管疾病相关。复杂的碳水化合物倾向于被更慢地吸收，减少对血糖值的影响。
在习惯性基础上摄入糖产生健康危害是一定的。单糖，尤其是葡萄糖，已观察到加重哮喘，情感情绪波动，引发人格改变，鼓起精神疾病，使神经紊乱，导致糖尿病，促进心脏疾病，胆结石增长，促进高血压，并添加关节炎。
血糖指数，或升糖指数，(GI)提供了一种吃了特定类型的食品后测量血糖水平(即，血液中葡萄糖的水平)如何快速上升的方法。不同的食物对血糖水平有相当不同的影响。血糖指数评估：相对于消耗纯葡萄糖，食物中每克可得碳水化合物(碳水化合物总量减去纤维)使一个人在消耗食物之后的血糖水平升高多少。葡萄糖具有100的血糖指数。血糖指数的实际限制是：它并没有考虑到碳水化合物的实际消耗量。一个相关的措施，血糖负荷，通过使食物的升糖指数成倍增长而影响这一方面，问题在于实际食物中的碳水化合物含量。
低GI食物会比较缓慢和稳步地释放葡萄糖，这导致更适合的餐后血糖读数(饭后)。高GI食物会导致血糖水平更迅速地上升，并适合在运动后能量回收或人经历低血糖症。
食物的血糖效果取决于许多因素，如淀粉类型(直链淀粉与支链淀粉)，淀粉分子物理截留在食品中，食物中的脂肪和蛋白质含量以及餐品中的有机酸或它们的盐-例如加入醋，将降低GI。脂肪或可溶性膳食纤维的存在可以减缓胃排空率，从而降低GI。在一般情况下，具有更高量纤维的粗糙的颗粒感面包具有比白面包GI值低。然而，用100％全麦或全麦面粉制成的大多数面包具有的GI没有多少不同于仅含胚乳的(白)面包。许多褐色面包被酶处理以软化痂皮，使淀粉更容易获得(高GI)。
虽然添加脂肪或蛋白质会降低吃饭时的血糖反应，但相对差异仍然存在。即，添加或不添加，相比于低GI面包如裸麦粗，在食用高GI面包之后，仍然存在较高的血糖曲线。水果和蔬菜倾向于具有低血糖指数。血糖指数只能应用于食品，其中测试依赖于受试者食用含有50g可利用碳水化合物的食物的量。但是，许多水果和蔬菜(不是土豆，红薯，玉米)每典型份含有小于50g可利用碳水化合物。胡萝卜被原本并错误地报道为具有高GI。酒精饮料已被报道具有低GI值，但应该指出的是，啤酒具有适度的GI。最近的研究已经表明，在餐前饮酒将膳食的GI减少约15％。在测试前，适度饮酒超过12小时不影响的GI。
许多现代饮食依靠血糖指数。然而，其他人指出，通常被认为不健康的食品可以具有低血糖指数，例如，巧克力蛋糕，冰淇淋，或纯果糖，而在具有低的糖尿病率的国家食用的食物，如土豆和大米，具有大约100的GI。
本发明的一个目的是提供能够改善人体食物的能量代谢的营养补充剂。另一个目的是在考虑食品对代谢的影响下提供一种替代GI的食物分类指数。
发明内容
因此，本发明提供了景天庚酮糖作为细胞耗氧的营养诱导剂的应用。本发明还提供了景天庚酮糖用于细胞外酸化、糖酵解和乳酸酯形成的营养抑制剂的应用。本发明还提供了景天庚酮糖用于减少食品中血糖负荷的应用。本发明还提供了景天庚酮糖作为营养补充剂，特别是对维护健康个体缺乏景天庚酮糖缺陷的应用，即提供景天庚酮糖，而无需治疗或背景。
本发明利用了这一事实：游离景天庚酮糖是在人体中一个相关的和可得的碳源。此外，其磷酸化形式的生物可得性，景天庚酮糖-7-磷酸，似乎作为变阻器在糖酵解和戊糖磷酸途径的接口处用于己糖碳水化合物代谢以及用于线粒体呼吸。营养景天庚酮糖似乎平衡细胞对葡萄糖的消耗，脂肪燃烧，氧化还原调节，炎症，以及因此平衡相关疾病。
本发明示出，相比于所有目前使用的碳水化合物，包括常用的非热量和热量甜味剂，通过将景天庚酮糖加入食品中可以提供独特的营养价值。因此本发明旨在以平衡C6(更多)的消耗，从而防止肥胖或糖尿病并优化和增强免疫功能和能量利用率。因此，根据本发明的“营养”补充是通过将景天庚酮糖加入食品而用于“提供或改善养分利用”，并由此提供新的和改进的具有景天庚酮糖含量的食品(通过(进一步)提高景天庚酮的含量来改善食品)。因此，本发明的C7营养补充提供了处理生理氧化还原调控的有效策略，从而还可以处理相关的代谢紊乱或障碍。因此，本发明显著不同于低热甜品或红糖替代品应用(在WO2006/027796A2和WO 2006/093848 A2中教导)。
如前所述，今天的食品工业使用大量C6糖(C6糖是葡萄糖，果糖和蔗糖和麦芽糖(作为相应二聚体))作为营养补充剂。大多数这些己糖被用作甜味剂(即不是作为“营养”补充，但作为味道或风味增强剂)，并且广泛讨论为可以提高心血管疾病，阿尔茨海默氏病，代谢综合征，肥胖症和糖尿病的风险。C6/C7碳水化合物的比例是通过过度C6应用而扰乱的。添加C7(即主要景天庚酮糖，但是，也可以与其他C7糖组合，尤其是甘露庚酮糖；除了景天庚酮糖自身之外，C7可以被定义为“具有或不具有甘露庚酮糖的景天庚酮糖，景天庚酮糖/甘露庚酮糖％w/w比为至少10.000：1，优选为至少1.000：1，特别是至少100：1”)将平衡升高的血糖-负载。C7不如C6甜，但因此也不会显著改变补充食物的味道。C7碳水化合物在细胞碳水化合物和脂肪的代谢中具有鲜明的功能，并由此影响营养以及在脊椎动物中医疗保健相关的方面。
因此，本发明提供的教导是：将C7加入饮食导致人类和小鼠的代谢得以改善和平衡。根据本发明的含C7的营养补充剂在涉及保健相关的问题时具有明显的改变偏爱C6甜食品的潜能。
本发明还提供了一种用于营养效力的新的参数，C6/C7比率，其可用于天然和化学设计的标准饮食以及天然和化学设计的食品成分。通过本发明，还证实了：C7消耗影响了能效，影响了组织健康和炎症。此外，通过本发明引入和提供的C7消费还影响身体耐力，生理氧化还原调节，从而也影响相关病症，例如糖尿病和肥胖症。
景天庚酮糖(CAS号：3019-74-7；PubChem数据库：5459879；ChemSpider：4573620；MeSH：景天庚酮糖；ChEBI：CHEBI：16802)或正景天庚酮糖(D-altro-heptulose)是庚酮糖-具有七个碳原子和酮官能团的单糖。它是在自然界中发现的少数庚糖之一。景天庚酮糖可从天然来源进行提取或通过化学合成而生产。它可被纯化到高纯度(如>60％纯度，优选>85％纯度，更优选>90％纯度，更优选>95％纯度，甚至更优选>99％的纯度，尤其是>99.9％纯度)。
景天庚酮糖，相对于其磷酸化形式景天庚酮糖-7-磷酸(S7P)，是一种相对未知代谢物，它被认为是主要葡萄糖代谢的中间分子。天然存在的景天庚酮糖首先被报道存在于植物中，后续被鉴定存在于人尿液、血斑点中，最近被报道存在于小鼠细胞中。S7P衍生自核糖-5-磷酸(R5P)和木酮糖-5-磷酸(X5P)的转酮酶催化转化。该反应发生在戊糖磷酸盐通路的非氧化臂，并且除了S7P之外，还生成甘油醛-3-磷酸(G3P)，关键的糖酵解中间体。G3P和S7P也通过使用果糖-6-磷酸(F6P)和赤藓糖-4-磷酸(E4P)作为底物，进行转醛醇酶而制备得到。因此S7P是非氧化PPP和S7P生物利用度中的关键中间体，因此有助于细胞碳通量。最近，从多组数据表明，景天庚酮糖激酶还可以通过景天庚酮糖的直接磷酸化产生S7P(Haschemi等人，Cell Metab.15(2012),813-826)。这一发现表明意想不到的存在景天庚酮这种额外的碳源，其积极地参与细胞碳代谢。(Nagy和Haschemi,Biochem SocTrans.2013)。
游离的景天庚酮糖的食物来源可以是水果和蔬菜，或通过内源产生S7P的去磷酸化而酶促形成的。至今，还没有报道特异性景天庚酮糖转运体提或S7P特异性磷酸盐。其他生物活性庚糖包括酚类化合物7-O-没食子酰基景天庚酮糖(7-O-Galloyl-sedoheptulose，GS)、甘露庚酮糖和葡庚糖(glucoheptose)。据报道，GS通过减轻炎症反应从而保护肾脏糖尿病损伤。甘露庚酮糖(多个专利申请)是景天庚酮糖的异构体并且是在鳄梨中发现的有效的己糖激酶抑制剂。葡庚糖，尽管该化合物的化学性质仍然不明，但已经显示出可以作为家兔的碳水化合物来源。景天庚酫聚糖(sedoheptulosan)是景天庚酮糖的酸酐，也可以作为游离景天庚酮糖的来源。
游离的景天庚酮糖可以例如从植物景天中分离得到，并且在先前已报道含有高量的庚糖-碳水化合物。
景天庚酮糖激酶将游离的景天庚酮糖磷酸化，使细胞直接通向景天庚酮糖以进行碳水化合物代谢，类似于己糖激酶和葡萄糖。根据本发明，景天庚酮糖是供给主要碳水化合物分解代谢和合成代谢的直接碳源，其中景天庚酮糖激酶(CARKL)构成其切入点。因此，景天庚酮糖可以令人惊奇地与葡萄糖和果糖相当，因为这些化合物都作为游离碳水化合物和磷酸化形式存在。为了进行代谢，游离的碳水化合物通过初始磷酸化事件被充分激活。己糖激酶使葡萄糖磷酸化形成G6P，是细胞葡萄糖流量的关键决定性因素。果糖是由已酮糖激酶(ketohexokinase)磷酸化，从而形成果糖-1-磷酸(F1P)，它必须首先通过醛缩酶被转化为甘油醛和二羟基丙酮磷酸(DHAP)。随后DHAP可以直接进入碳循环，而甘油必须进一步被磷酸化。按照类似于通过己糖激酶由葡萄糖形成G6P的方式，通过景天庚酮糖激酶由景天庚酮糖形成S7P，能够使游离的景天庚酮糖容易地进入分解代谢系统。还报道了在高S7P浓度存在下发生F6P磷酸化竞争抑制。有趣的是，含有果糖1,6-二磷酸酶(FBPase)的部分也被报道具有景天庚酮糖1,7-二磷酸酶(SBPase)活性。
因此，本发明还建立在己糖-和庚糖-(二)磷酸盐分路的共存的基础上。值得注意的是，高葡萄糖水平或利用F2,6bP进行孵化分别增强灌注大鼠肝脏和大鼠肝细胞质中的Sl,7bP的形成。胰高血糖素，相对于高葡萄糖而言，青睐Sl,7bP脱磷酸作用，由此形成S7P。这些结果表明，景天庚酮糖代谢对激素控制是敏感的。
景天庚酮糖代谢参与代谢调节；事实上，景天庚酮糖通过提供独立地来自葡萄糖的S7P供应从而指示代谢通量。增加CARKL表达的小鼠巨噬细胞系(因此，也增加景天庚酮糖消费)导致G3P、X5P和R5P稳态水平下降，而CARKL下降呈现出相反的效果。值得注意的是，基本景天庚酮糖水平没有由于CARKL扰动而改变。S7P水平没有通过过度表达而改变，但由CARKL损失发生了显著下降，表明景天庚酮糖磷酸化作为糖酵解衍生G3P分布的限速因素。因此，S7P可用性的调节可能是这样的机制，通过该机制，CARKL或过量的景天庚酮糖调节细胞代谢。
因此，本发明涉及C7用于平衡C6-(过度)消耗、肥胖、糖尿病、免疫功能和-通常的-脊椎动物能量利用的应用。因此C7补充剂还提供了管理生理氧化还原调节以及相关病症的有效策略。利用本发明，事实证明，高景天庚酮糖、高景天庚酮糖激酶二者都能够增强景天庚酮转换。此外，景天庚酮糖激酶的组织表达表明了代谢器官(如肝或脂肪组织)具有消耗景天庚酮糖的能力。此外，相比于白色脂肪组织，褐色脂肪组织(燃烧大量的脂肪)表达显著更多的(约2.5倍)景天庚酮糖激酶。
景天庚酮(和/或其他庚糖)，施用于患有炎症或处于患有炎症风险的患者，最大限度地减少了血糖负荷和积极地有助于防止例如饮食诱导的肥胖和/或糖尿病。此外，转基因景天庚酮糖激酶的动物数据，-作为增强景天庚酮糖代谢的模型-，表明了高景天庚酮糖代谢提高脂质氧化(由低RQ值表示)。这是提高景天庚酮转换的有益效果。同时，能量消耗较低的动物具有较高的景天庚酮糖转换。此外，相比于对照动物，似乎CARKL过度表达的小鼠对胰岛素更加敏感。一并考虑，这再次表明，景天庚酮糖代谢是调节脊椎动物代谢表型的有效手段。
利用本发明，可以显示特定的和令人惊讶的抗炎效应，这是由高景天庚酮糖转换引起的：增强的炎症在疾病(例如肥胖相关疾病，如胰岛素抵抗)的发展中起重要作用。在功能激酶筛选以用于巨噬细胞活化的新调节剂中，景天庚酮糖激酶被发现抑制脂多糖(LPS)诱导的肿瘤坏死因子α的分泌。在同一筛选中，己糖激酶、酮己糖激和磷酸果糖激酶(高葡萄糖/果糖代谢)的过表达具有相反的效果。这表明己糖和庚糖-碳水化合物代谢的相反效果：庚糖抑制炎症。此外，增加的CARKL表达抑制LPS诱导的巨噬细胞活化，并导致细胞内迟钝超氧形成，而CARKL(模拟物降低景天庚酮糖代谢)的损失加强了那些细胞的炎症反应。
另一方面，本发明还涉及预防所有类型的景天庚酮糖不足，特别是那些尚未导致病理学后果的不足，消除景天庚酮不足，使由于这样的景天庚酮不足导致的病症得以预防。为了防止这种景天庚酮糖不足，可以将含景天庚酮糖的组合物施用于处于这种景天庚酮糖不足(景天庚酮糖不足综合征)发展的个体，或没有这种风险的健康个体，例如，作为营养补充剂或与食物和/或饮料组合施用。
根据本发明的优选实施方案，其中将景天庚酮糖添加到已经含有景天庚酮糖的食品中，使得所述食品的景天庚酮糖含量提高至少10％，优选使得所述食品的景天庚酮糖含量提高至少100％，尤其提高至少500％。
可供替代的是，如果将景天庚酮糖添加到不含有景天庚酮糖的食品中，优选所述食品获得的景天庚酮糖含量为至少0.001％w/w，优选为至少0.01％w/w，更优选为至少0.1％w/w，还更优选为至少1％w/w，尤其为至少10％w/w。
如果食品是液体食品，例如饮料(软饮料)，景天庚酮糖含量还可以是％w/v比。因此，本发明的优选实施方案中饮料的，景天庚酮糖含量是至少0.001％w/v，优选为至少0.01％w/v，更优选为至少0.1％w/v，还更优选为至少1％w/v，尤其为至少10％w/v。因此，下文提到的“重量比”是指液体食品的％w/w和％w/v值。
例如，对于其中不基于天然水果(或蔬菜)材料(果汁)的通常软饮料，只需添加最小量的景天庚酮糖来改善景天庚酮糖含量。对于本发明的目的“软饮料”是通常包含水(通常，但不总是，碳酸水)、常规的甜味剂和常规的调味剂，但没有果汁的饮料(这些被称为“本发明内的果汁，但为了本发明的目的保留的明显差别)。软饮料中的甜味剂可以是糖，高果糖玉米糖浆，果汁，糖代用品(以减肥饮料的情况下)或它们的某些组合。软饮料也可能含有咖啡因，色素，防腐剂等成分。由于软饮料(如本发明所定义)不含景天庚酮糖(即，具有的景天庚酮糖含量适当地低于0.001％w/w或％w/v)，本发明的优选实施方案是这样软饮料：其具有的景天庚酮糖含量为0.001％w/w(或％w/v)或更高，优选至少0.01％w/w(或％w/v)，更优选至少0.1％w/w(或％w/v)，还更优选至少1％w/w(或％w/v)，尤其至少10％w/w(或％w/v)。
根据本发明，可以分析食品中C6碳水化合物的％w/w,％w/v或摩尔浓度，尤其是葡萄糖、果糖和蔗糖以及麦芽糖各自的二聚体，分析C7碳水化合物的w/w,％w/v含量或摩尔浓度，尤其是景天庚酮糖，任选甘露庚酮糖，建立该食品的C6碳水化合物的/C7碳水化合物之比(按％w/w:％w/w,％w/v:％w/v或摩尔比计)，其中将具有或不具有甘露庚酮糖的景天庚酮糖添加到该食品中，添加量使C6碳水化合物的/C7碳水化合物之比下降(in％w/w:％w/w,％w/v:％w/v或摩尔比)至少50％,优选至少100％,尤其至少200％。优选的是，食品中重量比(即％w/w和/或％w/v)下降至使所得C6/C7重量比为或低于2000％:1％,优选所得C6/C7重量比为或低于100％:1％,更优选所得C6/C7重量比为或低于10:1,尤其所得C6/C7重量比为或低于1％:1％。可供替代的是，还可以相应的降低摩尔浓度之比，例如优选使食品中的摩尔比下降至使所得C6/C7摩尔比为或低于2000:1,优选所得C6/C7摩尔比为或低于100:1,更优选所得C6/C7摩尔比为或低于10:1,尤其所得C6/C7摩尔比为或低于1:1(必须指出的是％值之比与这些值之比是一致的，即2000％:1％＝2000:1)。
因此，提供了使用本发明方法的新食品。例如，利用本发明提供的新生产的软饮料或橙汁或苹果汁具有所得C6/C7摩尔比为或低于2000:1。根据本发明的食品的其他优选实施方案具有的C6/C7重量比或摩尔比为或低于3000:1,优选为或低于2500:1；例如源自软饮料的含有水果汁的饮品(即，基本上不含任何景天庚酮糖)，例如橙汁或苹果汁，例如的量为5至50％。因此，本发明还涉及这样的软饮料，C6碳水化合物/C7碳水化合物之比(按％w/w:％w/w,％w/v:％w/v或摩尔比计)中C6/C7重量比或摩尔比为或低于3000:1,优选为或低于2500:1。
几乎任何食品(术语“食品”包括可被人类营养使用的任何摄取物,包括食品，饮料等)可以按照本发明通过加入景天庚酮糖加以改进。优选，所述食品选自由以下选项组成的组：营养饮料、营养小吃、减肥食品产品、谷类食品、软饮料、运动饮料、能量饮料、营养甜味剂、糖果、糕点、奶制品、果酱或功能性食品，包括快餐。
根据另一方面，本发明还涉及由本发明改善的食品。如已经陈述的那样，市场上几乎所有食品都可以通过本发明改善。本发明提供的新食品具有景天庚酮糖含量，或者如果可得的食品已经具有景天庚酮糖，则具有提高的景天庚酮糖含量。因此，本发明还涉及添加有景天庚酮糖的食品，其中相比于未添加景天庚酮糖的食品，景天庚酮糖含量提高至少10％w/w,优选至少20％w/w,尤其为至少30％w/w。优选的是，相比于未添加景天庚酮糖的食品，景天庚酮糖含量提高至少50％w/w,优选至少100％w/w,尤其为至少200％w/w。此外，这些数据还可用于液体食品，例如饮料，按％w/v之比计(即，例如这样的饮料，其中相比于未添加景天庚酮糖的食品，景天庚酮糖含量提高至少50％w/v,优选至少100％w/v,尤其为至少200％w/v)。
如果得自现有技术的食品最初不含景天庚酮糖，根据本发明，可以添加景天庚酮糖以使所述食品的景天庚酮糖含量为至少0.001％w/w或％w/v,使所述食品的景天庚酮糖含量为至少0.01％w/w或％w/v,更优选为至少0.1％w/w或％w/v,还更优选为至少1％w/w或％w/v,尤其为至少10％w/w或％w/v。当然，景天庚酮糖含量甚至可以更高，这取决于食品的性质(糖果等)。
优选的是，根据本发明的食品选自由以下选项组成的组：营养饮料、营养小吃、减肥食品、谷类食品、软饮料、运动饮料、能量饮料、营养甜味剂、糖果、糕点、乳制品、果酱或功能性食品。
根据另一方面，本发明提供了一种建立食品的C6-碳水化合物/C7-碳水化合物之比(％w/w:％w/w、％w/v:％w/v或摩尔比)的方法，通过以下方式实施：分析食品的C6-碳水化合物，特别是葡萄糖和果糖，并且分析食品的C7-碳水化合物；计算所述食品中C6-碳水化合物/C7-碳水化合物之比(％w/w:％w/w、％w/v:％w/v或摩尔比)；以及优选将该数据记录在数据载体上或将该比例打印到打印基材上；将所述数据载体或所述打印基材与所述食品组合。
根据该方面的变体，本发明还提高了建立和调节食品中C6-碳水化合物/C7-碳水化合物之比(％w/w:％w/w、％w/v:％w/v或摩尔比)的方法，该方法通过以下方式实施：分析食品的C6-碳水化合物，特别是葡萄糖和果糖，并且分析食品的C7-碳水化合物；计算所述食品中C6-碳水化合物/C7-碳水化合物之比(％w/w:％w/w、％w/v:％w/v或摩尔比)；然后将景天庚酮糖添加到所述食品中，添加量为使所述食品的C6-碳水化合物/C7-碳水化合物之比(％w/w:％w/w、％w/v:％w/v或摩尔比)下降至少10％，优选至少50％，尤其至少100％；以及优选地，将该数据记录在数据载体上或将该比例打印到打印基材上；将所述数据载体或所述打印基材与所述食品组合。如上所述，优选的是，可以降低食品中的重量比或摩尔比，使所得C6/C7之比为至少2000％:1％,优选使所得C6/C7之比为至少10％:1％,尤其使所得C6/C7之比为至少1％:1％。
根据另一方面，本发明还涉及一种含有景天庚酮糖的腹膜透析溶液，其浓度为0.001至500mg/ml，优选0.01至300毫克/毫升，特别是0.1至150mg/ml。
更具体地，本申请涉及：
1.景天庚酮糖作为细胞耗氧的营养诱导物的应用。
2.景天庚酮糖作为胞外酸化、糖酵解和乳酸酯形成的营养抑制剂的应用。
3.景天庚酮糖用于降低食品中血糖负荷的应用。
4.景天庚酮糖作为营养补给物的应用，尤其是用于保障健康个体的景天庚酮糖不足的缺乏的应用。
5.根据项1-4中任一项所述的应用，其中将景天庚酮糖添加到已经含有景天庚酮糖的食品中，使得所述食品的景天庚酮糖含量提高至少10％，优选使得所述食品的景天庚酮糖含量提高至少100％，尤其提高至少500％。
6.根据项1-5中任一项所述的应用，其中将景天庚酮糖添加到未含有景天庚酮糖的食品中，使得所述食品的景天庚酮糖含量为至少0.001％w/w，优选为至少0.01％w/w，更优选为至少0.1％w/w，还更优选为至少1％w/w，尤其为至少10％w/w；或者对于液体食品，从而获得所述食品的景天庚酮糖含量为至少0.01％w/v，更优选为至少0.1％w/v，还更优选为至少1％w/v，尤其为至少10％w/v。
7.根据项1-6中任一项所述的应用，其中食品中的景天庚酮糖按以下方式分析：按％w/w、％w/v或摩尔浓度分析食品中C6-碳水化合物含量，尤其是葡萄糖、果糖及其各自的二聚体，并且按％w/w、％w/v或浓度分析C7-碳水化合物含量，建立所述食品的C6-碳水化合物/C7-碳水化合物之比(％w/w:％w/w、％w/v:％w/v或摩尔比)，并且其中，所述食品中景天庚酮糖的加入量是能够使C6-碳水化合物/C7-碳水化合物之比(％w/w:％w/w、％w/v:％w/v或摩尔比)下降至少50％，优选下降至少100％，尤其下降至少200％。
8.根据项1-7中任一项所述的应用，其中所述食品选自由以下选项组成的组：营养饮料、营养小吃、减肥食品、谷类食品、软饮料、运动饮料、能量饮料、营养甜味剂、糖果、糕点、乳制品、果酱或功能性食品。
9.添加有景天庚酮糖的食品，其中，相对于未添加景天庚酮糖的所述食品，所述景天庚酮糖含量被提高至少10％w/w，优选至少20％w/w，尤其提高至少30％w/w。
10.根据项9所述的食品，其中相对于未添加景天庚酮糖的所述食品，所述景天庚酮糖含量被提高至少50％w/w，优选至少100％w/w，尤其提高至少200％w/w。
11.最初不含景天庚酮糖的食品，其中已经添加有景天庚酮糖，从而使所述食品的景天庚酮糖含量为至少0.001％w/w，优选获得所述食品的景天庚酮糖含量为至少0.1％，更优选为至少1％，尤其为至少10％。
12.根据项9-11中任一项所述的食品，其中所述食品选自由以下选项组成的组：营养饮料、营养小吃、减肥食品、谷类食品、软饮料、运动饮料、能量饮料、营养甜味剂、糖果、糕点、乳制品、果酱或功能性食品。
13.一种建立食品的C6-碳水化合物/C7-碳水化合物之比(％w/w、％w/v或摩尔浓度)的方法，通过以下方式实施：分析食品的C6-碳水化合物，特别是葡萄糖和果糖，并且分析食品的C7-碳水化合物；计算所述食品中C6-碳水化合物/C7-碳水化合物含量之比(％w/w:％w/w、％w/v:％w/v或摩尔浓度)；以及优选将该数据记录在数据载体上或将该比例打印到打印基材上；将所述数据载体或所述打印基材与所述食品组合。
14.一种建立和调节食品中C6-碳水化合物/C7-碳水化合物之比(％w/w:％w/w、％w/v:％w/v或摩尔浓度)的方法，该方法通过以下方式实施：分析食品的C6-碳水化合物，特别是葡萄糖和果糖，并且分析食品的C7-碳水化合物；计算所述食品中C6-碳水化合物/C7-碳水化合物含量之比(％w/w:％w/w、％w/v:％w/v或摩尔浓度比)；然后将景天庚酮糖添加到所述食品中，添加量为使所述食品的C6-碳水化合物含量/C7-碳水化合物含量之比(％w/w:％w/w、％w/v:％w/v或摩尔浓度比)下降至少10％，优选至少50％，尤其至少100％；以及优选地，将该数据记录在数据载体上或将该比例打印到打印基材上；将所述数据载体或所述打印基材与所述食品组合。
15.根据项14所述的建立和调节食品中C6-碳水化合物/C7-碳水化合物重量比的方法，其中降低所述食品的重量比(％w/w和/或％w/v)，使得所得C6/C7重量比为或低于2000％:1％，优选使所得C6/C7重量比为或低于100％:1％，更优选使所得C6/C7重量比为或低于10％:1％，尤其使所得C6/C7重量比为或低于1％:1％。
16.根据项14所述的建立和调节食品中C6-碳水化合物/C7-碳水化合物摩尔比的方法，其中降低所述食品的摩尔比，使得所得C6/C7摩尔比为或低于2000:1，优选使所得C6/C7摩尔比为或低于100:1，更优选使所得C6/C7摩尔比为或低于10:1，尤其使所得C6/C7摩尔比为或低于1:1。
17.通过项14-16中任一项所述的方法获得的食品。
18.具有C6-碳水化合物/C7-碳水化合物之比(％w/w:％w/w、％w/v:％w/v或摩尔比)的软饮料，C6/C7重量比或摩尔比为或低于3000:1，优选为或低于2500:1。
附图说明
结合以下实施例和附图对本发明进一步描述，但本发明并不限于此。
图1：(A)通过气体色谱联用质谱对来自胡萝卜或室内生长景天植物叶子的汇集样品进行分析，从而具体地测量相对葡萄糖(C6)和景天庚酮糖(C7)的水平。通过除以各自的峰面积来计算C6/C7的比值。(B)在摄取食物之前和之后，通过GC-MS进一步评价各个血清中景天庚酮糖和葡萄糖水平，从而评估是否源自饮食的C7可进入人体血液流。禁食四夜(禁食)的个人的景天庚酮糖和葡萄糖水平(空白栏)与食用主要含有红萝卜(克)以及一些橄榄油、盐和胡椒的膳食之后2小时所测得的水平(供给食物，灰色栏)进行比较。血清中碳水化合物含量的变化表示为平均倍数变化(n＝4，+/-S.D.)。(C)葡萄糖、果糖和景天庚酮糖的浓度是所示饮料的碳水化合物提取物中测定的。四次重复测定的平均值用于证明所提取的糖浓度。此外(D)，C6/C7(景天庚酮糖)之比是通过由各自景天庚酮糖(C7)单元除以葡萄糖和果糖(C6)的分子或重量的总和而建立的(NA＝不适用)。
图2：(A)标准化景天庚酮糖激酶的印迹
历时48小时，小鼠肝(CARKL)mRNA的表达水平是通过公众可得的“节律基因表达数据CIRCA库(Circadian Gene Expression Database-CIRCA)”获得。Y轴表示标准化的基因表达，并且X轴表示小时时间。(B和C)经扰动CARKL(perturbed CARKL)表达的还原和氧化的细胞烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的水平是根据先前记录的代谢数据计算的(Haschemi等人，15(2012)，813-826)。RAW264.7细胞系,(B)通过过表达来表达高CARKL水平或(C)通过shRNAmir表达来表达低CARKL水平，与个别控制细胞系进行比较，从而说明CARKL介导的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸调节。数据代表三个独立实验的平均倍数变化+/-SEM。(D)CARKL mRNA水平是在小鼠组织的cDNA文库中测定的。数据表示相对于胸腺CARKL表达的倍数变化而标准化的(对β-肌动蛋白)平均CARKL表达(所有组织，n＝3，S.D.)。
图3：(A-E)原代人脂肪细胞是通过在葡萄糖和果糖(GF，每种糖1.5g/L；总碳水化合物为3g/L)或景天庚酮糖补充培养基的存在下通过基质血管细胞部分分化得到的，将其称为GFS(各糖的lg/L；总碳水化合物为3g/L),为期八天。接着是(A)CARKL的mRNA水平。通过RT-PCR评估(B)脂联素和(C)解偶联蛋白1(UCP-1)，并将各组进行比较。在所示碳水化合物混合物存在的情况下记录脂肪细胞的(D)细胞耗氧率(OCR)和(E)细胞外酸化速率(ECAR)(平均值+/-S.D.,n＝9-ll)。(F)肿瘤坏死因子α(TNFa)和(G)在含有GF或GFS碳水化合物混合物的细胞培养基中培养三天的成熟鼠脂肪细胞的白细胞介素6(IL-6)mRNA表达水平，或(H)原代鼠肝细胞的IL-6表达，以及(Ⅰ)初级骨髓衍生的巨噬细胞的TNFa和(J)IL-6mRNA水平(这两种细胞类型均在GF或GFS介质中预培养两天)各组之间进行比较。通过ELISA，测定骨髓源巨噬细胞的上清液中在超过两天的期间分泌的(K)TNFa和(L)IL-6细胞因子。还通过ELISA测定(M)TNFa活化2小时后和(N)IL-6活化6小时后的LPS诱导(100ng/ml)的分泌。数据表示平均值+/-S.D.,n＝3)
图4：在体外激酶测定中，其采用ADP形成作为活性读数，在恒定的ATP(150μΜ)浓度，景天庚酮糖转换率可以(A)通过提高景天庚酮糖浓度或者(B)通过提高限速酶景天庚酮糖激酶(CARKL)的量来加强。在记录这些细胞的基础(C)ECAR和(D)OCR之前，将来自野生型(wilt-type)(WT)和过表达景天庚酮糖激酶CARKL的小鼠的肝细胞(C-E)在含有GFS的培养基中预培养两天。(E)将来自两个遗传链(CARKL和WT对照)的肝细胞在含有GF或GFS的介质中培养，随后预饥饿(无碳水化合物)1小时，由此在添加葡萄糖达到培养介质平均值+/-S.D.,n＝7-ll)的最终浓度lg/L之后，测量葡萄糖诱导ECAR。对于代谢体内指标(F)，通过间接测热法测定每次活动的呼吸商(RQ)和(G)能量消耗(EE，千卡/天/kg^0.75)并在白天(上午8时至下午4时)和夜间(晚上8点到凌晨4点)，将CARKL与野生型(WT)同胎仔畜相比较。数据表示平均值，n＝3,+/-SD。(H)小鼠胰岛素耐受性试验是在预饥饿(4H)女性腹腔CARKL转基因中和野生型同胎仔对照中通过i.p.注射胰岛素0.75U/kg体重来进行的。注射前测量血糖(对照)并在注射后15，30，45和60分钟测量血糖，以占对照的相对百分值绘图。数据表示平均值+/-SD,n＝3-4。
图5：在肝细胞中分离无论从WT或CARKL过表达的小鼠和培养在控制介质(GF)脂质沉积是可视化油红染色。用20倍物镜获得代表性显微照片。(B)的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性的测定在肝细胞中从任一WT或CARKL过表达小鼠中分离并在对照培养基(GF)培养两天。箭头指示重新定位G6PD活性。用10×物镜获得代表性显微照片。(C和D)来自WT或过量表达CARKL的小鼠的破骨细胞分化并在含GF或GFS介质中在康宁骨测定板中培养7天。通过计数每孔中所有陷窝(其在20倍的放大倍率下是可见的)来评估它们的吸收活性。数据表示平均值n＝2-3,+/-SD。(D)示出了在含有GF或GFS介质中培养的WT破骨细胞中发现的最大吸收陷窝的两个代表性图像。显微图被放大40倍。
图6：(A)过表达景天庚酮糖激酶的小鼠(CARKL)和对照同窝仔畜的免疫系统对抗亚致死的脂多糖注射(LPS，7mg/kg)，并且血清免疫激活后24小时后，测量具有19个细胞因子的板。数据表示通过利用小鼠细胞因子检测分析器在野生型(WT＝100％)和CARKL血清中测得的各个细胞因子的相对的平均荧光强度(MFI)(n＝3,+/-SD)。鼠科成熟脂肪细胞的单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和TNFαmRNA表达是从WT和CARKL小鼠的(B和C)皮下或(D和E)附睾白脂肪组织中分离出来的。数据表示平均值，n＝3,+/-SD。(F)发病中风和rs465563基因型发生率。数据通过Pearson的X2测试进行比较。**...p<0.01.(G)采用Kaplan-Meier曲线评估最初的无中风存活的时间。rs465563纯合的各个个体：[G]-等位基因显示出，与[A]-等位基因的载体相比，具有显著较短的无事件时间。
具体实施方式
实施例
材料和方法
碳水化合物
葡萄糖和果糖是从Sigma Aldrich购得。景天庚酮糖是从植物景天或紫景天分离的(Haschemi等人，Cell Metab.15(2012),813-826)，并通过色谱法进一步纯化。
胡萝卜和人血清中的葡萄糖和景天庚酮糖测量
具有奥地利的“有机认证”的新鲜胡萝卜被切成小块，并快速冷冻在液氮中。相同的步骤也用于从室内生长景天植物新鲜收获的叶片。通过玻璃珠将各组织的三个样品合并和均化成粉末。样品的碳水化合物富集部分是通过利用掺有13C标样的20％H2O和80％甲醇萃取溶液分离的，并利用标准气体色谱耦合质谱(GC-MS)进行处理。葡萄糖和景天庚酮糖是由它们各自的质量确定的，并且它们的相对量是由每个单独的分析物相对于13C含量而标准化的峰面积得到的。还测定了来自隔夜禁食或喂食胡萝卜的个体的等体积血清中的葡萄糖和景天庚酮糖。将胡萝卜蒸熟，并使用一些橄榄油、盐和胡椒粉以调节味道。食用胡萝卜饭两小时前和两小时后，在Z血清Sep血液管中准备人血清。按照先前描述描述的那样处理血清样品，并且如上详细描述的那样通过GC-MS进行分析，在Ruiz-MatuteAI等人，Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.(2011)May 15 879(17-18)中有所描述。
饮料中葡萄糖、果糖和景天庚酮糖浓度
指示饮料是从当地的杂货店购买的并且均预填充。将各饮料1毫升(每种等分为四次重复测定)等分并在SpeedVac中真空浓缩。接着进行MeOH/H2O(80:20)沉淀和离心步骤，以清除上清液中的沉淀物，使碳水化合物部分澄清。每个上清液在SpeedVac中再冻干，在等体积水中再次水化，并合并重复测定。对于碳水化合物分析，采用CARBOPAC PA1柱(250x4毫米)和CARBOPAC PA1保护柱(二者都来自戴安)，流速为1mL min-1，利用Dionex ICS-3000的DC无金属系统。前20分钟，利用16mM NaOH进行等度洗脱。随后20-40分钟，利用至100mMNaOH的线性梯度接着在两分钟以上升高至200mM，直到47分钟。利用16mM NaOH的起始条件再次达到49分钟并保持，直到70分钟。脉冲安培检测的参数精确地按照得自Dionex的技术说明21进行(使用DionexED40电化学检测器，脉冲安培检测碳水化合物的最佳设置)。根据真实的葡萄糖，果糖和景天庚酮糖的标准色谱，对色谱图进行了评价，各自为100μΜ。
人体脂肪细胞培养
如先前描述的那样(Lindroos等人，Cell Metab.(2013),Jul2；18(1):62-74.)，来自进行腹部外科手术的患者的皮下白色脂肪组织中的基质血管基质部分细胞(SVFs)被分离出来。简要的说，脂肪组织被胶原酶II(沃辛顿)消化并过滤。通过离心,从成熟脂肪细胞中分离出SVF,随后使红细胞在SVF-馏分中裂解(Buffer EL,Qiagen)。纯化的SVF在DMEM/F12,10％FBS中培养(Gibco,生命技术)。当细胞达到汇合时，它们被DMEM/F12的w/o葡萄糖(Biowest)洗涤，并将培养基换成DMEM/F12，总碳水化合物负荷为3g/L，含有1.5g/L葡萄糖和果糖或分别含lg/L葡萄糖、果糖和景天庚酮糖。汇合两天之后(第0天)，通过添加1μΜ地塞米松、1.74μΜ胰岛素、5μΜ曲格列酮、0.5μΜIBMX、17μΜ泛酸和生物素33μΜ诱导分化。两天后，IBMX和地塞米松被忽略，在第4天除去胰岛素和曲格列酮。在第6天替换50％的介质。两天后，收获细胞，用于RNA分离(RNeasy小型试剂盒，Qiagen公司)。
成熟的小鼠脂肪细胞的上限培养
从转基因CARKL-小鼠和野生型同窝对照中分离出前部和后部皮下脂肪组织和附睾白脂肪组织。如上述的人类样本那样，消化脂肪组织。离心后，除去漂浮有成熟脂肪细胞的层，并在lOOrcf下重新离心10分钟。在6孔板下浮动盖玻片中，在DMEM/F12中，15％小牛血清(PAA)中，培养150μL填充脂肪细胞。隔离24小时后，将孔用PBS洗涤两次，将培养基更换为DMEM/F12，总碳水化合物负荷为3g/L，含有1.5g/L葡萄糖和果糖，或分别含有1g/L的葡萄糖，果糖和景天庚酮。三天后，利用TRIreagent(Sigma)收获细胞用于RNA分离。
肝细胞培养
通过肝原位胶原酶灌注小鼠之后，从雄性野生型和过表达CARKL小鼠中分离出肝细胞，灌注之后，肝脏被迅速除去，切碎后处死，并通过细胞过滤网(Fisher Scientific公司，)过滤到50ml无菌管中。通过离心步骤，将所得滤液中的肝细胞与非实质细胞分离，从而纯化。分离的肝细胞以0.25x106/ml的浓度接种到板中，各DMEM介质包含10％FBS，表示碳水化合物混合物为3克/升(葡萄糖和果糖(GF)；或葡萄糖，果糖和景天庚酮糖(GFS))。至少2天后进行试验。
骨髓来源的巨噬细胞和破骨细胞培养
从雄性野生型和过表达CARKL的小鼠中分离出小鼠骨骼并冲刷骨髓，洗涤并通过裂解清除红血细胞，随后在含有25mM的葡萄糖和20纳克/毫升M-CSF的DMEM中分。4天后，收获用于破骨细胞分化的细胞，并接种在具有分化培养基的康宁骨测定板上(见下文)，对于原发性骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)，将培养基更新并进一步补充M-SCF两天。然后将经分化的BMDM接种到各自含有10％FBS的DMEM介质中，显示出碳水化合物混合物为3克/升(葡萄糖和果糖(GF)，或葡萄糖，果糖和景天庚酮糖(GFS))，至少两天后进行试验。
体外骨吸收测定
在10ng/ml M-CSF和100ng/ml的RANKL存在下，将破骨细胞的前体细胞(20ng/mlM-CSF4治疗骨髓细胞4天)接种于24孔康宁骨试验板的含有10％FBS和3g/L葡萄糖和果糖(GF)，或葡萄糖、果糖和景天庚酮糖(GFS)的α-MEM培养基中。培养基每三天更换一次。7天后，用漂白剂将细胞取出，用水洗涤三次，之后根据康宁(技术审查)标准协议，进行VonKossa染色，以提高完整表面与吸收陷窝之间的对照。通过具有20倍物镜的TissueFax，各孔被完全拍摄，计算所有可见吸收陷窝并盲分析。
细胞外酸化率和耗氧率
使用XF-分析仪(海马生物)来测量由不同的碳水化合物引起的细胞新陈代谢的变化。根据制造商说明，记录原代人脂肪细胞和原代鼠肝细胞中的细胞外酸化率(ECAR，MPH/分)和氧气消耗速率(OCR，皮摩尔/分钟)。简言之，将细胞接种在海马细胞板中，每孔的密度为104个细胞的脂肪细胞和每孔0.5xlO5个肝细胞。实验当天，用无碳水化合物的介质洗涤细胞，并在含有碳水化合物混合物(浓度为3g/L，葡萄糖和果糖(GF)，或葡萄糖，果糖和景天庚酮糖(GFS))的培养介质中培养1小时。为了测量葡萄糖诱导的ECAR，在无碳水化合物的介质中使细胞饥饿一小时，之后在每次自动注射中，将葡萄糖(1g/L)加入到孔中。葡萄糖诱导的ECAR孔被标准化成相应的ECAR，之后添加葡萄糖(基础＝100％)。由不同的碳水化合物源引起的变化表示为百分率相对变化，以说明各个碳源的效果。
基因表达分析
简要地说，提取总RNA，并使用商业试剂盒(QIAGEN公司，Applied Biosystems)进行逆转录。如先前描述的那样，利用具有ROX(BioRad)的iTaq SYBR Green Supermix在AbiPRISM 7900HT实时周期计上进行定量实时PCR，从而测量CARKL、脂联素、UCP-1、肿瘤坏死因子α、IL-6、MCP-1和的β-肌动蛋白的表达(Haschemi et al.,Cell Metab.15(2012),813-826)。通过Δ-ΔCT法计算靶基因的相对表达。
景天庚酮糖激酶测定
根据制造说明，随着时间的流逝累积ADP，从而将ADP Quest任务测定(DiscoveRx)用于间接测量S7P形成。在先前，重组景天庚酮糖激酶是在大肠杆菌中产生的并通过亲和纯化而纯化(Haschemi et al.,Cell Metab.15(2012),813-826)。
间接量热
通过间接量热法，测量代谢笼(哈佛装置)中每次小鼠活动的活性呼吸系数(VC02生产/V02消费)和能量消耗(EE，千卡/天/kg0.75)。1个CARKL转基因小鼠或野生型同窝小鼠在每个笼子里安置一天，之后在白天(上午8时至下午4时)和夜间(晚上8时至凌晨4点)来记录每次活动的平均呼吸系数和能量消耗。
胰岛素耐量试验
四小时预饥饿的雌性CARKL转基因小鼠和野生型同窝小鼠控制是i.p.注射胰岛素0.75U/kg体重。注射前和注射后15，30，45和60分钟，通过使用单触葡萄糖试纸(Accu检查，罗氏)测量血糖。
油红染色
简而言之，如描述的那样培养肝细胞，之后除去培养基，用10％福尔马林固定细胞。用60％异丙醇洗涤之后，用0油红溶液(Sigma-Aldrich)孵育孔，并染色10分钟，用水洗涤4次，之后在20倍的放大倍率下拍摄照片。
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性测定
在经聚苯乙烯容器组织培养物处理的玻璃载玻片上使细胞生长，在液氮中快速冷冻，并保持在-80℃。酶组织化学程序是基于如Van Noorden和Frederiks中所述的四唑鎓盐方法。用于确认G6PD活性的培养介质包含18％(w/v)聚乙烯醇(平均分子量为70,000-100,000)，处于0.1M Tris-马来酸盐缓冲剂中，pH 7.5,15mM葡萄糖-6-磷酸酯，0.8mM NADP，0.4mM氯化镁，0.45mM 1-甲氧基甲基苯丙胺甲氧基硫酸酯，5mM叠氮化钠和5mM四硝基四氮唑蓝。新制备介质后立即进行培养。对照反应额外地包含40mM氨基葡萄糖-6-磷酸酯。通过轨道振动器连续混合的情况下，细胞在室温下孵育15分钟。培养之后，细胞在60℃磷酸盐缓冲的盐水洗涤3x5分钟，干燥并安装到甘油明胶中，一天之内在10倍放大倍率下拍照。
免疫挑战和细胞因子的体内响应分析
对于体内的内毒素血症致死小鼠，将7毫克/公斤的LPS(Sigma Aldrich公司)注入雄性CARKL转基因或野生型同窝仔畜。通过迷你Z Serum Sep管分离全血中的血清。根据制造说明，通过利用小鼠细胞因子检测分析器(Millipore)测量细胞因子。所有动物实验是根据动物道德许可协议和维也纳医科大学批准的合同进行的(BMWF-66.009/0140-II/10B/2010)。
与中风风险相关的CARKL单核苷酸多态性(SNP)研究。
研究设计：578名患有炎症和颈动脉(患有动脉粥样硬化风险)的神经系统无症状患者的研究(ICARAS，Schillinger等人，(2005)Circulation 111(17):2203-2209.))，招募到2003年3月，被列入到本分析-列入和排除标准已经在之前公布。简言之，无症状性颈动脉疾病，表示主要纳入标准，分别被定义为没有短暂性脑缺血发作(TIA)，过去12个月内发生过一时性黑蒙和中风，或具有残留症状。除了详尽的身体检查(包括既往病史，身体状况和血液检测)，患者在基线和研究入选后的随访6-9个月内还接受了颈动脉超声检查，这在先前有所描述(Schillinger等人，(2005)Circulation 111(17):2203-2209.)。记录心血管发病事件，直到2006年1月。该分析得到了当地伦理委员会(EC-编号1933/2012)的提倡，并按照赫尔辛基及其修正案的宣言规定的道德标准已经完成。
定义：动脉高血压被定义为重复静息血压超过140/90mm Hg，并假定为存在于服用降压药的患者。对总血清胆固醇>200mg/dL或LDL胆固醇>130mg/dL的患者诊断高血脂，并认为这样的患者目前在服用降脂药。根据糖尿病诊断和分类方面的专家委员会的建议，诊断糖尿病。使用方丹的分类系统将外周动脉疾病分级，冠状动脉疾病是根据由加拿大心血管协会(CCS)定义的。根据Alpert定义记忆性心肌梗塞。通过神经功能缺损持续>24小时来定义中风，并根据改良的Rankin中风级别来评价中风。颈动脉粥样硬化的进度定义为至少一个NASCET造影度狭窄增加。
基因分型：通过基于核酸的旋转柱纯化，将DNA从EDTA抗凝全血中分离出来。使用5'-核酸酶-分析[7]，在ABI7900HT快速实时热循环仪(Applied Biosystems,Rotkreuz,Switzerland)上进行基因分型。该测定法包括序列特异性结合标记的DNA-探针。在每个步骤的退后阶段，含有荧光团的序列特异性探针在其5'端结合其各等位基因。通过3'-淬火掩蔽荧光团的荧光，直到在延长阶段5'-Taq-聚合酶通过其5'核酸外激酶活性分离这些化合物。序列特异性荧光的强度的终点测量表示存在相应的等位基因。在本研究中，使用商购的SNP基因分型分析(分析ID:C__717358_1_,实用型生物系统)和基因分型主混合机(实用型生物系统)根据商家提供的标准协议在lOμL的全反应体积中分析rs465563。使用SDS 2.4序列探测软件(实用型生物系统)解读结果。
统计分析：连续数据是关于其分布的平均值和标准偏差或中值和四分范围而给出的。分类数据是以计数和百分比的形式给出的。通过洛夫-斯米尔诺夫检验来评估子组内是否存在正态分布。采用Mann-Whitney U测试来比较度量标准的变化。基因型之间的联系和研究终点以及相对风险是通过应急表格Pearson的X2测试来评价的。通过Kaplan-Meier分析评价无事件存活，通过日志列表(Mantel-Cox)将数据成对比较。通过二进制符号逻辑回归分析计算多变量模型并通过绘制ROC(接收-操作-表征(Receiver-Operator-Characteristics))曲线进行评价。所有p-值都是双边解释，除非另有说明。所有统计计算式利用IBM SPSS 20.0(IBM公司,Armonk,USA)进行的。
结果
人类饮食中衍生的景天庚酮糖摄取
为了确定营养景天庚酮糖是否从饮食上通过消化道进入血液(这是景天庚酮糖变为新陈代谢的活性碳水化合物的关键步骤)，测量胡萝卜和人血清中葡萄糖(C6)和果糖(C7)水平。为了确定胡萝卜的C6/C7之比，将植物组织均质化，提取出小分子部分，同时通过GC-MS测量相对葡萄糖和景天庚酮糖的量(图1A)。景天(Sedum spectabile)(一种含有高景天庚酮糖水平的多肉植物)叶作为阳性对照进行分析。景天叶包含葡萄糖以及约2倍的景天庚酮糖，这使得C6/C7之比为约0.5。在新鲜食物级有机胡萝卜中，检测到几乎等量的葡萄糖和景天庚酮糖，由此C6/C7比例约为1。相比于胡萝卜，据报道，马铃薯不含景天庚酮糖(Kardon et al.,FEBS Lett.(2008)Oct 15,582(23-24))，因此预期其具有非常高的C6/C7之比(或者甚至无限大)。接下来要解决的是，通过在食用主要含有蒸熟的胡萝卜(具有一些橄榄油、盐和胡椒)的餐饮(约700g/成年男性)之前和之后监控葡萄糖和景天庚酮糖的血清水平，来确定衍生自饮食的景天庚酮糖(源自胡萝卜)，是否达到了人血液。进餐两小时后，观察到人中景天庚酮糖血清水平提高了约2倍(图1B)。该结果清楚地表明：营养景天庚酮糖被人消化道吸收，其进入血液变成可得的碳水化合物，以进行后续的新陈代谢。摄取食物两个小时后，血清葡萄糖水平已经标准化，因此认为人对景天庚酮糖和葡萄糖的新陈代谢是不同的。
这些结果表明：胡萝卜(被认为是健康的蔬菜并及世界各地的饮食的成分)是人的景天庚酮糖天然源。有兴趣提及的是，胡萝卜，虽然它们含有碳水化合物如葡萄糖，但可适于且良好地被糖尿病患者接受，甚至保护人们免于患有共同的2型糖尿病遗传危险因素(Patel CJ等人，Hum Genet.132(2013):495-508)。
天然和人造人食品种的C6/C7之比
接下来，测量来自橙子汁、苹果汁、马铃薯汁和胡萝卜汁的碳水化合物提取物中葡萄糖、果糖和景天庚酮糖的浓度，从而建立常规饮料的C6/C7指数，并由此评级实际的人面对的景天庚酮糖。软饮料和能量饮料包含葡萄糖和果糖，但不含景天庚酮糖(图1C)。水果汁包含类似量的C6(葡萄糖和果糖的总和)，但与后者不同的是，它们还含有景天庚酮糖(100μΜ范围)。在蔬菜汁中，葡萄糖和果糖的水平下降，但是，发现景天庚酮糖浓度极大地提高(mM范围)。个别饮料的C6/C7之比，按摩尔比和重量比计算，在图1D中示出。在两种水果汁中，发现C6/C7之比为约2000/1。在马铃薯汁和胡萝卜汁中，该比例分别是75/1和20/1；和不包含可检测量的景天庚酮糖。因此，这些饮料的C6/C7之比不能计算，因此，如果不额外补充C7的话，这些食品是不适用的(N.A.)。这些发现清楚的表面，人造食品缺乏碳水化合物复杂性，因此也缺乏景天庚酮糖。值得注意的是，在绝对数中，这些数据表面：如果胡萝卜汁的天然碳化合物选自软/能量饮料，那么每9kg衍生自饮食的葡萄糖,消耗1kg衍生自饮食的景天庚酮糖–通过不平衡人类膳食导致的慢性景天庚酮糖缺乏的结果目前是未知的。
景天庚酮糖激酶波动和高度表达在代谢活性组织中。
为了理解如何在各种哺乳类组织中分布和控制景天庚酮糖激酶并由此分布和控制景天庚酮糖，测试不同组织的mRNA表达水平。CARKL表达，在公众可得的数据库中为生理表达行为(CircaDB)，发现在小鼠肝脏(周期20.0，图2A)和肾上腺(周期24.0，数据未示出)中是波动的。据先前的报道，植物中的景天庚酮糖-7P水平是波动的，在碳固定的再生阶段达到高峰，重新转化为核糖部分。哺乳类生物钟在部分程度上是由氧化还原状态设定的。CARKL过表达RAW264.7细胞表明：景天庚酮糖激酶表达诱发氧化还原因子升高4倍，类似降低烟酰胺，腺嘌呤二核苷酸(NADH)以及谷胱甘肽(GSH)水平升高(Figure 2B and Haschemiet al.,Cell Metab.15(2012),813-826)。CARKL缺乏以及由此导致的景天庚酮糖缺乏示出了相反的效果(图2C)。该数据表明景天庚酮糖新陈代谢受生理节律的控制，并且同时起到细胞氧化还原状态调节的作用。为了指定哪种组织消耗营养景天庚酮糖，测量小鼠cDNA组织库中的景天庚酮糖激酶的mRNA水平(图2D)。景天庚酮糖激酶是景天庚酮糖新陈代谢的限速酶，并高度表达于肝，肾，棕色和白色脂肪组织(BAT和WAT)，消化器官，腺体，男性生殖系统以及大脑中。这些结果证实了：衍生自饮食的景天庚酮糖能够变成全身碳水化合物源用于多种组织，但尤其用于新陈代谢活性器官，例如肝，肾和脂肪组织。
景天庚酮糖代谢对于细胞的功能和代谢健康是重要的
为了评价暴露于景天庚酮糖的代谢结果，使培养介质中的人细胞和小鼠细胞暴露于葡萄糖与果糖的组合(GF)，或暴露于果糖、葡萄糖和景天庚酮糖的组合(GFS)，同时保持总碳水化合物负荷恒定。对脂肪细胞，肝细胞和巨噬细胞的功能进行了测试，从而评价景天庚酮糖在补充营养的碳水化合物负荷的重要性。用于这些实验的景天庚酮糖是从紫景天植物中分离出来的。
在人体中，脂肪细胞履行关键功能从而以脂肪的形式储存能量，并因此对于保持健康而言是非常重要的细胞。在代谢不健康或重度肥胖患者中，脂肪细胞不能适当地发挥作用，增大它们的细胞大小以导致过量的脂肪负荷，变得红肿((meta炎症(meta-inflammation)，低级的，但属于慢性发炎)，并且最终导致诸如胰岛素抗性或心血管疾病等疾病的发展。在人脂肪细胞中，区别于下皮前驱细胞，如果将景天庚酮糖添加至培养介质，发现景天庚酮糖激酶CARKL mRNA表达升高(图3A)。此外，观察到：与GF处理的细胞相比，GFS中的脂联素和UCP-1表达升高，其为两个功能相关的脂肪细胞标记基因(图3B和3C)。为了测试细胞代谢的变化，分别测量细胞耗氧率(OCR)和细胞外酸化速率(ECAR)作为线粒体呼吸和乳酸发酵的指标。人脂肪细胞，在含有景天庚酮糖的介质中分化和培养，示出：ECAR与WT对照相当，同时他们的细胞耗氧率被提高(图3D和3E)。
总之，这些数据示出：与仅有葡萄糖和果糖作为生物燃料存在的情况相比，在景天庚酮糖存在的情况下，皮下脂肪细胞保持和提高其功能(脂联素、UCP-1和耗氧率提高)。
为了更好的定义景天庚酮糖在预防代谢不健康状态(例如慢性低度炎症)方面的有益作用，测量了在GF或GFS中培养的原代成熟小鼠脂肪细胞，原代鼠肝细胞，以及先天性和脂多糖(LPS)诱导活化的原发性巨噬细胞的细胞因子谱。成熟脂肪细胞，其在含有景天庚酮糖的介质中培养，与仅在葡萄糖和果糖中培养的脂肪细胞相比，产生较少的TNFa和IL-6mRNA(图3F和3G)。与此类似的是，肝细胞也产生了较少的TNFa和IL-6mRNA表达，发现细胞因子分泌物被含景天庚酮糖的介质堵塞(图3I-L)。LPS诱导的巨噬细胞活化导致GF培养细胞中的TNF-a和IL-6剧烈升高(图3M和3N)。GFS介质培养的LPS诱导的巨噬细胞将IL-6提高至与经GF处理的巨噬细胞相当的水平，但将它的TNFa分泌物降低了约40％。这表明：一方面，将景天庚酮糖添加至巨噬细胞降低了其基本发炎状态(通过TNFa和IL-6测量)，但另一方面却保持了其在免疫方面的天然功能(从IL-6可看出)。
总结，将景天庚酮糖添加到培养介质，显著增强了皮下脂肪细胞功能，并减少了细胞的炎症状态，从而可能会对肥胖的发病机制产生积极的影响，在部分程度上，II型糖尿病和心血管疾病也通过代谢综合症做了总结。
景天庚酮糖激酶CARKL表达
产生过量表达在整个身体中无处不在的景天庚酮糖激酶的小鼠，从而在基因工程方面分离过表达CARKL原代细胞并测试景天庚酮糖体内代谢。CARKL转基因小鼠没有示出任何明显的表型，并且它们的器官重量不同于WT同窝对照动物的器官重量(数据未示出)。据猜测，通过提高底物景天庚酮糖的浓度或通过升高其限速酶景天庚酮糖激酶(CARKL)的水平可以增加景天庚酮糖代谢。为了测试这一点，在体外激酶分析中，利用升高剂量的景天庚酮糖培养恒定量的重组CARKL蛋白质。这导致景天庚酮糖转换率升高(通过测量ADP形成来测量)(图4A)。通过提高CARKL蛋白质浓度，同时保持景天庚酮糖浓度恒定，观察到了相同的结果(图4B)。这些结果表明，CARKL过表达是有效模型，以评价升高的景天庚酮糖代谢的效果。接下来，分离出原代肝细胞，作为似乎内源性地代谢景天庚酮糖的内脏组织，(图2D)，用于研究在升高的CARKL表达水平下C7-和C6-代谢的效果。
利用C6/C7糖比为2:1的介质培养肝细胞，并通过比较ECAR和OCR作为更一般的代谢参数来进行代谢分析。如果与WT对照细胞相比，随着升高的ECAR和OCR水平所示，来自CARKL过表达小鼠的肝细胞随着显著提高了它们的代谢率(图4C和4D)。看起来景天庚酮糖在这些细胞中诱导了更有效的代谢。为了测试景天庚酮糖与景天庚酮糖激酶表达共同的相关性，将从WT和CARKL小鼠中分离出的肝细胞培养在含有GF和GFS的培养介质中，将它们的葡萄糖诱导的ECAR进行比较(1小时碳水化合物饥饿之后)，作为控制细胞糖醇解的手段。在WT肝细胞中，葡萄糖诱发的ECAR通过施用景天庚酮糖而下降(图4E)。与该数值一致的是，来自WT动物的在GF中培养(无景天庚酮糖)的葡萄糖刺激的肝细胞使大部分葡萄糖进行乳酸发酵，但来自CARKL过表达小鼠的细胞似乎更有效地平衡相同的葡萄糖药剂。这些结果进一步在先前的数据中报道过，并清楚地指出，升高的景天庚酮糖代谢对细胞具有明显和有益的效果，这对于代谢健康而言是重要的。
体内景天庚酮糖代谢
在确认脂肪细胞中景天庚酮糖激酶过表达的细胞显型之后，通过比较呼吸系数(RQ；RQ＝呼出的CO2/耗氧量)以及对照和景天庚酮糖激酶转基因小鼠每次身体活动的能量消耗(在白天和夜间期间根据全身性代谢指示剂，通过间接量热法测量)，来评价提高景天庚酮糖转换对整个生物体的代谢效果(图4F和4G)。与野生型(WT)同窝动物相比，景天庚酮糖激酶过量表达的动物(CARKL)具有较低的RQ值。CARKL小鼠示出提高的耗氧率和由此导致的较低的RQ值，因此在部分程度上反应了景天庚酮糖对细胞的影响。此外，与对照小鼠相比，CARKL小鼠每个活动倾向于具有较低的EE。雌性CARKL转基因和WT小鼠的胰岛素敏感性也通过胰岛素耐量试验(ITT)进行比较，从而评价景天庚酮糖代谢是否也影响体内胰岛素信号。注射胰岛素(i.p.)降低了小鼠的血糖水平，且过表达景天庚酮糖激酶小鼠比WT对照降得更快，这表明在这些动物中胰岛素敏感性也通过提高景天庚酮糖代谢而得到提高(图4H)。在本文中，需要重要提及的是，通过TNFa和低氧治疗诱导的成熟脂肪细胞中胰岛素耐受性会导致景天庚酮糖激酶损失(公共基因表达综合性数据得自http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc＝GSM1261655)。
总而言之，这些实验示出，提高的景天庚酮糖代谢不仅改变体外代谢，还改变体内代谢。观察到CARKL小鼠中RQ值下降以及每个物理活动的EE趋于下降，提高的胰岛素敏感性是指更有效和耐受代谢过程，这是通过提高景天庚酮糖代谢而诱发的。
通过CARKL减少肝脏脂质沉积物
在肝细胞中导致脂肪肝疾病广泛的脂质沉积，并且可以伴有炎症(即非酒精性脂肪性肝炎(NASH))引起的肝纤维化，肝硬化，并最终肝细胞癌。来自WT和CARKL过表达的小鼠肝细胞的脂质含量进行比较，结果发现，从CARKL小鼠肝细胞中包含更少的脂滴比它们的WT对照(图5A).
在肝细胞中大量的脂质沉积物导致脂肪肝疾病并伴有炎症(即非酒精性脂肪肝(NASH)))引起肝纤维化，肝硬化，并最终导致肝细胞癌。将WT和CARKL过表达小鼠的肝细胞的脂含量比较，CARKL小鼠肝细胞中比它们的WT对照包含更少的脂滴(图5A)。
总之，高肝脏脂肪含量，尤其与炎症组合，包括脂肪细胞故障，增加了多种疾病风险，包括2型糖尿病或癌症，由此导致这两种疾病，通过景天庚酮糖降低肝细胞的炎症和油脂累积尤其有益于人体营养(参考蔬菜，其包含高C7水平)。
CARKL调节葡萄糖-6-磷酸酯脱氢酶活性。
葡萄糖-6-磷酸酯脱氢酶(G6PD)，是戊糖磷酸酯途径(PPP)的氧化分支的限速酶，其产生C5体，即，用于核苷酸合成和氧化还原等效物，在先前示出可被p53直接抑制(肿瘤抑制剂)(Jiang等人，Nat Cell Biol.(2011)Mar；13(3):310-6)。p53中的突变，是人体肿瘤中最频繁突变的基因，导致G6PD具有高活性和肝细胞中油脂累积。景天庚酮糖激酶是PPP的非氧化分支的限速酶，在先前示出降低氧化PPP流量，至少在巨噬细胞中是这样。为了测试是否能通过景天庚酮糖代谢调节肝细胞中的G6PD活性，将WT和CARKL过表达细胞的酶活性进行比较(图5B)。在WT对照细胞中，观察到G6PD活性是均匀分布的，而在CARKL的细胞中，G6PD是重新局部分布的，由此，观察到细胞的内部空间活性下降，有趣的是，通过将WT细胞培养在具有景天庚酮糖的培养介质中，实现了相同的显型(未示出)。如果通过景天庚酮糖激酶过表达和景天庚酮糖培养，使G6PD再次局域化和/或被抑制是降低肝细胞中油脂累积的原因，(图4A)仍然需要建立。无论如何，该数据与巨噬细胞得出的数据组合，表明，提高景天庚酮糖水平可以起到对抗癌细胞中p53的损失，在一些情况中至少消极地调节G6PD活性。另一个例子是雌性激素依赖性乳房癌细胞，其响应于生长因子激素而降低CARKL表达(公共基因库呼吸数据得自http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geoprofiles/；ID:53372898；GDS3285/219713_at/SHPK)，这顺耳可能再次导致G6PD活性升高，接着导致肿瘤生长。
该数据还表明了景天庚酮糖代谢作为合适的目标，从而调节G6DP活性并用于抗癌策略。
景天庚酮糖和骨代谢
骨是示例性动态组织。骨形成和骨吸收之间的精细平衡对于骨的适当的机械稳定性是必不可少的。骨形成和骨吸收之间失衡是导致骨质疏松、非常普遍状况的骨质密度降低和扰乱的骨微结构的原因，导致骨质变脆和病态骨折。对于破骨细胞，响应骨吸收的细胞来源于单核细胞系，其作用受到景天庚酮糖代谢的强烈影响，还测试了是否破骨细胞的作用可以通过C6/C7之比进行调节。
通过将细胞暴露于RANKL和M-CSF的组合，将骨髓细胞在体外与破骨细胞分离。将细胞在板中培养，在孔的底部，利用骨质基质进行预涂布，从而提供基底用于其骨吸收活性。基底吸收分析清楚地表明：CARKL过表达以及提高培养介质中C7含量二者都降低了破骨细胞中陷窝的形成(图5C)。有趣的是，仅不存在景天庚酮糖的情况中发现的较大的吸收陷窝(图5D)。
该数据再次支持了本发明的概念：良好平衡的C6/C7之比是保持健康的关键，并且C7具有减轻(即)人体骨质疏松的病理生理状况的潜能。
景天庚酮糖激酶调节动物的免疫响应
利用本实施例呈现了CARKL过表达的数据及其对急性免疫活性中和成熟脂肪组织的低级炎症中小鼠免疫系统的影响。在CARKL小鼠中，急性炎症是注入亚致死脂多糖(LPS)而引起的，与野生型对照相比，这导致抑制的细胞因子响应(图6A)。通过小鼠细胞因子分析器，测量WT和CARKL小鼠血清中的19细胞因子的板，其是在LPS注射(7mg/kg,IP)后24小时分离的。十二个细胞因子达到了50％平均变化的临界值，这是突出由CARKL体内过量表达而调节的细胞因子的截止值。与野生型同窝小鼠相比，在CARKL小鼠内，IL-13,MIP1ɑ,RNATES,IL-12(p70),IL-2,TNF-ɑ,MCP1,KC,GM-CSF,IL-6,IL-17和IL-15的平均改变都下降了至少50％。细胞因子IL-6,IL-17和IL-15甚至达到了75％平均改变的临界值。除了急性炎症之外，成熟脂肪组织中促炎性细胞因子的基本水平也从CARKL和WT对照小鼠的两个不同的补给点(皮下和附睾脂肪组织)而评价。与LPS诱发的炎症下降一致的是，TNFɑ和MCP1的mRNA水平，原代脂肪因子，其使巨噬细胞进入脂肪组织并属于促炎性细胞因子，发现因CARKL过表达变得迟钝(图6B-E)。
这表明含有景天庚酮糖的营养补给物可能抑制急性和低级的慢性炎症。因此，靶向C7代谢，通过营养或临床施用景天庚酮糖，似乎是有效的手段来降低炎症和相关疾病。
CARKL基因的3'-UTR中的单核苷酸多态性(SNP)与中风风险相关。
535神经系统无障碍患者的炎症和颈动脉-动脉粥样硬化风险研究(ICARAS,Schillinger et al.,(2005)Circulation 111(17):2203-2209)被基因分型为CARKL基因的3'-UTR的rs465563[A]至[G]替换。在观察期内33(6.2％)患者患有中风。在这些患者中，rs465563等位基因的分布显著不同于研究群体中的其余患者的等位基因频率(χ2＝12.639,df＝2,p＝0.002,参见图6F)。具体而言，[G]等位基因的同型结合载体厌烦分别是，与[A]纯合体相比，为3.93的相对风险(95％CI:1.72-9.01)，并且与杂合个体相比，为3.10(95％CI:1.40-6.87)。rs465563基因型炎症的统计独立性是通过二进制符号逻辑回归模型评价的，提供年龄、性别、患有心肌衰弱和中风的病史、尼古丁消耗、身体质量指数以及某些并发症(高血脂症，高血压，糖尿病)作为协变量(模型：χ2＝30.476,df＝ll,p＝0.001)。在这些模型中，当与患者纯合体[A]等位基因比较时，[G]；[G]基因型的载体状态作为显著预报器(odds ratio＝5.015,95％CI:1.803-13.943)。
此外，通过绘制Kaplan-Meier曲线来评价最初的无中风的生存时间是否取决于rs465563载体状态。实际上，相比于杂合个体(1619.1天，95％CI:1584.8-1653.3,p＝0.005)，[A]；[A]-基因型的载体(1788.1天，95％CI:1755.7-1820.4,p＝4.9-10-4)，纯合[G]等位基因的载体(1518,3天95％CI:1419,2-1617,4)表现出显著更短的无事件存活(图6G)。各个纯合的rs465563：[G]-等位基因显示出，与[A]-等位基因的载体相比，具有显著较短的无事件。
这种临床联想的机理背景仍然需要澄清。但是，考虑到CARKL对调整巨噬细胞极化的能力以及后者在形成和促进动脉粥样硬化神经斑中的关键作用，很可能是这样的：通过调节脉粥样硬化神经斑中的巨噬细胞极化，rs465563多态性可以影响脑血管事件风险。该观点得到了根据本发明所得的观察的支持：CARKL基因的3'-UTR主要转录成巨噬细胞。
总之，关于脂肪细胞、肝细胞和巨噬细胞以及降低炎症和增强胰岛素体内外敏感性的该想法和提供的数据充分表明了：景天庚酮糖(C7-糖)是关键组分用于人体营养并同时是高度相关的药物，以处理(即)C7-缺乏或其他代谢不健康病态。
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