一种人多能干细胞制备靶向cd19的嵌合抗原受体nk细胞的方法与应用
阅读说明：本技术 一种人多能干细胞制备靶向cd19的嵌合抗原受体nk细胞的方法与应用 (Method for preparing chimeric antigen receptor NK (natural killer) cells of targeted CD19 from human pluripotent stem cells and application of method ) 是由 李扬 周士新 于 2021-06-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种人多能干细胞制备靶向CD19的嵌合抗原受体NK细胞的方法与应用。具体地公开了制备CD19-CAR-NK细胞的方法,利用靶向AAVS1位点的CRISPR/CAS9系统,将CD19-CAR基因和EF1α启动子定向敲入人多能干细胞基因组AAVS1区,得到重组人多能干细胞(CD19-CAR-hPSC),再诱导培养CD19-CAR-hPSC分化成拟胚体,从拟胚体分化的造血前体细胞中分选CD34～(+)造血前体细胞,再向NK细胞定向分化,最终分化成CD19-CAR-NK细胞。本发明的CD19-CAR-NK细胞具有更高的增殖能力,纯度更高、具有更强的抗肿瘤能力,可以安全、有效的用于肿瘤免疫治疗。(The invention discloses a method for preparing chimeric antigen receptor NK cells targeting CD19 from human pluripotent stem cells and application of the chimeric antigen receptor NK cells. Specifically discloses a method for preparing CD19-CAR-NK cells, which utilizes a CRISPR/CAS9 system of a targeting AAVS1 site to directionally knock a CD19-CAR gene and an EF1 alpha promoter into an AAVS1 region of a genome of a human pluripotent stem cell to obtain a recombinant geneGrouping human pluripotent stem cells (CD19-CAR-hPSC), inducing cultured CD19-CAR-hPSC to differentiate into embryoid-like bodies, sorting CD34 from hematopoietic precursor cells differentiated from the embryoid-like bodies + Hematopoietic precursor cells, then directionally differentiating into NK cells, and finally differentiating into CD19-CAR-NK cells. The CD19-CAR-NK cell has higher proliferation capacity, higher purity and stronger anti-tumor capacity, and can be safely and effectively used for tumor immunotherapy.)
技术领域
本发明属于细胞免疫治疗领域，具体涉及一种人多能干细胞制备靶向CD19的嵌合抗原受体NK细胞的方法与应用。
背景技术
嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)技术是采用基因工程技术修饰免疫细胞，使其表达外源性抗肿瘤基因(CAR基因)，使得淋巴细胞等免疫细胞具有识别肿瘤细胞表面抗原的能力，并特异性识别和杀伤肿瘤细胞，没有组织相容复合体(MHC)的限制，CAR的结构主要由细胞外识别细胞表面抗原的结构域和细胞内信号转导结构域组成，细胞外的结构域用于特异性地识别肿瘤表面特异性蛋白(抗原)，细胞内的结构域含有共刺激分子结构域，用于在识别肿瘤表面特异性蛋白(抗原)后启动淋巴细胞的免疫应答，针对特异性的靶细胞发挥细胞毒性的作用，从而杀伤靶细胞(肿瘤细胞)。目前，CAR-T技术已经能够应用于临床医疗，并在全世界获得了诸多成功的临床案例，但Car-T细胞引发的细胞因子释放综合征(CRS)是目前该治疗方法最主要的一种不良反应，会引发急性呼吸窘迫综合症和多器官衰竭等严重后果，并且对实体瘤尚未取得显著疗效。
自然杀伤细胞(Natural killer cell，NK)是天然免疫(innate immunity)系统的主力军，被认为是机体抗感染、抗肿瘤的第一道天然防线。NK细胞来源于骨髓淋巴样干细胞，主要分布于骨髓、外周血、肝、脾、肺和淋巴结，是机体重要的免疫细胞，与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节密切相关。NK细胞表面固有表达多种活化性和抑制性受体，起到保护自身组织并监视病变细胞的作用。依赖NK细胞固有表达受体的识别方式，没有MHC的限制，即可识别病变或恶性转化细胞，具有快速反应并杀伤病变细胞的功能，起到免疫监视的作用。T细胞同样具有直接杀伤功能，但需要抗原提呈细胞(APC)递呈抗原，还有MHC的限制。T细胞种类多、在体内扩增能力强，可产生长时间的免疫应答，但也有细胞因子风暴的风险。与T细胞相比，NK细胞在肿瘤免疫治疗上具有独特的优势：NK细胞亚群少，体内存活时间短，无细胞因子风暴等副作用，不可预期风险低；此外，由于免疫排斥机制，T细胞治疗目前多采用自体细胞，而已报道基于异体NK细胞的肿瘤免疫治疗均未见严重非可控移植物排斥宿主反应(Graft versus host reaction，GVHR)，因此可以将它们从供体提供给接受者，而无需进行匹配，表明异体NK细胞治疗的可行性，可以从一个供体中制备多个剂量的CAR-NK细胞来治疗多个患者，是天然“通用型”(即“一个来源”可适用于大量人群)的免疫细胞治疗的来源，更容易在临床上推广应用。
目前的NK细胞疗法存在几个关键的问题：1)来源不足，直接从健康志愿者外周血淋巴细胞采集的NK细胞数目少，扩增能力差，扩增时间长，一般难以达到治疗所需的细胞数目；2)肿瘤患者自身免疫力低下，获得的自体NK细胞活性及扩增能力较健康志愿者更差，很难适用于规模化治疗，难以满足广大癌症患者的需求。为了解决NK细胞的来源问题，研究者利用了人多能干细胞(Pluripotent stem cell，PSC)包括人胚胎干细胞(Embryonic stemcell，ESC)和人诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cells，iPSC)的体外扩增能力(Themeli M,Kloss CC,Ciriello G,Fedorov VD,Perna F,Gonen M,SadelainM.Generation of tumor-targeted human T lymphocytes from induced pluripotentstem cells for cancer therapy.Nat Biotechnol.2013；31(10):928-33.doi:10.1038/nbt.2678.；Knorr DA,Ni Z,Hermanson D,Hexum MK,Bendzick L,Cooper LJ,Lee DA,Kaufman DS.Clinical-scale derivation of natural killer cells from humanpluripotent stem cells for cancer therapy.Stem Cells Transl Med.2013；2(4):274-283.doi:10.5966/sctm.2012-0084.)。PSC能在体外以未分化状态无限增殖，结合体外细胞分化技术，理论上PSC可以作为患者NK细胞治疗的无限干细胞来源库，这从根本上解决了细胞来源的问题。但目前已报道的人多能干细胞向NK细胞分化过程，存在过程复杂、周期长、饲养层细胞依赖、培养基成分不明确、纯度和活力低等问题，并且残留的未分化细胞容易造成患癌风险。因此，优化NK细胞的分化方法，提高所获得NK细胞的纯度，去除未分化细胞的影响，提高NK细胞的增殖能力和杀伤能力，从而保障NK细胞治疗临床应用的安全性和有效性，仍是一个亟需探索和研究的方向，研发新的具有强大抗肿瘤作用的效应细胞对肿瘤的免疫细胞治疗具有重要的理论意义和应用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何制备一种更安全、高效的用于肿瘤免疫细胞治疗靶向CD19的嵌合抗原受体和/或表达所述嵌合抗原受体的CD19-CAR-NK细胞。所要解决的技术问题不限于如所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了制备表达CAR的重组NK细胞(名称为CD19-CAR-NK细胞)的方法，所述方法包括如下步骤：使表达CD19-CAR基因的重组多能干细胞分化为自然杀伤细胞，所述自然杀伤细胞即为表达CAR的重组NK细胞；所述CD19-CAR是包括胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域的蛋白质；所述胞外结构域包括抗CD19的scFv(CD19 scFv)，所述胞内结构域包括2B4(CD244)的胞内区和DAP10的胞内区。
所述重组多能干细胞可为人重组多能干细胞。所述胞内结构域中，2B4的胞内区和DAP10的胞内区构成共刺激域。
所述CD19-CAR为抗CD19的嵌合抗原受体；所述CD19-CAR基因为抗CD19的嵌合抗原受体基因；所述CD19-CAR-NK细胞为表达CD19-CAR基因的重组NK细胞。
本发明所述CD19-CAR在本文和附图中也称NK-19CAR或19CAR。
上述方法中，所述CD19-CAR为下述任一种蛋白质：
P1、所述跨膜结构域为2B4的跨膜区；
P2、所述CD19-CAR的胞内结构域还包括CD3ζ，和/或所述CD19-CAR还包括CD8铰链区，和/或所述CD19-CAR还包括信号肽；
P3、所述跨膜结构域为2B4的跨膜区，和所述CD19-CAR的胞内结构域还包括CD3ζ，和所述CD19-CAR还包括CD8铰链区，和所述CD19-CAR还包括信号肽；
P4、所述跨膜结构域为2B4的跨膜区，和所述CD19-CAR的胞内结构域还包括CD3ζ，和所述CD19-CAR还包括CD8铰链区。
上述方法中，所述2B4的胞内区是如下任一种蛋白质：
C1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第333-446位的蛋白质；
C2)将SEQ ID No.2的第333-446位所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与C1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
C3)在C1)或C2)的N末端和/或C末端连接蛋白标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；
所述DAP10的胞内区是如下任一种蛋白质：
D1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第447-470位的蛋白质；
D2)将SEQ ID No.2的第447-470位所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与D1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
D3)在D1)或D2)的N末端和/或C末端连接蛋白标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；
所述2B4的跨膜区是如下任一种蛋白质：
E1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第309-332位的蛋白质；
E2)将SEQ ID No.2的第309-332位所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与E1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
E3)在E1)或E2)的N末端和/或C末端连接蛋白标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；
所述CD3ζ是如下任一种蛋白质：
F1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第471-582位的蛋白质；
F2)将SEQ ID No.2的第471-582位所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与F1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有信号转导功能的蛋白质；
F3)在F1)或F2)的N末端和/或C末端连接蛋白标签得到的具有信号转导功能的融合蛋白质；
所述CD8铰链区是如下任一种蛋白质：
G1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第264-308位的蛋白质；
G2)将SEQ ID No.2的第264-308位所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与G1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
G3)在G1)或G2)的N末端和/或C末端连接蛋白标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；
所述抗CD19的scFv是如下任一种蛋白质：
H1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第22-263位的蛋白质；
H2)将SEQ ID No.2的第22-263位所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与H1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
H3)在H1)或H2)的N末端和/或C末端连接蛋白标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；
所述信号肽是如下任一种蛋白质：
I1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的第1-21位的蛋白质；
I2)将SEQ ID No.2的第1-21位所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与I1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
I3)在I1)或I2)的N末端和/或C末端连接蛋白标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
上述方法中，所述CD19-CAR为下述任一种蛋白质：
K1)氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；
K2)将SEQ ID No.2的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与K1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
K3)在K1)或K2)的N末端和/或C末端连接蛋白标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
本文中，所述蛋白标签如表1所示：
表1：标签的序列
标签
残基
序列
Poly-Arg
5-6(通常为5个)
RRRRR
Poly-His
2-10(通常为6个)
HHHHHH
FLAG
8
DYKDDDDK
Strep-tag II
8
WSHPQFEK
c-myc
10
EQKLISEEDL
上述方法中，所述使表达CD19-CAR基因的重组多能干细胞分化为自然杀伤细胞的方法包括构建表达CD19-CAR基因的重组多能干细胞的步骤，所述构建表达CD19-CAR基因的重组多能干细胞的步骤包括在多能干细胞的AAVS1位点敲入CD19-CAR基因和EF1α启动子。
所述EF1α启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
所述多能干细胞可为人多能干细胞。
所述人多能干细胞(human Pluripotent Stem Cell，hPSC)可为人胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell，ESC)和/或人诱导多能干细胞(induced Pluripotent StemCells，iPSC)。所述AAVS1位点位于人类基因组第19号染色体上，是一个开放的染色体结构，能保证转入的目的基因正常转录，并且对细胞无已知的副作用。
进一步地，上述方法中，所述在人多能干细胞的AAVS1位点敲入CD19-CAR基因的方法包括：利用靶向AAVS1位点的CRISPR/CAS9系统，诱导AAVS1位点与携带CD19-CAR基因的供体克隆之间发生同源重组，使供体克隆上的CD19-CAR基因整合到多能干细胞AAVS1位点。
上述方法中，所述分化为自然杀伤细胞包括将所述表达CD19-CAR基因的重组多能干细胞分化成拟胚体(Embryoid body，EB)，使所述拟胚体分化为造血前体细胞，从所述造血前体细胞中分离CD34+的造血前体细胞，使所述CD34+的造血前体细胞分化为自然杀伤细胞，所述自然杀伤细胞即为表达CAR的重组NK细胞。
上述方法中，所述方法还可包括将表达膜结合型IL21的抗原提呈细胞作为饲养层细胞体外扩增所述表达CAR的重组NK细胞的步骤，所述膜结合型IL21是如下任一种蛋白质：
L1)氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；
L2)将SEQ ID No.4的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与L1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
L3)在L1)或L2)的N末端和/或C末端连接蛋白标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
上述膜结合型IL21及下述与其相关的生物材料也属于本发明的保护范围：
M1)编码所述膜结合型IL21的DNA分子；
M2)编码序列是SEQ ID No.5的DNA分子；
M3)核苷酸序列是SEQ ID No.5所示的DNA分子；
M4)与M2)或M3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述膜结合型IL21的DNA分子；
M5)含有M1)-M4)任一所述DNA分子的重组载体；
M6)含有M1)-M4)任一所述DNA分子的重组细胞。
SEQ ID No.5所示的DNA分子编码SEQ ID No.4所示的膜结合型IL21。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码膜结合型IL21的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的膜结合型IL21的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码膜结合型IL21且具有与所述CD19-CAR相同的功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
本发明还提供了蛋白质或重组细胞或治疗肿瘤的药物，所述蛋白质为本文中任一所述的CD19-CAR，所述重组细胞为本文中任一所述的方法制备的表达CAR的重组NK细胞或为本文中任一所述方法中的表达CD19-CAR基因的重组多能干细胞，所述治疗肿瘤的药物的活性成分为本文中任一所述的方法制备的表达CAR的重组NK细胞。
本发明还提供了生物材料，所述生物材料可为下述任一种：
B1)编码本文中任一所述的CD19-CAR的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组细胞、或含有B2)所述表达盒的重组细胞、或含有B3)所述重组载体的重组细胞。
上述生物材料中，所述核酸分子可为下述任一种：
C1)编码序列是SEQ ID No.1的DNA分子；
C2)核苷酸序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子；
C3)与C1)或C2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述CD19-CAR的DNA分子。
SEQ ID No.1所示的DNA分子编码SEQ ID No.2所示的CD19-CAR。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia)，欧文氏菌(Erwinia)，根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)，产碱菌属(Alcaligenes)，假单胞菌属(Pseudomonas)，芽胞杆菌属(Bacillus)等。
上述生物材料中，所述细胞可为NK细胞或T细胞或干细胞。
所述重组载体具体可为p19CAR-Donor，所述p19CAR-Donor是将AAVS1-donor载体的第2856位和2870位之间的片段替换为序列表中SEQ ID No.1的DNA片段,保持AAVS1-donor载体的其他序列不变，启动子为EF1α(SEQ ID No.3)，得到的重组载体。所述重组细胞具体可为重组人多能干细胞(CD19-CAR-hPSC)，所述重组人多能干细胞(CD19-CAR-hPSC)可为表达本发明所述CD19-CAR基因的人诱导多能干细胞(iPSC)。
所述重组载体具体可为携带膜结合型IL-21基因(SEQ ID No.5)和EF1α长启动子(SEQ ID No.6)的慢病毒载体Lenti-EF1α-WPRE。
所述重组细胞具体可为CD19-CAR-NK细胞，所述CD19-CAR-NK细胞为利用本发明所述的方法制备的敲入CD19-CAR基因的人诱导多能干细胞(iPSC)。
所述重组细胞具体可为表达CD19和膜结合型IL21的抗原提呈细胞(IL21-CD19-K562细胞)。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码CD19-CAR的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的CD19-CAR的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码CD19-CAR且具有与所述CD19-CAR相同的功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
本文所述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本发明还提供了所述核酸分子和/或所述生物材料和/或所述蛋白质或重组细胞在制备用于治疗肿瘤的药物或产品中的应用。
进一步地，所述肿瘤可为B细胞恶性肿瘤。
进一步地，所述B细胞恶性肿瘤包括慢性、急性淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、但不限于此。
在本发明的一个实施方案中，本发明所述制备CD19-CAR-NK细胞的方法具体可包括如下步骤：
1、构建并合成CD19-CAR基因(SEQ ID No.1)；
2、利用靶向AAVS1位点的CRISPR/CAS9系统，将CD19-CAR基因(SEQ ID No.1)定向敲入人多能干细胞的基因组AAVS1区，得到重组人多能干细胞(CD19-CAR-hPSC)，具体步骤如下：
(1)将CD19-CAR基因(SEQ ID No.1)构建到AAVS1-Donor载体上，AAVS1-Donor载体含有EF1α启动子(SEQ ID No.3)，得到携带CD19-CAR基因的重组载体p19CAR-Donor；
(2)利用脂质体转染的方法(或使用本领域公知的技术，包括但不限于，接合，电穿孔，化学转化，转导，转染，或超声波转化)将重组载体p19CAR-Donor和载体AAVS1-Cas9n混合转染人多能干细胞，将CD19-CAR基因(SEQ ID No.1)和EF1α启动子(SEQ ID No.3)在AAVS1位点整合到人PSC细胞的基因组中，利用嘌呤霉素(puromycin)进行筛选，经过PCR验证，得到重组人多能干细胞(CD19-CAR-hPSC)；
3、利用本发明的三步法将重组人多能干细胞(CD19-CAR-hPSC)分化成CD19-CAR-NK细胞，具体步骤如下：
(1)诱导培养人多能干细胞(CD19-CAR-hPSC)分化形成拟胚体(EB)，使所述拟胚体分化为造血前体细胞，从所述造血前体细胞中分离CD34+造血前体细胞；
(2)诱导CD34+造血前体细胞向NK细胞定向分化，分化成CD19-CAR-NK细胞；
(3)制备携带膜结合型IL-21基因(SEQ ID No.5)和EF1α长启动子(SEQ ID No.6)的慢病毒(Lenti-EF1α-WPRE)，转染CD19-K562细胞，得到抗原提呈细胞(IL21-CD19-K562细胞)作为饲养层细胞，CD19-CAR-NK细胞和饲养层细胞按照1：2的数目比例混合培养，进行CD19-CAR-NK细胞的激活扩增。
实验证明，本发明优化设计了具有新颖结构的、并有利于后期CAR-NK细胞的活化和增殖的CD19-CAR基因，提供了利用所述CD19-CAR基因制备所述CD19-CAR-NK细胞的方法，通过在人多能干细胞的基因组特定AAVS1位点敲入本发明CD19-CAR基因，再经过体外细胞分化为自然杀伤(NK)细胞，该方法制备的CD19-CAR-NK细胞具有更高的增殖能力，纯度更高、具有更强的抗肿瘤能力，可以更安全、有效的用于肿瘤的免疫治疗，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为CD19-CAR-NK结构组成示意图，2B4(CD244)的胞内区和DAP10的胞内区为NK细胞的共刺激分子，CD3ζ为CD3zeta。
图2为在人PSC细胞基因组AAVS1位置定点敲入19CAR示意图。
图3为PCR法检测19CAR在人PSC细胞基因组的定点敲入核酸电泳图：第1列为PSC细胞AAVS1定点敲入NK-19CAR，第2列为DNA分子量ladders，第3列为无定点敲入的PSC(T-iPS)。图3中CD19-CAR-T-iPS表示CD19-CAR-hPSC。
图4为RT-PCR法检测19CAR在人PSC细胞中的表达的RT-PCR琼脂糖凝胶电泳图：第1列和2列分别为无定点敲入的PSC(T-iPS)和定点敲入的CD19-CAR-hPSC细胞中的管家基因GAPDH的表达情况，第3列为分子量ladders，第4列和5列分别为无定点敲入的PSC细胞和定点敲入的CD19-CAR-hPSC细胞中CD19-CAR基因的表达情况。图4中CD19-CAR-T-iPS表示CD19-CAR-hPSC(定点敲入)。
图5为人PSC细胞体外向NK细胞分化方法的示意图。
图6为第八天EB分化CD34+造血前体细胞MACS分选结果流式图。
图7为CD34+造血前体细胞定向分化为NK细胞标志物表达图谱。
图8为表达IL21-CD19-K562抗原提呈细胞的制备。
图9为CD19-CAR-NK细胞体外扩增。
图10为Lenti-EF1A-GFP-Luci质粒结构示意图。
图11为两种肿瘤细胞GFP镜检结果：CD19 K562和RAJI细胞明视野与绿色荧光图像，每组上为明视野，下为荧光视野。
图12为CD19-CAR-NK细胞体外杀伤结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells，hiPSC)是由本实验室用人外周血单核细胞(PBMC)感染仙台病毒携带Yamanaka因子(OCT4、SOX2，KLF4和MYC)，重编程为人诱导多能干细胞(hiPSC)。(Seki T,YuasaS&FukudaK.Generation of induced pluripotent stem cells from a small amountof humanperipheral blood using a combination of activated T cells and Sendaivirus.NatProtoc 2012，7,718–728.https://doi.org/10.1038/nprot.2012.015)。
实施例1CD19-CAR-NK细胞的制备
1、CD19-CAR(NK-19CAR)基因的结构和序列
一个完整的CAR分子主要包括胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。胞外结构域由负责识别并结合抗原的单克隆抗体的单链抗体(scFv)及一段起连接作用的铰链区(Hinge)构成。胞内结构域由共刺激结构域和信号转导结构域构成。本发明通过优化设计的CD19-CAR基因结构有利于促进后期CD19-CAR-NK细胞的激活和增殖、增强CD19-CAR-NK细胞对肿瘤的杀伤性。
本发明CD19-CAR(在本文和附图中也称NK-19CAR、19CAR)的结构分子由信号肽(Signal peptide)、抗CD19重链和连接区、抗CD19轻链、CD8铰链区(Hinge)、2B4跨膜区(Transmembrane)和胞内区、DAP10胞内区和CD3ζ(a signal-transduction component ofthe T-cell antigen receptor)蛋白组成(图1)。
其中，抗CD19重链和连接区和抗CD19轻链构成抗CD19的scFv(以下简称CD19scFv)，CD19 scFv和CD8铰链区构成胞外结构域，2B4跨膜区(Transmembrane)构成跨膜结构域，2B4胞内区和DAP10胞内区构成共刺激结构域，CD3ζ(a signal-transductioncomponent of the T-cell antigen receptor)构成信号转导结构域。
NK-19CAR结构的特点，其胞内受体信号转导区(胞内结构域)采用NK细胞的两个共刺激因子2B4和DAP10，和T细胞的激活分子CD3ζ共同来激活细胞。
NK-19CAR是氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质。其中，SEQ ID No.2的第1-21位是信号肽的氨基酸序列，SEQ ID No.2的第22-263位是CD19 scFv的氨基酸序列，SEQ IDNo.2的第264-308位是CD8铰链区的氨基酸序列，SEQ ID No.2的第309-332位是2B4跨膜区的氨基酸序列，SEQ ID No.2的第333-446位是2B4胞内区的氨基酸序列，SEQ ID No.2的第447-470位是DAP10胞内区的氨基酸序列，SEQ ID No.2的第471-582位是CD3ζ的氨基酸序列。
2、构建重组人多能干细胞(CD19-CAR-hPSC)
在AAVS1位点定向敲入NK-19CAR基因构建重组人多能干细胞(CD19-CAR-hPSC)。AAVS1位点位于人类基因组第19号染色体上，是一个开放的染色体结构，能保证转入的目的基因正常转录，并且对细胞无已知的副作用。本发明利用靶向AAVS1位点的CRISPR/CAS9系统能特异性剪切AAVS1位点，触发DNA的自然修复机制，诱导位点与携带目的基因的DNA克隆(供体克隆)之间发生同源重组，将供体克隆上的目的基因整合到AAVS1位点的原理，将本发明NK-19CAR基因定向敲入(Knockin)于人多能干细胞(human pluripotent stem cells,hPSC)的基因组AAVS1区域，具体方法是：
将NK-19CAR基因(SEQ ID No.1)构建到AAVS1-Donor载体上，得到携带NK-19CAR基因的重组载体p19CAR-Donor，利用脂质体转染的方法将重组载体p19CAR-Donor和载体AAVS1-Cas9n共同转入人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells，hiPSC)细胞，利用CRISPR/CAS9系统的高效特异性切割功能，Cas9n能对人基因组的AAVS1位点进行高效切割，同时由于使用单切口的Cas9n(而不是野生型的cas9)，DNA上的Nick缺口会很快被细胞修复，一般不会造成基因突变。重组载体p19CAR-Donor含有AAVS1位点的同源序列，能有效地将目的片段通过基因同源重组的方式整合到人类基因组的AAVS1位点，得到重组人多能干细胞(CD19-CAR-hPSC)。
经过嘌呤霉素(puromycin)筛选和核酸PCR电泳鉴定，确定NK-19CAR基因敲入到hiPSC的AAVS1位置(图2)。具体实验步骤如下：
2-1、构建重组载体p19CAR-Donor
AAVS1easy基因修饰试剂盒(北京赛贝生物技术有限公司产品)包括AAVS1-Cas9n载体和AAVS1-donor载体。AAVS1-donor载体是带有AAVS1位点的同源载体。
利用AAVS1-donor载体构建NK-19CAR基因的重组表达载体，命名为p19CAR-Donor。p19CAR-Donor是将AAVS1-donor载体的第2856位和2870位之间的片段替换为序列表中SEQID No.1的DNA片段，保持AAVS1-donor载体的其他序列不变，启动子为EF1α(SEQ ID No.3)，得到的重组载体。
p19CAR-Donor含有核苷酸序列是SEQ ID No.1的NK-19CAR基因，转入人类和动物细胞中表达的氨基酸序列是SEQ ID No.2的NK-19CAR。
2-2、将重组载体p19CAR-Donor、AAVS1-Cas9n混合转染hiPSC细胞
设置转染实验组为：转染p19CAR-Donor和AAVS1-Cas9n；
设置模拟转染对照组为：只转染AAVS1-Cas9n；
(1)细胞培养
将hiPSC细胞以1:3的比例传代到六孔板培养皿中，在Matrigel+mTeSR培养基(Stemcell公司)中，在37℃、5％CO2细胞培养箱进行培养，待细胞汇合度达到30％-40％时，进行转染。
(2)脂质体转染法转染
将转染1μg p19CAR-Donor和0.5μg AAVS1-Cas9n的hiPSC细胞作为实验组；只转染1μg AAVS1-Cas9n的hiPSC细胞(命名为重组对照hiPSC细胞)作为对照组。
按照Lipofectamine 3000Transfection Reagent的说明书操作，将实验组和对照组的质粒转入hiPSC细胞。
(3)筛选
转染后的实验组和对照组细胞在5％CO2培养箱37℃孵育24小时后，添加2μg/ml的嘌呤霉素(puromycin)进行筛选，每天更换带有嘌呤霉素的新鲜培养基。3-5天后，可以观察到：未筛选前对照组的细胞没有GFP荧光，实验组的细胞有GFP荧光；筛选后对照组细胞全部死亡，实验组有大量细胞存活；荧光显微镜下观察细胞，实验组的细胞多为GFP阳性，定点整合的效率可达90％以上。
如果需要获取单克隆细胞系，需要将GFP阳性的细胞以低密度接种，使单个细胞间保持足够大的距离，培养5-10天形成较大的单克隆，挑取阳性亚克隆即可。
(4)鉴定
按照步骤(3)中所述，将GFP阳性的细胞以低密度接种，使单个细胞间保持足够大的距离，培养5-10天形成较大的单克隆，挑取阳性亚克隆，用引物AAVS1-F和引物AAVS1-R扩增所挑取的单克隆进行基因组DNA的PCR验证(Genomic-PCR)，PCR产物出现1668bp大小的条带时筛选得到正确的克隆子，即得到NK-19CAR基因插入到hiPSC细胞的AAVS1位点的阳性克隆，获得重组人多能干细胞，命名为CD19-CAR-hPSC或CD19-CAR-T-iPS。
引物序列如下：
AAVS1-F:5’ACCAACGCCGACGGTATCAG 3’
AAVS1-R:5’GTGGGCTTGTACTCGGTCATCT 3’
PCR程序如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min30s，35个循环；72℃延伸8min。
实验同步设置了对照组：即模拟转染(未转染)的对照组：将只转染AAVS1-Cas9n的hiPSC细胞(名称为T-iPS)提取基因组DNA后进行PCR验证。
实验组和对照组的PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定的结果见图3。hiPSC细胞的AAVS1位点敲入NK-19CAR基因的目的片段大小为1668bp。
提取无定点敲入的hiPSC细胞T-iPS和本发明定点敲入的CD19-CAR-T-iPS细胞的总RNA，经过逆转录，将RNA逆转录为cDNA，利用组成性表达的GAPDH基因作为内参，用CD19-CAR基因的特异引物进行(RT-PCR)分析CD19-CAR的表达情况。内参基因GAPDH的引物对：
GAPDH-F：5’-TCTCCTCTGACTTCAACAGCGAC-3’
GAPDH-R：5’-CCCTGTTGCTGTAGCCAAATTC-3’
CD19-CAR基因的特异引物对：
CD19-CAR-F：5’-GGAGAAATCACGAGCAGGAG-3’
CD19-CAR-R：5’-GCCTGGCATGTTGATGTAGA-3’
预计特异扩增片段大小为1668bp。结果显示，管家基因GAPDH在CD19-CAR-T-iPS和T-iPS细胞均有表达，NK-19CAR基因只在定点敲入的CD19-CAR-T-iPS细胞中表达(图4)。
3、CD19-CAR-hPSC细胞分化制备CD19-CAR-NK细胞
3-1、敲入NK-19CAR基因的hiPSC细胞(CD19-CAR-hPSC细胞)在体外向造血细胞和NK细胞分化
本发明设计了三步法：体外定向早期造血、NK细胞分化及扩增，如图5所示。
阶段1：人多能干细胞分化至拟胚体(EB)，从EB分化的造血前体细胞中分选CD34+造血前体细胞。
阶段2：CD34+造血前体细胞分化成NK细胞。
阶段3：NK细胞的激活扩增。
文献报道的方法通常分化到EB后，直接将EB接种饲养层细胞或无底物、饲养层包被的培养板。然而EB之中混杂有未分化的多能干细胞及其他前体细胞(如向心肌分化的前体细胞)，如果分化的细胞混有未分化的多能干细胞，有潜在的发生肿瘤的风险；含有其他类型的前体细胞，则可能向心肌等其他细胞类型的分化。因此，本发明增加了从EB分化的造血前体细胞中分选CD34+造血前体细胞这一关键步骤，完全避免了心肌细胞的出现及未分化多能性基因的表达，CD34+造血前体细胞只向造血细胞方向分化。
三步法具体步骤如下：
(1)造血分化培养基配制
表2StemPro造血分化培养基成分表
表2中StemPro34基础培养基和StemPro34添加剂为美国GIBCO公司产品，批号10639011；MTG为美国Sigma-Aldrich公司产品，批号M6145-25ML；BMP4为美国R&D公司产品，批号314-BP；VEGF为美国R&D公司产品，批号293-VE；Stem Cell Factor为德国MiltenyiBiotec公司产品，批号130-096-695。
(2)EB造血分化及CD34+造血前体细胞分选(第一步)
a)步骤2的CD19-CAR-hPSC细胞细胞汇合度大约在80％，吸去上清，用2ml PBS轻柔吹洗一遍，吸去PBS；
b)加入2ml消化液，在37℃培养箱中孵育7分钟，形成拟胚体(EB)；
c)吸去消化液，用2ml表2的StemPro造血分化培养基吹吸并重悬成小细胞团后，接种到低贴附培养板中，放入低氧箱(5％CO2/5％O2)中培养8天。
d)收集第8天的培养物，通过利用抗CD34+抗体流式细胞仪进行CD34+造血前体细胞分选(图6)。
(3)CD34+造血前体细胞向NK细胞定向分化(第二步)
a)将收集到的CD34+造血前体细胞计数后按照六孔板每孔50000个细胞数量接种到表3的NK细胞分化培养基中，每孔2ml培养基；
表3NK细胞分化培养基
表3中DMEM/F12为美国GIBCO公司产品，批号11320033；PEN为美国GIBCO公司产品，批号10378016；Flt-3L为德国Miltenyi Biotec公司产品，批号130-096-479；SCF为德国Miltenyi Biotec公司产品，批号130-096-695。
b)37℃培养20天，其中每隔3-4天补液2ml表3的NK细胞分化培养基；
c)20天后用去除IL-3因子的培养基(将表3的NK细胞分化培养基中的IL-3去除得到的培养基)重悬，吸取细胞悬液离心1200rpm 4分钟；
d)弃上清至2ml左右，补充2ml去除IL-3因子的培养基(将表3的NK细胞分化培养基中的IL-3去除得到的培养基)重悬，按照1:2或1:3传代；
e)得到分化后的CD19-CAR-NK细胞。
f)CD19-CAR-NK细胞的免疫表型检测：
含有NK-19CAR基因的hiPSC细胞在体外向NK细胞分化的不同时间点进行流式细胞分析，检测NK细胞的表面分子标志CD45、CD56、CD16、CD94、NKG2D、NKP44、NKP46：
分别取a)-d)中培养第0、18、23、31天的细胞，加至EP管中，离心收集细胞，用PBS洗涤一遍。将细胞重悬于PBS中，加入荧光标记抗体(CD45抗体、CD56抗体、CD16抗体、CD94抗体、NKG2D抗体、NKP44抗体、NKP46抗体，这些抗体全部购自美国Biolegend公司)，设一个测试管为空白对照，4℃避光孵育30分钟；用PBS洗涤，弃去上清；将细胞用PBS重悬，并用流式细胞仪进行检测分析。
结果如图7所示，随着分化时间的延长(18天、23天、31天)，NK细胞的表面分子标志的表达水平逐渐升高，其中CD45的表达在第18天就达到了99％，第31天可达到100％，说明细胞中的CD45表达量很高，十分有利于NK细胞发挥细胞毒作用(ADCC)；CD56、CD16、CD94、NKG2D、NKP44、NKP46的表达在第31天分别达到了98％、94％、86％、97％、97％、96％，提示本发明制备的分化的CD19-CAR-NK细胞具有NK细胞的表面分子表型，确认其为表达CD19-CAR基因的NK细胞。
(4)CD19-CAR-NK细胞的激活扩增(第三步)
制备抗原提呈细胞作为饲养层细胞(feeder cell)进行NK细胞体外扩增。步骤如下：
a)抗原提呈细胞的制备：
将慢病毒载体pRRL-SIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE(Zhao Y,Stepto H,SchneiderCK.Development of the First World Health Organization Lentiviral VectorStandard:Toward the Production Control and Standardization of Lentivirus-Based Gene Therapy Products.Human Gene Therapy Methods.2017；28(4):205-214)的PGK启动子替换为延伸生长因子-1α(Elongation factor-1α,EF1α)启动子，方法是用限制性BamHⅠ和BstXⅠ内切酶将pRRL-SIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE的PGK启动子切下来，换上EF1α长启动子(核苷酸序列是SEQ ID No.6)，EF1α长启动子的序列由北京奥科鼎盛生物有限公司合成，得到含有EF1α长启动子的慢病毒载体，命名为Lenti-EF1α-WPRE。膜结合型IL21基因的核苷酸序列为SEQ ID No.5，翻译为蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID No.4。将合成的膜结合型IL21基因(北京六合华大基因科技有限公司合成)接入到慢病毒载体Lenti-EF1α-WPRE之中，后面接有IRES和红色荧光蛋白(mCherry)的DNA序列。
将含有膜结合型IL-21基因的重组慢病毒感染K562细胞，慢病毒转染操作48小时后镜检红色荧光，可以观察到视野中K562细胞基本全部表达Cherry红色，进一步利用抗IL-21抗体通过流式抗体检测此细胞表面IL-21表达(如图8)，此时的K562细胞已经能够达到IL21全阳性表达，得到抗原提呈细胞(命名为IL21-K562细胞)。
由北京奥科鼎盛生物有限公司合成编码人类CD19的膜外区和跨膜区的DNA序列，编码CD19基因(编码序列是GenBank Accession NM_001770.6(Update Date 24-MAY-2021)的第31-1071位)，用限制性内切酶XbaI和SalI将编码CD19的DNA插入到慢病毒载体Lenti-EF1α-WPRE之中，制备表达CD19膜外区和跨膜区的慢病毒，感染IL21-K562细胞，得到表达CD19和IL21的抗原提呈细胞，命名为IL21-CD19-K562细胞。
b)与IL21-CD19-K562细胞共培养扩增NK细胞
收集28-35天分化的CD19-CAR-NK细胞与辐照(辐照剂量5Gy)过的IL21-CD19-K562细胞按照1：2的数目比例在含有15％胎牛血清(FBS)的RMPI1640培养液中于5％CO2培养箱中进行共孵育培养7天，检测NK细胞的数目，NK细胞由初始50000个扩增到了540000个，扩增接近10.8倍(图9)。
实施例2CD19-CAR-NK细胞的体外杀伤能力(细胞毒实验)
本实施例中的K562细胞和RAJI细胞来源于北京中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。
选取对于NK细胞杀伤较为敏感的慢病毒过表达CD19的人类白血病细胞系CD19-K562，以及表达CD19淋巴瘤RAJI细胞作为靶细胞，利用基于荧光素酶的报告基因转染法来评估本发明NK-19CAR基因修饰的NK细胞杀伤靶细胞的能力。将报告基因——荧光素酶(luciferase，luc)基因转染靶细胞，建立稳定转染靶细胞系，以此测定NK细胞介导的细胞毒作用和细胞凋亡。通过测定释放入培养液中报告酶活性(代表靶细胞死亡数目)，可以计算效应细胞杀伤靶细胞百分数。
具体步骤如下：
1、构建Lenti-EF1A-GFP-Luci慢病毒质粒(图10)
绿色荧光蛋白(GFP)编码来源于质粒载体pRRL-SIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE，用PCR扩增得到GFP的DNA序列；从美国Promega公司购买质粒载体pGL4.14，该质粒含有荧光素酶(Luciferase)编码基因，P2A为核糖体独自翻译结构，设计引物，分别将GFP和Luciferase的基因序列用聚合酶链反应(PCR)的方法扩增出来，再用Overlapped PCR extension的方法(Heckman KL,Pease LR.Gene splicing and mutagenesis by PCR-driven overlapextension.Nat Protoc.2007；2(4):924-32.doi:10.1038/nprot.2007.132.PMID:17446874)，将GFP-P2A和Luciferase连接起来，用限制性内切酶XbaI和SalI的双酶切方法，插入到慢病毒载体Lenti-EF1α-WPRE中,命名为Lenti-EF1A-GFP-Luci慢载体(图10)。P2A为核糖体独立翻译功能(Szymczak-Workman AL,Vignali KM,Vignali DA.Design andconstruction of 2A peptide-linked multicistronic vectors.Cold Spring HarbProtoc.2012Feb1；2012(2):199-204.)，使GFP和Luciferase在一个启动子驱动下独自表达。Lenti-EF1A-GFP-Luci质粒转染HEK293T细胞，制备和收集慢病毒用于感染K562、RAJI等细胞。
2、Lenti-EF1A-GFP-Luci慢病毒感染K562、RAJI细胞
接种K562、RAJI细胞细胞至6孔板，24小时后，待细胞密度达到每孔10万个时，感染Lenti-EF1A-GFP-Luci慢病毒。
1)按照针对于不同细胞的MOI(慢病毒量TU：细胞数)＝1-30，在生物安全柜中将计算好体积的病毒原液加入K562或RAJI目标细胞中，培养基体积约1ml；
2)加入25×促转染试剂，摇匀；
3)设置缓慢提速和降速模式后，离心机350g室温离心1小时；
4)在37℃培养箱中培养12小时后换液，2ml培养基，继续培养；
5)48小时后流式细胞术检测其转染效率；
6)用特异性抗体对感染病毒细胞和对照细胞进行染色；
7)使用1ml PBS缓冲液重悬细胞，通过细胞筛去除细胞团块，将细胞悬液置于5ml流式管中；
8)进行流式细胞分选，获得所需要的细胞；
9)收集管离心1000rpm 4分钟，弃上清后用本身培养基重悬，接种到6孔板或10cm大皿中。
通过流式分选在一周后富集了上述细胞系中Lenti-EF1A-GFP-Luci转染成功表达绿色荧光蛋白(GFP)的细胞(图11)。
再制备表达CD19膜外区和跨膜区的慢病毒，感染GFP和Luciferase阳性的K562细胞，得到表达CD19胞外区的K562细胞系，称为CD19-K562细胞，作为表达CD19的靶细胞。
3、分别将实施例1的CD19-CAR-NK细胞和无CD19-CAR的NK细胞(按照实施例1步骤3的方法将重组对照hiPSC细胞分化制备得到的NK细胞作为效应细胞)，以CD19-K562或者RAJI-GFP-luciferase细胞作为靶细胞，以10：1效靶比分别和靶细胞混合，进行体外荧光素酶杀伤实验，具体步骤如下：
1)在每孔透光白色96孔板中接种10000个肿瘤细胞(CD19-K562或RAJI-GFP-luciferase细胞)；
2)按照效靶比在每孔中加入定量肿瘤细胞和分化的CD19-CAR-NK细胞，每个效靶比设置两个复孔，并设置一组只有肿瘤细胞的对照；
3)定容至150μl每孔，在37℃培养箱中培养16小时；
4)按照1：50比例稀释luci底物，并在上机检测前避光，每孔加入50μl的luci底物；
5)等候5分钟，用化学发光仪检测，根据Luci数据转化为杀伤数据，然后作图。肿瘤细胞裂解率＝[1-(对照组化学发光读数-实验组化学发光读数)/对照组化学发光读数]*100％。
结果如图12所示，相对于没有CD19-CAR基因的NK细胞(图12中为NK细胞)，表达CD19-CAR基因的NK细胞(CD19-CAR-NK细胞)对CD19-K562细胞与RAJI细胞的杀伤活性显著提高。证实了将CD19-CAR在多能干细胞阶段就通过基因编辑转入可以在定向分化后得到CD19-CAR对表达CD19的肿瘤细胞具有更强大的杀伤能力。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京大学
<120> 一种人多能干细胞制备靶向CD19的嵌合抗原受体NK细胞的方法与应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1749
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggaggtga aactgcagga gtcaggacct ggcctggtgg cgccctcaca gagcctgtcc 120
gtcacatgca ctgtctcagg ggtctcatta cccgactatg gtgtaagctg gattcgccag 180
cctccacgaa agggtctgga gtggctggga gtaatatggg gtagtgaaac cacatactat 240
aattcagctc tcaaatccag actgaccatc atcaaggaca actccaagag ccaagttttc 300
ttaaaaatga acagtctgca aactgatgac acagccattt actactgtgc caaacattat 360
tactacggtg gtagctatgc tatggactac tggggccaag gaacctcagt caccgtctcc 420
tcaggtggcg gtggctcggg cggtggtggg tcgggtggcg gcggatctga catccagatg 480
acacagacta catcctccct gtctgcctct ctgggagaca gagtcaccat cagttgcagg 540
gcaagtcagg acattagtaa atatttaaat tggtatcagc agaaaccaga tggaactgtt 600
aaactcctga tctaccatac atcaagatta cactcaggag tcccatcaag gttcagtggc 660
agtgggtctg gaacagatta ttctctcacc attagcaacc tggagcaaga agatattgcc 720
acttactttt gccaacaggg taatacgctt ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagctg 780
gagatcacaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 840
cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 900
agggggctgg acttcgcctg tgatatcatc gtgattctaa gcgcactgtt ccttggcacc 960
cttgcctgct tctgtgtgtg gaggagaaag aggaaggaga agcagtcaga gaccagtccc 1020
aaggaatttt tgacaattta cgaagatgtc aaggatctga aaaccaggag aaatcacgag 1080
caggagcaga cttttcctgg aggggggagc accatctact ctatgatcca gtcccagtct 1140
tctgctccca cgtcacaaga acctgcatat acattatatt cattaattca gccttccagg 1200
aagtctggat ctaggaagag gaaccacagc ccttccttca atagcactat ctatgaagtg 1260
attggaaaga gtcaacctaa agcccagaac cctgctcgat tgagccgcaa agagctggag 1320
aactttgatg tttattccct gtgcgcacgc ccacgccgca gccccgccca agaagatggc 1380
aaagtctaca tcaacatgcc aggcaggggc agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc 1440
cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg acgaagagag 1500
gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga 1560
aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc 1620
tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac 1680
cagggtctca gtacagccac caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc 1740
cctaggtaa 1749
<210> 2
<211> 582
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu
20 25 30
Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val
35 40 45
Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr
65 70 75 80
Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys
85 90 95
Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala
100 105 110
Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met
145 150 155 160
Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr
165 170 175
Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr
180 185 190
Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser
195 200 205
Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
210 215 220
Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala
225 230 235 240
Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly
245 250 255
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
275 280 285
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
290 295 300
Phe Ala Cys Asp Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu Phe Leu Gly Thr
305 310 315 320
Leu Ala Cys Phe Cys Val Trp Arg Arg Lys Arg Lys Glu Lys Gln Ser
325 330 335
Glu Thr Ser Pro Lys Glu Phe Leu Thr Ile Tyr Glu Asp Val Lys Asp
340 345 350
Leu Lys Thr Arg Arg Asn His Glu Gln Glu Gln Thr Phe Pro Gly Gly
355 360 365
Gly Ser Thr Ile Tyr Ser Met Ile Gln Ser Gln Ser Ser Ala Pro Thr
370 375 380
Ser Gln Glu Pro Ala Tyr Thr Leu Tyr Ser Leu Ile Gln Pro Ser Arg
385 390 395 400
Lys Ser Gly Ser Arg Lys Arg Asn His Ser Pro Ser Phe Asn Ser Thr
405 410 415
Ile Tyr Glu Val Ile Gly Lys Ser Gln Pro Lys Ala Gln Asn Pro Ala
420 425 430
Arg Leu Ser Arg Lys Glu Leu Glu Asn Phe Asp Val Tyr Ser Leu Cys
435 440 445
Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln Glu Asp Gly Lys Val Tyr Ile
450 455 460
Asn Met Pro Gly Arg Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
465 470 475 480
Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
485 490 495
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
500 505 510
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
515 520 525
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
530 535 540
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
545 550 555 560
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
565 570 575
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
580
<210> 3
<211> 546
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
aaggatctgc gatcgctccg gtgcccgtca gtgggcagag cgcacatcgc ccacagtccc 60
cgagaagttg gggggagggg tcggcaattg aacgggtgcc tagagaaggt ggcgcggggt 120
aaactgggaa agtgatgtcg tgtactggct ccgccttttt cccgagggtg ggggagaacc 180
gtatataagt gcagtagtcg ccgtgaacgt tctttttcgc aacgggtttg ccgccagaac 240
acagctgaag cttcgagggg ctcgcatctc tccttcacgc gcccgccgcc ctacctgagg 300
ccgccatcca cgccggttga gtcgcgttct gccgcctccc gcctgtggtg cctcctgaac 360
tgcgtccgcc gtctaggtaa gtttaaagct caggtcgaga ccgggccttt gtccggcgct 420
cccttggagc ctacctagac tcagccggct ctccacgctt tgcctgaccc tgcttgctca 480
actctacgtc tttgtttcgt tttctgttct gcgccgttac agatccaagc tgtgaccggc 540
gcctac 546
<210> 4
<211> 414
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln Asp Arg
20 25 30
His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln Leu Lys
35 40 45
Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro Glu Asp
50 55 60
Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln Lys Ala
65 70 75 80
Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile Asn Val
85 90 95
Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala Gly Arg
100 105 110
Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys
115 120 125
Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu Gln Lys
130 135 140
Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu Asp Ser
145 150 155 160
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
165 170 175
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
180 185 190
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
195 200 205
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
210 215 220
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
225 230 235 240
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
245 250 255
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
260 265 270
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
275 280 285
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
290 295 300
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
305 310 315 320
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
325 330 335
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
340 345 350
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
355 360 365
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
370 375 380
Leu Ser Leu Gly Lys Met Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly
385 390 395 400
Leu Leu Leu Phe Ile Gly Leu Gly Ile Phe Phe Cys Val Arg
405 410
<210> 5
<211> 1242
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 5
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccacaca aatcaagctc ccaaggtcaa gatcgccaca tgattagaat gcgtcaactt 120
atagatattg ttgatcagct gaaaaattat gtgaatgact tggtccctga atttctgcca 180
gctccagaag atgtagagac aaactgtgag tggtcagctt tttcctgctt tcagaaggcc 240
caactaaagt cagcaaatac aggaaacaat gaaaggataa tcaatgtatc aattaaaaag 300
ctgaagagga aaccaccttc cacaaatgca gggagaagac agaaacacag actaacatgc 360
ccttcatgtg attcttatga gaaaaaacca cccaaagaat tcctagaaag attcaaatca 420
cttctccaaa agatgattca tcagcatctg tcctccagaa cacacggaag tgaagattcc 480
gagtctaaat atggtccccc atgccctcca tgtcctgctc cagaattttt ggggggacca 540
agcgtgtttc tgtttccccc caaaccaaag gataccctga tgatcagtag aacaccggaa 600
gttacctgcg ttgtcgtgga tgtaagccag gaagatcccg aagtccagtt caactggtac 660
gtagatggag tggaggtcca taatgctaaa actaaaccta gagaggaaca atttaacagc 720
acctataggg tcgtgtctgt gctgacggtg ctccaccagg attggcttaa tggcaaggaa 780
tacaaatgca aggtcagcaa taagggtttg ccgtcatcca tcgaaaaaac catttccaag 840
gcaaaagggc agcccaggga gccacaggtg tacacacttc ctccctccca ggaagaaatg 900
actaaaaacc aggtgagcct tacctgcctt gtaaaagggt tctatccaag cgacatcgct 960
gttgaatggg aaagcaatgg tcagccagag aacaactaca agacaacacc ccctgttctg 1020
gatagcgacg ggtcattctt tctgtatagc aggttgacag tagataagag ccgctggcaa 1080
gaaggaaatg tgttctcttg cagcgtcatg cacgaagccc tgcacaacca ctacacccag 1140
aagtcactca gcctttcact gggcaaaatg gcgctgatcg tgcttggtgg agtcgcagga 1200
ctgctgctct ttatcggcct cgggatcttc ttctgcgtga ga 1242
<210> 6
<211> 1191
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 6
ggagtgggaa ttggctccgg tgcccgtcag tgggcagagc gcacatcgcc cacagtcccc 60
gagaagttgg ggggaggggt cggcaattga accggtgcct agagaaggtg gcgcggggta 120
aactgggaaa gtgatgtcgt gtactggctc cgcctttttc ccgagggtgg gggagaaccg 180
tatataagtg cagtagtcgc cgtgaacgtt ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca 240
caggtaagtg ccgtgtgtgg ttcccgcggg cctggcctct ttacgggtta tggcccttgc 300
gtgccttgaa ttacttccac tggctgcagt acgtgattct tgatcccgag cttcgggttg 360
gaagtgggtg ggagagttcg aggccttgcg cttaaggagc cccttcgcct cgtgcttgag 420
ttgaggcctg gcctgggcgc tggggccgcc gcgtgcgaat ctggtggcac cttcgcgcct 480
gtctcgctgc tttcgataag tctctagcca tttaaaattt ttgatgacct gctgcgacgc 540
tttttttctg gcaagatagt cttgtaaatg cgggccaaga tctgcacact ggtatttcgg 600
tttttggggc cgcgggcggc gacggggccc gtgcgtccca gcgcacatgt tcggcgaggc 660
ggggcctgcg agcgcggcca ccgagaatcg gacgggggta gtctcaagct ggccggcctg 720
ctctggtgcc tggcctcgcg ccgccgtgta tcgccccgcc ctgggcggca aggctggccc 780
ggtcggcacc agttgcgtga gcggaaagat ggccgcttcc cggccctgct gcagggagct 840
caaaatggag gacgcggcgc tcgggagagc gggcgggtga gtcacccaca caaaggaaaa 900
gggcctttcc gtcctcagcc gtcgcttcat gtgactccac ggagtaccgg gcgccgtcca 960
ggcacctcga ttagttctcg agcttttgga gtacgtcgtc tttaggttgg ggggaggggt 1020
tttatgcgat ggagtttccc cacactgagt gggtggagac tgaagttagg ccagcttggc 1080
acttgatgta attctccttg gaatttgccc tttttgagtt tggatcttgg ttcattctca 1140
agcctcagac agtggttcaa agtttttttc ttccatttca ggtgtcgtga g 1191
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：用于免疫疗法的组合物和方法