CN113684185A

CN113684185A - 用于免疫疗法的组合物和方法

Info

Publication number: CN113684185A
Application number: CN202110829586.2A
Authority: CN
Inventors: R·J·布伦特延斯; H·J·彼吉姆
Original assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Current assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Priority date: 2013-02-26
Filing date: 2014-02-26
Publication date: 2021-11-23

Abstract

本发明提供用于增强对癌症和病原体的免疫应答的方法和组合物。其涉及具有抗原受体的免疫应答细胞，该抗原受体可以是嵌合抗原受体(CAR)，该免疫应答细胞表达导入的对于免疫调节分子的配体。在具体实施方式中，基因工程化的免疫应答细胞为抗原导向的且耐受免疫抑制和/或具有增强的免疫激活特性。

Description

用于免疫疗法的组合物和方法

本申请是2015年10月26日提交到中华人民共和国国家知识产权局的发明名称为“用于免疫疗法的组合物和方法”、申请号为 “201480023701.5”的发明专利申请的分案申请。

优先权声明

本申请要求2013年2月26日提交的美国临时申请第61/769,543 号优先权，其内容通过引用的方式全部并入本文。

资助信息

本申请在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)提供的基金CA95152、CA138738、CA059350和CA08748下由政府支持而完成。政府对本发明具有某些权利。

发明领域

本发明提供用于提高对于癌症和病原体的免疫应答的方法和组合物。其涉及具有抗原受体的免疫应答细胞，该抗原受体可以是嵌合抗原受体(CAR)，该免疫应答细胞表达导入的用于免疫调节分子的配体。在具体实施方式中，基因工程化的免疫应答细胞是抗原导向的，耐受免疫抑制，并且/或者具有提高的免疫激活特性。

背景技术

尽管目前可提供多种疗法，但大多数成人B-细胞恶性肿瘤，包括急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病和非霍奇金氏淋巴瘤是不可治愈的。使用基因改造的自体T细胞的过继疗法 (adoptive therapy)已经在黑色素瘤和惰性B细胞恶性肿瘤中表现出有治疗效能的证据。通过导入编码对这些抗原特异的称作嵌合抗原受体 (CAR)的人工T-细胞受体的基因，T细胞可以修饰成靶向肿瘤相关的抗原。免疫疗法是具有提供癌症治疗的潜力的靶向疗法。

但是，恶性细胞经适应而产生免疫抑制性微环境，以保护自身免于免疫识别和消除。这种“敌对的”肿瘤微环境对涉及刺激免疫应答的治疗方法例如靶向T细胞疗法提出挑战。因此，迫切需要有用于治疗瘤形成的新的治疗策略。

发明内容

总的来说，本发明提供免疫应答细胞(例如，T细胞、自然杀伤(NK) 细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和调节性T细胞)，其表达具有免疫细胞激活活性的抗原结合受体(例如，CAR或TCR)以及与具有免疫抑制活性的抗原(例如，CD47、PD-1、CTLA-4及其配体)结合的单链可变片段(scFv)，从而降低或消除抗原的免疫抑制活性。

本发明还提供免疫应答细胞(例如，T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和调节性T细胞)，其表达具有免疫细胞激活活性的抗原结合受体(例如，CAR或TCR)以及与具有免疫刺激活性或促炎活性的抗原(例如，CD28、OX-40、4-1BB、CD40及其配体)结合的单链可变片段(scFv)，从而提高抗原的免疫刺激活性。

本发明还提供免疫应答细胞(例如，T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和调节性T细胞)，其表达具有免疫细胞激活活性的抗原结合受体(例如，CAR或TCR)以及CD40L例如外源性CD40L(与细胞自身中产生的内源性CD40L相比较，已经直接或间接导入到细胞中的CD40L(例如，经由包含编码CD40L的核酸序列的裸核酸的载体))，从而提高抗原的免疫刺激活性。

因此，本发明提供使用这些免疫应答细胞用于治疗瘤形成、感染性疾病和其他病理的方法。

在一个方面，本发明提供一种分离的免疫应答细胞，其具有抗原识别受体和可溶性单链可变片段(scFv)，抗原识别受体与抗原结合，其中该结合激活免疫应答细胞，可溶性单链可变片段(scFv)与具有免疫抑制活性或免疫刺激活性的多肽结合。

在另一方面，本发明提供一种治疗或预防受试者中的瘤形成的方法，该方法包括向受试者施用有效量的免疫应答细胞，从而治疗或预防受试者中的瘤形成，该免疫应答细胞具有抗原识别受体和可溶性单链可变片段(scFv)，抗原识别受体与第一抗原结合，其中该结合激活免疫应答细胞，可溶性单链可变片段(scFv)与具有免疫抑制活性或免疫刺激活性的多肽结合。在非限制性实施方式中，抗原识别受体是 CAR。

在另一方面，本发明提供一种降低受试者中肿瘤负荷的方法，该方法包括对受试者施用有效量的免疫应答细胞，从而诱导受试者中的肿瘤细胞死亡，该免疫应答细胞具有抗原识别受体和可溶性单链可变片段(scFv)，抗原识别受体与第一抗原结合，其中该结合激活免疫应答细胞，可溶性单链可变片段(scFv)与具有免疫抑制活性或免疫刺激活性的多肽结合。在另一方面，本发明提供一种延长具有瘤形成的受试者的存活的方法，该方法涉及对受试者施用有效量的免疫应答细胞，从而延长受试者的存活，该免疫应答细胞具有抗原识别受体和可溶性单链可变片段(scFv)，抗原识别受体与第一抗原结合，其中该结合激活免疫应答细胞，可溶性单链可变片段(scFv)与具有免疫抑制活性或免疫刺激活性的多肽结合。在非限制性实施方式中，抗原识别受体是CAR。

在多种非限制性实施方式中，本发明提供一种增加受试者中应答于癌细胞的免疫激活细胞因子的产生的方法，包括对受试者施用免疫应答细胞，其具有与癌细胞的抗原结合的抗原识别受体并还表达外源性CD40L。在具体的非限制性实施方式中，免疫激活细胞因子为IL-12。在非限制性实施方式中，抗原识别受体是CAR。

在多种非限制性实施方式中，本发明提供一种增加受试者中应答于病原体的免疫激活细胞因子的产生的方法，包括对受试者施用免疫应答细胞，其具有与病原体的抗原结合的抗原识别受体并还表达外源性CD40L。在具体的非限制性实施方式中，免疫激活细胞因子是IL-12。在非限制性实施方式中，抗原识别受体是CAR。

在多种非限制性实施方式中，本发明提供一种增加受试者中对于癌细胞的CD8⁺细胞毒性T细胞应答的方法，包括对受试者施用免疫应答细胞，其具有与癌细胞的抗原结合的抗原识别受体并还表达外源性 CD40L。在非限制性实施方式中，抗原识别受体是CAR。

在多种非限制性实施方式中，本发明提供一种增加受试者中对于病原体的CD8⁺细胞毒性T细胞应答的方法，包括对受试者施用免疫应答细胞，其具有与病原体的抗原结合的抗原识别受体并还表达外源性 CD40L。在非限制性实施方式中，抗原识别受体是CAR。

在多种非限制性实施方式中，本发明提供一种促进具有癌症的受试者中树突状细胞成熟的方法，包括对受试者施用免疫应答细胞，其具有与癌细胞的抗原结合的抗原识别受体并还表达外源性CD40L。在非限制性实施方式中，抗原识别受体是CAR。

在多种非限制性实施方式中，本发明提供一种促进具有病原体导致的疾病的受试者中树突状细胞成熟的方法，包括对受试者施用免疫应答细胞，其具有与病原体的抗原结合的抗原识别受体并还表达外源性CD40L。在非限制性实施方式中，抗原识别受体是CAR。

在另一方面中，本发明提供一种治疗或预防受试者中的瘤形成的方法，该方法包括对受试者施用有效量的免疫应答细胞，从而治疗或预防受试者中的瘤形成，该免疫应答细胞具有抗原识别受体并还表达外源性CD40L，抗原识别受体与第一抗原结合，其中该结合激活免疫应答细胞。在非限制性实施方式中，抗原识别受体是CAR。

在另一方面中，本发明提供一种降低受试者中的肿瘤负荷的方法，该方法包括对受试者施用有效量的免疫应答细胞，从而诱导受试者中的肿瘤细胞死亡，该免疫应答细胞具有抗原识别受体并表达外源性 CD40L，该抗原识别受体与第一抗原结合，其中该结合激活免疫应答细胞。在另一方面中，本发明提供一种延长具有瘤形成的受试者的存活的方法，该方法包括对受试者施用有效量的免疫应答细胞，从而延长受试者的存活，该免疫应答细胞具有抗原识别受体并表达外源性 CD40L，该抗原识别受体与第一抗原结合，其中该结合激活免疫应答细胞。

在另一个方面，本发明提供一种治疗对其有需要的受试者中的血癌的方法，该方法包括对受试者施用治疗有效量的T细胞，从而治疗受试者中的血癌，该免疫应答细胞具有与CD19结合的抗原识别受体 (其中该结合激活免疫应答细胞)以及与CD47、PD-1、CTLA-4及其配体中的一种或多种结合的可溶性单链可变片段(scFv)。在非限制性实施方式中，抗原识别受体是CAR。

在另一个方面，本发明提供一种治疗对其有需要的受试者中的血癌的方法，该方法包括对受试者施用治疗有效量的T细胞，从而治疗受试者中的血癌，该免疫应答细胞具有与CD19结合的抗原识别受体 (其中该结合激活免疫应答细胞)并表达外源性CD40L。在非限制性实施方式中，抗原识别受体是CAR。

在一个方面，本发明提供一种制备抗原特异性免疫应答细胞的方法，该方法包括向免疫应答细胞中导入核酸序列，该核酸序列编码与具有免疫抑制活性或免疫刺激活性的多肽结合的单链可变片段 (scFv)，其中免疫应答细胞具有与抗原结合的抗原识别受体。在非限制性实施方式中，抗原识别受体是CAR。

在一个方面，本发明提供一种制备抗原特异性免疫应答细胞的方法，该方法包括向免疫应答细胞中导入编码CD40L的核酸序列，其中免疫应答细胞具有与抗原结合的抗原识别受体。在非限制性实施方式中，编码CD40L的核酸序列与组成性地或诱导性地在免疫应答细胞中表达、并任选地包含在载体中的启动子元件可操作地连接。在非限制性实施方式中，抗原识别受体是CAR。在非限制性实施方式中，本发明提供包含编码CAR和编码CD40L的序列的核酸，其各自任选地与组成性地或诱导性地在免疫应答细胞中表达的启动子元件可操作地连接，并且所述核酸可以任选地包含在载体中。在一个方面，本发明提供一种载体，其具有编码与抗原结合的抗原识别受体的核酸序列，以及编码与具有免疫抑制活性或免疫刺激活性的多肽结合的可溶性单链可变片段(scFv)的核酸序列。在非限制性实施方式中，抗原识别受体是CAR。

在一个方面，本发明提供一种载体，其具有编码与抗原结合的抗原识别受体的核酸序列，以及编码CD40L的核酸序列。在非限制性实施方式中，抗原识别受体是CAR。在一个特定的非限制性实施方式中，本发明提供一种含有编码抗-CD19 CAR(1928z)和CD40L的核酸的逆转录病毒载体。

在相关的方面，本发明提供一种在药学可接受的赋形剂中包含有效量的本文所述本发明任一方面的免疫应答细胞的药物组合物。在另一个相关方面，本发明提供在药学可接受的赋形剂中含有有效量的本文所述本发明任一方面的肿瘤抗原特异性T细胞且用于治疗瘤形成的药物组合物。

在另外的方面，本发明提供一种用于治疗瘤形成、病原体感染、自身免疫性疾病或同种异体移植的试剂盒，该试剂盒含有免疫应答细胞，该免疫应答细胞具有与抗原结合并激活免疫应答细胞的抗原识别受体以及与具有免疫抑制活性或免疫刺激活性的多肽结合的可溶性单链可变片段(scFv)。在非限制性实施方式中，抗原识别受体是CAR。在特定实施方式中，试剂盒还含有用于使用上述细胞治疗具有瘤形成、病原体感染、自身免疫性疾病或同种异体移植的受试者的书面说明书。

在另外的方面，本发明提供一种用于治疗瘤形成、病原体感染、自身免疫性疾病或同种异体移植的试剂盒，该试剂盒含有免疫应答细胞，该免疫应答细胞具有与抗原结合并激活免疫应答细胞的抗原识别受体并表达外源性CD40L。在非限制性实施方式中，抗原识别受体是 CAR。在特定实施方式中，试剂盒还含有用于使用上述细胞治疗具有瘤形成、病原体感染、自身免疫性疾病或同种异体移植的受试者的书面说明书。

在另外的方面，本发明提供一种用于治疗瘤形成、病原体感染、自身免疫性疾病或同种异体移植的试剂盒，该试剂盒包含编码对要治疗的瘤形成、病原体、自身免疫性疾病或移植的抗原进行识别的CAR 的核酸，以及编码与具有免疫抑制活性或免疫刺激活性的多肽结合的可溶性单链可变片段(scFv)的核酸。任选地，一种或两种核酸可以包含在载体中，其可以是同一载体(双顺反子)或不同的载体。编码 CAR的核酸和/或编码scFv的核酸可以各自与启动子可操作地连接，上述启动子可以是相同的或不同的启动子。在特定实施方式中，试剂盒还含有用于使用上述细胞治疗具有瘤形成、病原体感染、自身免疫性疾病或同种异体移植的受试者的书面说明书。

在另外的方面，本发明提供一种用于治疗癌症的试剂盒，该试剂盒包含编码对癌抗原进行识别的CAR的核酸，以及编码与具有免疫抑制活性或免疫刺激活性的多肽结合的可溶性单链可变片段(scFv)的核酸。任选地，一种或两种核酸可以包含在载体中，其可以是同一载体(双顺反子)或不同的载体。编码CAR的核酸和/或编码scFv的核酸可以各自与启动子可操作地连接，上述启动子可以是相同的或不同的启动子。在特定实施方式中，试剂盒还含有用于使用上述细胞治疗具有癌症的受试者的书面说明书。

在另外的方面，本发明提供一种用于治疗癌症或病原体介导的疾病的试剂盒，该试剂盒包含编码对癌或病原体的抗原进行识别的CAR 的核酸，以及编码与具有免疫抑制活性或免疫刺激活性的多肽结合的可溶性单链可变片段(scFv)的核酸。任选地，一种或两种核酸可以包含在载体中，其可以是同一载体(双顺反子)或不同的载体。编码 CAR的核酸和/或编码scFv的核酸可以各自与启动子可操作地连接，上述启动子可以是相同的或不同的启动子。在特定实施方式中，试剂盒还含有用于使用上述细胞治疗具有癌症或疾病的受试者的书面说明书。在另外的方面，本发明提供一种用于治疗癌症或病原体介导的疾病的试剂盒，该试剂盒包含编码对癌或病原体的抗原进行识别的CAR 的核酸，以及编码CD40L的核酸。任选地，一种或两种核酸可以包含在载体中，其可以是同一载体(双顺反子)或不同的载体。编码CAR 的核酸和/或编码CD40L的核酸可以各自与启动子可操作地连接，上述启动子可以是相同的或不同的启动子。在特定实施方式中，试剂盒还含有用于使用上述细胞治疗具有癌症或疾病的受试者的书面说明书。

在本文所述任意方面的多种实施方式中，细胞选自T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、人胚胎干细胞和由其可以分化出淋巴样细胞的多能干细胞。在本文所述任意方面的多种实施方式中，免疫应答细胞是自体的。

在本文所述任意方面的多种实施方式中，抗原识别受体是T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。在本文所述任意方面的多种实施方式中，抗原识别受体是外源性的或内源性的。在本文所述任意方面的多种实施方式中，抗体识别受体是重组表达的。在本文所述任意方面的多种实施方式中，抗体识别受体由载体表达。在本文所述任意方面的多种实施方式中，抗原识别受体的胞内信号转导结构域是CDζ- 链、CD3ζ-链、CD97、CD11a-CD18、CD2、ICOS、CD27、CD154、 CDS、OX40、4-IBB、CD28信号转导结构域、其部分、或其组合。在非限制性实施方式中，抗原识别受体是包含CD28、4-IBB和/或CD3ζ- 链的至少一部分(参见，例如，Zhong等人,2010,Molecular Ther. 18(2):413-420)连同抗原结合部分的CAR。在非限制性实施方式中，抗原识别受体是Kohn等人,2011,Molecular Ther.19(3): 432-438)中所述的CAR，任选地，其中抗原结合部分被与另一肿瘤或病原体抗原结合的氨基酸序列取代。在多种实施方式中，细胞表达重组的或内源性的抗原受体，其为1928z或4H1128z。

在本文所述任意方面的多种实施方式中，抗原是肿瘤或病原体抗原。在本文所述任意方面的多种实施方式中，肿瘤抗原是CD19、 MUC16、MUC1、CAlX、CEA、CDS、CD7、CD10、CD20、CD22、 CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD49f、CD56、CD74、 CD133、CD138、巨细胞病毒(CMV)感染细胞抗原、EGP-2、EGP-40、 EpCAM、erb-B2,3,4、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、叶酸受体-α、GD2、 GD3、HER-2、hTERT、IL-13R-a2、κ-轻链、KDR、LeY、L1细胞粘附分子、MAGE-A1、间皮素、NKG2D配体、NY-ES0-1、癌胚抗原(h5T4)、 PSCA、PSMA、ROR1、TAG-72、VEGF-R2、或WT-1中的一种或多种。在特定实施方式中，抗原是CD19或MUC16。与所述抗原特异性结合的氨基酸序列在本领域已知，或者可以使用本领域已知的方法制备；例子包括免疫球蛋白、免疫球蛋白的可变区(例如，可变片段(“Fv”) 或二价可变片段(“Fab”))、单链抗体等。

在本文所述任意方面的多种实施方式中，可溶性scFv被分泌。在本文所述任意方面的多种实施方式中，scFv由载体分泌。在本文所述任意方面的多种实施方式中，免疫抑制多肽是CD47、PD-1、CTLA-4 及其配体中的一种或多种。在本文所述任意方面的多种实施方式中，免疫刺激多肽是CD28、OX-40、4-1BB及其配体中的一种或多种。在本文所述任意方面的不同实施方式中，可溶性scFv提高免疫应答细胞的免疫应答。

在本文所述任意方面的多种实施方式中，免疫应答细胞分泌细胞因子。在本文所述任意方面的多种实施方式中，细胞因子由载体表达。在本文所述任意方面的多种实施方式中，含有本发明的免疫应答细胞的药物组合物含有细胞因子。在本文所述任意方面的多种实施方式中，本发明的免疫应答细胞与细胞因子一起给药。在本文所述任意方面的多种实施方式中，细胞因子是IL-2、IL-3、IL-6、IL-11、IL7、IL12、 ILl5、IL21、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、α,β或γ干扰素和红细胞生成素中的一种或多种。

在本文所述任意方面的多种实施方式中，方法减少肿瘤细胞的数目，减少肿瘤大小，根除受试者中的肿瘤，降低受试者中的肿瘤负荷，并且/或者根除受试者中的肿瘤负荷。

可以使用本发明的示例性肿瘤包括，但不限于，白血病(例如，急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性粒细胞白血病、急性早幼粒细胞性白血病、急性粒单核细胞白血病、急性单核细胞性白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金氏病、非霍奇金氏病)、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)、重链病和实体瘤例如肉瘤和癌(例如，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤(Ewing’stumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌(nile duct carcinoma)、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤(Wilm’s tumor)、子宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌(epithelial carcinoma)、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤(oligodenroglioma)、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、成神经细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。

在本文所述任意方面的多种非限制性实施方式中，瘤形成是血癌、 B细胞白血病、多发性骨髓瘤、淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病、非霍奇金氏淋巴瘤和卵巢癌中的一种或多种。在某些实施方式中，血癌是B细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病和非霍奇金氏淋巴瘤中的一种或多种。在特定实施方式中，瘤形成是B细胞白血病，抗原是CD19，且具有免疫抑制活性的多肽是CD47、PD-1、CTLA-4及其配体中的一种或多种。在特定实施方式中，瘤形成是多发性骨髓瘤，抗原是CD19，且具有免疫抑制活性的多肽是CD47、PD-1、CTLA-4及其配体中的一种或多种。在特定实施方式中，瘤形成是急性淋巴细胞性白血病 (ALL)，抗原是CD19，且具有免疫抑制活性的多肽是CD47、PD-1、 CTLA-4及其配体中的一种或多种。在特定实施方式中，瘤形成是慢性淋巴细胞性白血病，抗原是CD19，且具有免疫抑制活性的多肽是 CD47、PD-1、CTLA-4及其配体中的一种或多种。在特定实施方式中，瘤形成是非霍奇金氏淋巴瘤，抗原是CD19，且具有免疫抑制活性的多肽是CD47、PD-1、CTLA-4及其配体中的一种或多种。在特定实施方式中，瘤形成是卵巢癌，抗原是MUC16，且具有免疫抑制活性的多肽是CD47、PD-1、CTLA-4及其配体中的一种或多种。

定义

除非另外指出，本文使用的所有技术和科学术语均具有本领域所属技术领域技术人员通常理解的含义。以下参考文献向本领域技术人员提供本文发明所用的许多术语的通常定义：Singleton等人,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nded.1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988)；The Glossary of Genetics,5th Ed.,R.Rieger等人(eds.),Springer Verlag(1991)；和Hale& Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。如本文所用，除非另外指出，以下术语具有以下归于其的含义。

“激活免疫应答细胞”是指诱导细胞中的信号转导或蛋白表达变化，从而引起免疫应答的起始。例如，当CD3链响应于配体结合和免疫受体酪氨酸类抑制基序(ITAM)而聚簇时，产生信号转导级联反应。在某些实施方式中，当内源性TCR或外源性CAR与抗原结合时，发生免疫突触的形成，其包括许多分子在结合受体(例如，CD4或CD8、 CD3γ/δ/ε/ζ等)附近聚簇。这种膜结合信号转导分子的聚簇使得包含在 CD3链内的ITAM基序变得磷酸化。该磷酸化反过来引发T细胞激活通路，最终激活转录因子，例如NF-κB和AP-1。这些转录因子诱导T 细胞的全局基因表达，以增加IL-2的产生，以用于增殖和主调节器T 细胞蛋白的表达，以引发T细胞介导的免疫应答。“刺激免疫应答细胞” 是指引起稳健且持续的免疫应答的信号。在多种实施方式中，这在免疫细胞(例如T细胞)激活之后发生或者同时而发生，通过包括但不限于CD28、CD137(4-lBB)、OX40、CD40和ICOS的受体介导。无意拘泥于任何特定理论，接收多个刺激信号对于发起稳健且长期的T 细胞介导的免疫应答是重要的。不接收这些刺激信号，T细胞迅速变得受抑制，且对抗原不反应。尽管这些共刺激信号的作用会变化并且仅部分被理解，它们通常引起基因表达的增加，以产生稳健地应答于抗原的长期增殖性且抗细胞凋亡的T-细胞，以用于完全且持续的根除。

如本文所用，术语“抗原识别受体”是指能够响应于抗原结合而激活免疫细胞(例如T-细胞)的受体。示例性的抗原识别受体可以是天然的或内源性的T细胞受体或肿瘤抗原结合结构域与能够激活免疫细胞(例如T-细胞)的胞内信号转导结构域融合的嵌合抗原受体。

如本文所用，术语“抗体”不仅指完整的抗体分子，还指抗体分子的保持免疫原结合能力的片段。这些片段也是本领域公知的，并经常在体外和在体内使用。因此，如本文所用，术语“抗体”不仅指完整的免疫球蛋白分子，还指公知的活性片段F(ab')₂和Fab。F(ab')₂和 Fab片段缺少完整抗体的Fe片段，更迅速地从循环中清除，并且可能具有完整抗体的稍弱的非特异性组织结合(Wahl等人,J.Nucl.Med. 24:316-325(1983))。本发明的抗体包括完整内生抗体、双特异性抗体；嵌合抗体；Fab、Fab’、单链V区片段(scFv)、融合多肽以及非常规抗体。

如本文所用，术语“单链可变片段”或“scFv”是共价连接形成 VH::VL杂二聚体的免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)可变区的融合蛋白。重链(VH)和轻链(VL)直接连接，或者通过肽编码连接头(linker)(例如，10、15、20、25个氨基酸)连接，其将VH的N- 端与VL的C-端连接，或者将VH的C-端与VL的N-端连接。连接头通常富含用于柔性的甘氨酸，以及用于溶解性的丝氨酸或苏氨酸。尽管除去恒定区并引入连接头，scFv蛋白保留原始免疫球蛋白的特异性。单链Fv多肽抗体可以由包含VH-和VL-编码序列的核酸表达，如 Huston等人所述(Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:5879-5883,1988)。另外，参见，美国专利第5,091,513号、第5,132,405号和第4,956,778号；以及美国专利公开第20050196754号和第20050196754号。已经描述了具有抑制活性的拮抗性scFv(参见，例如，Zhao等人,Hyrbidoma (Larchmt)2008 27(6):455-51；Peter等人,J Cachexia Sarcopenia Muscle2012 August 12；Shieh等人,J Imunol2009 183(4):2277-85；Giomarelli 等人,ThrombHaemost 2007 97(6):955-63；Fife等人,J Clin Invst 2006 116(8):2252-61；Brocks等人,Immunotechnology 1997 3(3):173-84； Moosmayer等人,Ther Immunol 1995 2(10:31-40))。已经描述了具有刺激活性的激动性scFv(参见，例如Peter等人,J Bioi Chern2003 25278(38):36740-7；Xie等人,Nat Biotech 1997 15(8):768-71；Ledbetter 等人,Crit Rev Immunol1997 17(5-6):427-55；Ho等人,BioChim Biophys Acta 2003 1638(3):257-66))。

“亲和性”是指结合强度的度量。无意拘泥于理论，亲和性取决于抗体结合位点和抗原决定簇之间立体化学配合密切度，取决于它们之间接触面积的大小，并取决于带电疏水基团的分布。亲和性也包括术语“(抗原和抗体)的亲合力”，其是指形成不可逆的复合物之后抗原-抗体结合的强度。计算抗体对于抗原的亲和性的方法是本领域已知的，包括使用结合实验来计算亲和性。功能检验(例如，流式细胞术) 中的抗体活性也反映抗体亲和性。抗体和亲和性可以在表型上加以表征，并使用功能检验(例如，流式细胞术)比较。

如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指与能够激活或刺激免疫细胞的胞内信号转导结构域融合的抗原结合结构域。最常见地，CAR的胞外结合结构域由融合鼠科或人源化单克隆抗体的可变重区与轻区而产生的单链可变片段(scFv)组成。另外可选地，可以使用源自Fab的scFv(代替源自抗体的scFv，例如，获自Fab文库)。在多种实施方式中，该scFv与跨膜结构域融合，然后与胞内信号转导结构域融合。“第一代”CAR包括在抗原结合时仅仅提供CD3ζ信号的那些，“第二代”CAR包括提供共刺激(例如CD28或CD137)和激活 (CD3ζ)的那些。“第三代”CAR包括提供多种共刺激(例如CD28 和CD137)和激活(CD3ζ)的那些。在多种实施方式中，CAR选择成对于抗原具有高的亲和性或亲合力。

术语“免疫抑制活性”是指在细胞(例如，激活的免疫应答细胞) 中诱导信号转导或蛋白表达变化，从而引起免疫应答的降低。已知经由其结合而抑制或降低免疫应答的多肽包括CD47、PD-1、CTLA-4及其相应的配体，包括SIRPa、PD-L1、PD-L2、B7-1和B7-2。这些多肽存在于肿瘤微环境中，并抑制对赘生性细胞的免疫应答。在多种实施方式中，抑制、阻断或拮抗免疫抑制多肽和/或其配体的相互作用会提高免疫应答细胞的免疫应答。

术语“免疫刺激活性”是指在细胞(例如，激活的免疫应答细胞) 中诱导信号转导或蛋白表达变化，从而引起免疫应答的增加。免疫刺激活性可以包括促炎活性。已知经由其结合而刺激或增加免疫应答的多肽包括CD28、OX-40、4-1BB及其相应的配体，包括B7-1、B7-2、 OX-40L和4-1BBL。这些多肽存在于肿瘤微环境中，并激活对赘生性细胞的免疫应答。在多种实施方式中，促进、刺激促炎多肽和/或其配体或使其激动会提高免疫应答细胞的免疫应答。

“CD3ζ多肽”是指与具有激活或刺激活性的NCBI参考号: NP_932170或其片段具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、 99％或100％同一性的蛋白。示例性的CD3ζ提供如下[SEQ ID NO:1]。

“CD3ζ核酸分子是指编码CD3ζ多肽的多核苷酸。

“CD28多肽”是指与具有刺激活性的NCBI参考号:NP_006130 或其片段具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的蛋白。示例性的CD28提供如下[SEQ ID NO:2]。

“CD28核酸分子”是指编码CD28多肽的多核苷酸。

“CD40L多肽”是指与NCBI参考序列:NP_000065、GenBank参考号.GenBank:AAH74950.1或其片段具有至少85％、90％、95％、96％、 97％、98％、99％或100％同一性的蛋白，或者为使用以下引物(1) 5’-CACGTGCATGATCGAAACATACAACCAAACTTCTCCCCGATCT GC-‘3[SEQ ID NO:3]和(2)5’-CTCGAGGGATCCTC AGAGTTTGAGTAAGCCAAAGGA-3’[SEQ ID NO:4]从分离的健康供体PBMC中通过PCR扩增的核酸所编码的蛋白(图22A)。

“CD40L核酸分子”是指编码CD40L多肽的多核苷酸。

“4-1BB多肽”是指与作为肿瘤坏死因子(TNF)配体的NCBI 参考号:P41273或NP_001552或其片段具有至少85％、90％、95％、96％、 97％、98％、2599％或100％同一性的蛋白。示例性的4-1BB提供如下 [SEQ ID NO:5]。

“4-1BBL核酸分子”是指编码4-1BBL多肽的多核苷酸。

“OX40L多肽”是指与作为肿瘤坏死因子(TNF)配体[SEQ ID NO:6]的NCBI参考号:BAB18304或NP_003317或其片段具有至少 85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的蛋白。

“OX40L核酸分子”是指编码OX40L多肽的多核苷酸。

“1928z”是指与以下所提供序列[SEQ ID NO:7]具有至少85％、 90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的蛋白，并能够结合CD19，该序列包括在氨基酸1-18处的CDS前导序列。

示例性的包括CDS前导序列的编码1928z多肽的核酸序列提供如下[SEQ ID NO:8]。

“4H1128z”是指与以下所提供序列[SEQ ID NO:9]具有至少85％、 90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的蛋白，并能够结合MUC，该序列包括在氨基酸1-18处的CDS前导序列。

示例性的包括κ前导序列的编码4Hll28z多肽的核酸序列提供如下 [SEQ ID NO:10]。

“B6Hl2.2 scFv”是指与以下所提供序列[SEQ ID NO:11]具有至少 85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的蛋白，并能够结合CD47。

“5C4 scFv”是指与以下所提供序列[SEQ ID NO:12]具有至少 85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的蛋白，并能够结合人PD-1。

“J43 scFv”是指与以下所提供序列[SEQ ID NO:13]具有至少85％、 90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的蛋白，并能够结合人PD-1，该序列包括在氨基酸1-21处的κ前导序列。

示例性的包括κ前导序列的编码J43 scFv多肽的核酸序列提供如下[SEQ ID NO:14]。

可用于本发明方法的核酸分子包括任何编码本发明的多肽或其片段的核酸分子。这些核酸分子不需要与内源性核酸序列100％相同，但通常将表现出相当程度的同一性。与内源性序列具有“相当程度的同一性”的多核苷酸通常能够与双链核酸分子的至少一条链杂交。“杂交” 是指在各种严格性条件下在互补性多核苷酸序列(例如，本文所述的基因)或其部分之间配对形成双链分子。(参见，例如Wahl,G.M.和 S.L.Berger(1987)Methods Enzymol.152:399；Kimmel,A.R.(1987) Methods Enzymol.152:507)。

例如，严格的盐浓度将通常小于约750mM NaCl和75mM柠檬酸三钠，优选小于约500mM NaCl和50mM柠檬酸三钠，且更优选小于约250mM NaCl和25mM柠檬酸三钠。低严格性杂交可以在不存在有机溶剂例如甲酰胺的情况下获得，而高严格性杂交可以在存在至少约 35％甲酰胺、更优选至少约50％甲酰胺的情况下获得。严格的温度条件将通常包括至少约30℃、更优选至少约37℃、且最优选至少约42℃ 的温度。变化的其他参数，例如杂交时间、清洁剂例如十二烷基磺酸钠(SDS)的浓度以及包括还是排除载体DNA，是本领域技术人员公知的。不同的严格性水平通过根据需要将这些不同的条件组合来实现。在优选的实施方式中，杂交将在30℃下在750mM NaCl、75mM柠檬酸三钠和1％SDS中发生。在更优选的实施方式中，杂交将会在37℃ 下在500mM NaCl、50mM柠檬酸三钠、1％SDS、35％甲酰胺和100 μg/ml变性鲑鱼精子DNA(ssDNA)中发生。在最优选的实施方式中，杂交将会在42℃下在250mM NaCl、25mM柠檬酸三钠、1％SDS、50％甲酰胺和200μg/ml ssDNA中发生。有关这些条件的可用变化对本领域技术人员来说将会是显而易见的。

对于大多数应用，杂交之后的洗涤步骤也将会在严格性方面变化。洗涤严格性条件可以通过盐浓度及通过温度定义。如上，洗涤严格性可以通过降低盐浓度或者通过增加温度来提高。例如，用于洗涤步骤的严格的盐浓度将优选为小于约30mM NaCl及3mM柠檬酸三钠，最优选小于约15mM NaCl及1.5mM柠檬酸三钠。用于洗涤步骤的严格温度条件将通常包括至少约25℃、更优选至少约42℃、进而更优选至少约68℃的温度。在优选的实施方式中，洗涤步骤将会在25℃下在30 mM NaCl、3mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中进行。在更优选的实施方式中，洗涤步骤将会在42℃下在15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和 0.1％SDS中进行。在更优选的实施方式中，洗涤步骤将会在68℃下在 15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中进行。有关这些条件的其他变化对于本领域技术人员来说将很容易是显而易见的。杂交技术是本领域技术人员公知的，且记载于，例如，Benton和Davis(Science 196:180,1977)；Grunstein and Rogness(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 72:3961,1975)；Ausubel等人(Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience,New York,2001)；Berger and Kimmel(Guide to Molecular Cloning Techniques,1987,AcademicPress,New York)；和 Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,New York。

“基本上相同”是指多肽或核酸分子表现出与参照氨基酸序列(例如，本文所述氨基酸序列中任一个)或核酸序列(例如，本文所述核酸序列中任一个)的至少50％的同一性。优选地，这样的序列与用于对比的序列在氨基酸水平或核酸水平上为至少60％、更优选80％或 85％、更优选90％、95％或甚至99％相同。

序列同一性通常使用序列分析软件(例如，Genetics Computer Group,University of Wisconsin Biotechnology Center,1710 University Avenue,Madison,Wis.53705的序列分析软件包，BLAST、BESTFIT、 GAP或PILEUP/PRETTYBOX程序)测量。这些软件通过比对与各种置换、缺失和/或其他修饰的同源性程度来匹配相同或相似的序列。保守置换通常包括在以下组别内的置换：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。在测定同一性程度的示例性方法中，可以使用BLAST程序，概率评分在e-3与e-100之间，表示序列密切相关。

“类似物”是指具有参照多肽或核酸分子的功能的结构上相关的多肽或核酸分子。

如本文所用，术语“配体”是指与受体结合的分子。具体地，配体与另一细胞上的受体结合，使得可以进行细胞-细胞识别和/或相互作用。

如本文所用，术语“组成性表达”是指在所有生理条件下均表达。

“疾病”是指任何损害或干扰细胞、组织或器官正常功能的病状和障碍。疾病的例子包括瘤形成或细胞的病原体感染。

“有效量”是指足以具有治疗效果的量。在一个实施方式中，“有效量”是指足以阻止、减轻或抑制瘤形成的持续增殖、生长或转移(例如，侵入或迁移)的量。

“内源性”是指核酸分子或多肽正常地在细胞或组织中表达。

“强制执行耐受性(enforcing tolerance)”是指防止靶向移植器官或组织的自反应性细胞或免疫应答细胞的活性。

“外源性”是指核酸分子或多肽并不内源性地存在于细胞中，或者并未以足以达到在过表达时得到的功能效果的水平存在。因此，术语“外源性”包括任何在细胞中表达的重组核酸分子或多肽，例如，外来的、异源性的以及过表达的核酸分子和多肽。

“异源性核酸分子或多肽”是指核酸分子(例如，cDNA、DNA 或RNA分子)或多肽在正常情况下不存在于细胞或获自细胞的样品中。这种核酸可以来自另一有机体，或者，其可以是，例如，通常不在细胞或样品中表达的mRNA分子。

“免疫应答细胞”是指在免疫应答中发挥作用的细胞或其祖细胞或子代。

“增加”是指正向地变化至少5％。变化可以是5％、10％、25％、 30％、50％、75％或者甚至100％。

“分离的细胞”是指与天然伴随细胞的分子和/或细胞组分分离的细胞。

术语“分离的”、“纯化的”或“生物纯的”是指材料在不同程度上不含在其天然状态下通常伴随其的组分。“分离”是指与原始来源或环境的分开程度。“纯化”是指高于分离的分开程度。“纯化的”或“生物纯的”蛋白充分地不含其他材料，使得没有任何杂质对蛋白的生物特性产生相当的影响或者造成其他不利后果。也就是说，本发明的核酸或肽如果基本不含细胞材料、病毒材料或培养介质(当通过重组DNA 技术产生时)或化学前体或其他化学品(当化学合成时)，则是纯化的。纯度和均一性通常使用分析化学技术确定，例如，聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱。术语“纯化的”可以是指，核酸或蛋白在电泳凝胶中基本给出一条条带。对于可以进行修饰例如磷酸化或糖基化的蛋白，不同的修饰可以给出不同的分离蛋白，其可以分别纯化。

如本文所用，术语“肿瘤抗原结合结构域”是指能够特异性地结合存在于肿瘤上的特定抗原决定簇或一组抗原决定簇的结构域。

“获得作用剂”中的术语“获得”意在包括购买、合成或者以其他方式获取作用剂(或者所示的物质或材料)。

如本文所用，“连接头”是指将两个或更多个多肽或核酸分子共价连接以使得它们彼此相连的官能团(例如，化学品或多肽)。如本文所用，“肽连接头”是指一个或多个用于将两个蛋白连接在一起(例如，使V_H和V_L结构域结合)的氨基酸。用于本发明的示例性连接序列为 GGGGSGGGGSGGGGS[SEQ ID NO:51]。

“调节”是指正向地或负向地改变。示例性的调节包括1％、2％、 5％、10％、25％、50％、75％或100％的变化。

“瘤形成”是指以细胞或组织的病变性增殖及其后续迁移或侵入至其他组织或器官为特征的疾病。瘤形成的生长通常是不受控制的且进行性的，并且在不会引起正常细胞繁殖或者导致其停止的条件下发生。瘤形成会影响许多种细胞类型、组织或器官，包括但不限于，选自膀胱、骨、脑、乳房、软骨、神经胶质、食管、输卵管、胆囊、心脏、肠、肾、肝、肺、淋巴结、神经组织、卵巢、胰腺、前列腺、骨骼肌、皮肤、脊髓、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、泌尿生殖道、输尿管、尿道、子宫和阴道中的器官或其组织或细胞类型。瘤形成包括癌症，例如肉瘤、癌或浆细胞瘤(浆细胞的恶性肿瘤)。

“病原体”是指能够引起疾病的病毒、细菌、真菌、寄生虫或原生动物。

示例性的病毒包括，但不限于，逆转录病毒科(Retroviridae)(例如，人免疫缺陷病毒，例如HIV-1(也称作HDTV-III、LAVE或 HTLV-III/LAV或HIV-III；以及其他分离物例如HIV-LP)；小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)(例如，脊髓灰质炎病毒、甲肝病毒；肠道病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒、艾柯病毒)；杯状病毒(Calciviridae)(例如，导致肠胃炎的菌株)；批膜病毒(Togaviridae)(例如，马脑炎病毒、风疹病毒)；纤丝病毒(Flaviridae)(例如，登革热病毒、脑炎病毒、黄热病病毒)；冠状病毒(Coronoviridae)(例如，冠状病毒)；弹状病毒(Rhabdoviridae)(例如，水疱性口炎病毒、狂犬病毒)；丝状病毒 (Filoviridae)(例如，埃博拉病毒)；副黏病毒(Paramyxoviridae)(例如，副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞体病毒)；正黏病毒(Orthomyxoviridae)(例如，流感病毒)；布尼亚病毒(Bungaviridae) (例如，汉坦病毒、bunga病毒、白蛉病毒和奈洛病毒)；沙状病毒(Arenaviridae)(出血热病毒)；呼肠病毒(Reoviridae)(例如，呼肠孤病毒、环状病毒和轮状病毒)；双核糖核酸病毒(Birnaviridae)；嗜肝病毒 (Hepadnaviridae)(乙肝病毒)；细小病毒(Parvovirida)(细小病毒)；乳多空病毒(Papovaviridae)(乳头状瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒 (Adenoviridae)(大多数腺病毒)；疱疹病毒(Herpesviridae)(单纯性疱疹病毒(HSV)1和2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、疱疹病毒)；痘病毒(Poxviridae)(天花病毒、牛痘病毒、痘病毒(pox viruses))；和虹彩病毒(Iridoviridae)(例如，非洲猪热病病毒)；和未分类的病毒(例如，丁型肝炎药剂(视作是乙肝病毒的缺陷随体)、非甲乙肝炎的药剂(1类＝内部传播；2类＝非肠道传播(即，丙肝)；诺瓦克和相关病毒以及星状病毒)。

示例性的细菌包括，但不限于，巴斯德氏菌(Pasteurella)、葡萄球菌(Staphylococci)链球菌(Streptococcus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、假单胞菌(Pseudomonas)和沙门氏菌(Salmonella)。感染性细菌的具体实例包括但不限于幽门螺旋杆菌(Helicobacter pyloris)、博氏疏螺旋体(Borelia burgdoiferi)、嗜肺性军团病杆菌(Legionella pneumophilia)、分枝杆菌(Mycobacteria)(例如，结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、M.avium、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、M.kansaii、戈登分枝杆菌(M.gordonae))、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌 (Neisseria meningitidis)、单核细胞增多性李司忒氏菌(Listeria monocytogenes)、化脓链球菌(Streptococcuspyogenes)(A类链球菌)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B类链球菌)、链球菌 (Streptococcus)(绿色链球菌类)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、链球菌(Streptococcus)(厌氧种)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、病原性弯曲杆菌(Campylobacter sp.)、肠球菌(Enterococcus sp.)、流感嗜血杆菌 (Haemophilusinfluenzae)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus antracis)、白喉棒状杆菌(corynebacteriumdiphtheriae)、棒状杆菌(corynebacterium sp.)、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)、产气荚膜梭状芽胞杆菌(Clostridium perfringers)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、克雷氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)、多杀巴斯德菌(Pasturella multocida)、拟杆菌(Bacteroidessp.)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、念珠状链杆菌 (Streptobacillusmoniliformis)、苍白密螺旋体(Treponema pallidium)、细弱密螺旋体(Treponemapertenue)、钩端螺旋体(Leptospira)、立克次氏体(Rickettsia)、和以色列放线菌(Actinomyces israelli)。

“受体”是指选择性地与一种或多种配体结合的存在于细胞膜上的多肽或其部分。

“降低”是指负向地变化至少5％。变化可以是5％、10％、25％、 30％、50％、75％或者甚至100％。

“识别”是指选择性地与目标物结合。识别病毒的T细胞通常表达与病毒表达的抗原结合的受体。

“参照”或“对照”是指比较的标准。例如，表达CAR和scFv 的细胞的scFv-抗原结合水平可以与在仅表达CAR的对应细胞中的 scFv-抗原结合水平进行比较。

“分泌的”是指多肽通过内质网、高尔基体经由分泌通路由细胞释放，以及作为暂时融合在细胞质膜处并将蛋白释放到细胞外部的囊泡而释放。

“信号序列”或“前导序列”是指在新合成蛋白的N-端处的指导其进入分泌通路的肽序列(长度为5、10、15、20、25、30个氨基酸)。示例性的前导序列包括κ前导序列：METDTLLLWVLLLWVPGSTGD [SEQ ID NO:15](人)、METDTLLLWVLLLWVPGSTGD[SEQ ID NO:16](小鼠)；和CDS前导序列：MALPVTALLLPLALLLHAARP[SEQ ID NO:17]。

“可溶的”是指多肽游离地扩散于水性环境中(例如，非膜结合的)。

“特异性结合”是指多肽或其片段识别并结合所关注的生物分子 (例如，多肽)，但基本上不识别并结合样本(例如，天然地包含本发明多肽的生物样本)中的其他分子。

如本文所用，术语“肿瘤抗原”是指与正常或非IS赘生性细胞相比独特地或差异性地在肿瘤细胞上表达的抗原(例如多肽)。参照本发明，肿瘤抗原包括任何由能够经由抗原识别受体(例如CD19、MUCI) 激活或诱导免疫应答或者能够经由受体-配体结合(例如CD47、 PD-Ll/L2、B7.1/2)抑制免疫应答的肿瘤所表达的多肽。

“病毒抗原”是指由能够诱导免疫应答的病毒所表达的多肽。

术语“包括”、“包含”、和意在具有美国专利法中赋予的的广义含义，并且可以表示“包含有”、“含有”等。

如本文所用，“治疗”是指致力于改变被治疗的个体或细胞的疾病进程的临床干预，并且可以用于预防或者在临床病理过程中进行。治疗的治疗效果包括，但不限于，预防疾病的发生或复发、减轻症状、消除疾病的任何直接或间接病理后果、防止转移、降低疾病进展的速度、改善或减轻疾病状态以及预后缓解或改善。通过防止疾病或病症的进展，治疗可以防止由感染或诊断的受试者或疑似具有该病症的受试者中的病症所引起的恶化，疾病还可以防止在处于该病症风险或疑似具有该病症的受试者中病症或病症症状的发作。

如本文所用，术语“受试者”是指脊椎动物，优选为哺乳动物，更优选为人。

如本文所使用，术语“免疫受损的”是指受试者具有免疫缺陷。受试者非常易容易遭受机会性感染，由通常不在具有健康免疫系统的人中造成疾病但可以感染免疫系统功能差或受抑制的人的微生物所引起的感染。

本发明的其他方面在以下公开内容中说明，并且在本发明的范围之内。

1.一种分离的免疫应答细胞，其包含：

1)抗原识别受体，其与抗原结合，其中该结合激活所述免疫应答细胞，和

2)可溶性单链可变片段(scFv)，其与具有免疫抑制活性或免疫刺激活性的多肽结合。

2.根据实施方式1所述的分离的免疫应答细胞，其中，所述抗原是肿瘤或病原体抗原。

3.根据实施方式1所述的分离的免疫应答细胞，其中，所述可溶性scFv被分泌。

4.根据实施方式1-3中任一项所述的分离的免疫应答细胞，其中，所述抗原识别受体是T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。

5.根据实施方式1-4中任一项所述的分离的免疫应答细胞，其中，所述抗原识别受体是外源性的或内源性的。

6.根据实施方式1-5中任一项所述的分离的免疫应答细胞，其中，所述抗原识别受体是重组表达的。

7.根据实施方式1-6中任一项所述的分离的免疫应答细胞，其中，所述抗原识别受体由载体表达。

8.根据实施方式1-7中任一项所述的分离的免疫应答细胞，其中，所述scFv由载体表达。

9.根据实施方式1-8中任一项所述的分离的免疫应答细胞，其中，所述细胞选自T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)、调节性T细胞、人胚胎干细胞和可分化出淋巴样细胞的多能干细胞。

10.根据实施方式1-9中任一项所述的分离的免疫应答细胞，其中，所述免疫应答细胞是自体的。

11.根据实施方式1-10中任一项所述的分离的免疫应答细胞，其中，所述抗原是选自CD19、MUC16、MUCl、CAlX、CEA、CDS、 CD7、CD10、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、 CD44、CD49f、CD56、CD74、CD133、CD138、巨细胞病毒(CMV) 感染细胞抗原、EGP-2、EGP-40、EpCAM、erb-B2,3,4、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、叶酸受体-a、GD2、GD3、HER-2、hTERT、IL-13R-a2、 K-轻链、KDR、LeY、L1细胞粘附分子、MAGE-A1、间皮素、NKG2D 配体、NY-ES0-1、癌胚抗原(h5T4)、PSCA、PSMA、ROR1、TAG-72、 VEGF-R2或WT-1中的肿瘤抗原。

12.根据实施方式1-11中任一项所述的分离的免疫应答细胞，其中，所述免疫抑制多肽选自CD47、PD-1、CTLA-4及其配体。

13.根据实施方式1-11中任一项所述的分离的免疫应答细胞，其中，所述免疫刺激多肽选自CD28、OX-40、4-1BB及其配体。

14.根据实施方式1-13中任一项所述的分离的免疫应答细胞，其中，所述抗原是CD19或MUC16。

15.根据实施方式1-14中任一项所述的分离的免疫应答细胞，其中，所述抗原识别受体的胞内信号转导结构域是CD3ζ-链、CD97、 CD11a-CD18、CD2、ICOS、CD27、CD154、CDS、OX40、4-1BB、 CD28信号转导结构域或其组合。

16.根据实施方式1-15中任一项所述的分离的免疫应答细胞，其中，所述细胞表达重组的或内源性的抗原受体，所述重组的或内源性的抗原受体为1928z或4H1128z。

17.根据实施方式1-16中任一项所述的分离的免疫应答细胞，其中，所述可溶性scFv提高所述免疫应答细胞的免疫应答。

18.一种降低受试者中肿瘤负荷的方法，所述方法包括施用有效量的免疫应答细胞，从而诱导受试者中的肿瘤细胞死亡，所述免疫应答细胞包含抗原识别受体和可溶性单链可变片段(scFv)，所述抗原识别受体与第一抗原结合，其中该结合激活所述免疫应答细胞，所述可溶性单链可变片段(scFv)与具有免疫抑制活性或免疫刺激活性的多肽结合。

19.根据实施方式18所述的方法，其中，所述方法减少肿瘤细胞的数量。

20.根据实施方式18所述的方法，其中，所述方法减少肿瘤的大小。

21.根据实施方式18所述的方法，其中，所述方法根除受试者中的肿瘤。

22.一种提高具有瘤形成的受试者的存活的方法，所述方法包括施用有效量的免疫应答细胞，从而治疗或预防受试者中的瘤形成，所述免疫应答细胞包含抗原识别受体和可溶性单链可变片段(scFv)，所述抗原识别受体与第一抗原结合，其中该结合激活所述免疫应答细胞，所述可溶性单链可变片段(scFv)与具有免疫抑制活性或免疫刺激活性的多肽结合。

23.根据实施方式22所述的方法，其中，所述瘤形成选自血癌、 B细胞白血病、多发性骨髓瘤、淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病、非霍奇金氏淋巴瘤和卵巢癌。

24.根据实施方式23所述的方法，其中，所述瘤形成是B细胞白血病，所述抗原是CD19，且所述具有免疫抑制活性的多肽是CD47、 PD-1、CTLA-4及其配体中的一种或多种。

25.根据实施方式23所述的方法，其中，所述瘤形成是多发性骨髓瘤，所述抗原是CD19，且所述具有免疫抑制活性的多肽是CD47、 PD-1、CTLA-4及其配体中的一种或多种。

26.根据实施方式23所述的方法，其中，所述瘤形成是急性淋巴细胞性白血病(ALL)，所述抗原是CD19，且所述具有免疫抑制活性的多肽是CD47、PD-1、CTLA-4及其配体中的一种或多种。

27.根据实施方式23所述的方法，其中，所述瘤形成是慢性淋巴细胞性白血病，所述抗原是CD19，且所述具有免疫抑制活性的多肽是 CD47、PD-1、CTLA-4及其配体中的一种或多种。

28.根据实施方式23所述的方法，其中，所述瘤形成是非霍奇金氏淋巴瘤，所述抗原是CD19，且所述具有免疫抑制活性的多肽是 CD47、PD-1、CTLA-4及其配体中的一种或多种。

29.根据实施方式23所述的方法，其中，所述瘤形成是卵巢癌，所述抗原是MUC16，且所述具有免疫抑制活性的多肽是CD47、PD-1、 CTLA-4及其配体中的一种或多种。

30.根据实施方式22-29中任一项所述的方法，其中，所述可溶性 scFv被分泌。

31.根据实施方式22-30中任一项所述的方法，其中，所述scFv 由载体表达。

32.根据实施方式22-31中任一项所述的方法，其中，所述可溶性 scFv提高所述免疫应答细胞的免疫应答。

33.根据实施方式22-32中任一项所述的方法，其中，所述抗原识别受体是T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。

34.根据实施方式22-33中任一项所述的方法，其中，所述抗原识别受体是外源性的或内源性的。

35.根据实施方式22-34中任一项所述的方法，其中，所述抗原识别受体是重组表达的。

36.根据实施方式22-35中任一项所述的方法，其中，所述抗原识别受体由载体表达。

37.根据实施方式22-36中任一项所述的方法，其中，所述细胞选自T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、人胚胎干细胞和可分化出淋巴样细胞的多能干细胞。

38.根据实施方式22-37中任一项所述的方法，其中，所述方法降低或根除受试者中的肿瘤负荷。

39.一种制备抗原特异性免疫应答细胞的方法，所述方法包括向所述免疫应答细胞中导入核酸序列，所述核酸序列编码与具有免疫抑制活性或免疫刺激活性的多肽结合的单链可变片段(scFv)，其中所述免疫应答细胞包含与抗原结合的抗原识别受体。

40.根据实施方式39所述的方法，其中，所述可溶性scFv被分泌。

41.根据实施方式39或40所述的方法，其中，所述scFv由载体表达。

42.根据实施方式39-41中任一项所述的方法，其中，所述可溶性 scFv提高所述免疫应答细胞的免疫应答。

43.根据实施方式39-42中任一项所述的方法，其中，所述免疫抑制多肽选自CD47、PD-1、CTLA-4及其配体。

44.根据实施方式39-42中任一项所述的方法，其中，所述免疫刺激多肽选自CD28、OX-40、4-lBB及其配体。

45.根据实施方式39-44中任一项所述的方法，其中，所述抗原识别受体是T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。

46.根据实施方式39-45中任一项所述的方法，其中，所述抗原识别受体是外源性的或内源性的。

47.根据实施方式39-46中任一项所述的方法，其中，所述抗原识别受体是重组表达的。

48.根据实施方式39-47中任一项所述的方法，其中，所述抗原识别受体由载体表达。

49.根据实施方式39-48中任一项所述的方法，其中，所述细胞选自T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、调节性T细胞、人胚胎干细胞和可分化出淋巴样细胞的多能干细胞。

50.根据实施方式39-49中任一项所述的方法，其中，所述抗原识别受体的胞内信号转导结构域是CD3ζ-链、CD97、CD11a-CD18、CD2、ICOS、CD27、CD154、CDS、OX40、4-1BB、CD28信号转导结构域或其组合。

51.一种治疗有需要的受试者中的血癌的方法，所述方法包括对受试者施用治疗有效量的T细胞，从而治疗受试者中的血癌，所述T细胞包含抗原识别受体和可溶性单链可变片段(scFv)，所述抗原识别受体与CD19结合，其中该结合激活所述免疫应答细胞，所述可溶性单链可变片段(scFv)与CD47、PD-1、CTLA-4及其配体中的一种或多种结合。

52.根据实施方式51所述的方法，其中，血癌选自B细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病和非霍奇金氏淋巴瘤。

53.一种载体，其包含编码与抗原结合的抗原识别受体的核酸序列以及编码与具有免疫抑制活性或免疫刺激活性的多肽结合的可溶性单链可变片段(scFv)的核酸序列。

54.一种药物组合物，其在药学可接受的赋形剂中包含有效量的实施方式1-18中任一项所述的免疫应答细胞。

55.一种用于治疗瘤形成的药物组合物，其在药学可接受的赋形剂中包含有效量的实施方式1-18中任一项所述的肿瘤抗原特异性T细胞。

56.一种试剂盒，其用于治疗瘤形成、病原体感染、自身免疫性疾病或同种异体移植，所述试剂盒包含免疫应答细胞，所述免疫应答细胞包含与抗原结合并激活所述免疫应答细胞的抗原识别受体、以及与具有免疫抑制活性或免疫刺激活性的多肽结合的可溶性单链可变片段 (scFv)。

57.根据实施方式56所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包含用于使用所述细胞来治疗具有瘤形成、病原体感染、自身免疫性疾病或同种异体移植的受试者的书面说明书。

58.一种免疫应答细胞，其表达具有免疫细胞激活活性的抗原结合受体以及外源性CD40L。

59.根据实施方式58所述的免疫应答细胞，其中，所述抗原结合受体是嵌合抗原受体。

60.根据实施方式59所述的免疫应答细胞，其中，所述嵌合抗原受体识别肿瘤抗原。

61.根据实施方式58-60中任一项所述的免疫应答细胞，其中，所述免疫应答细胞选自T细胞、自然杀伤细胞、细胞毒性T细胞和调节性T细胞。

62.一种增加受试者中响应于癌细胞或病原体的免疫激活细胞因子的产生的方法，其包括对受试者施用免疫应答细胞，所述免疫应答细胞具有分别与癌细胞或病原体的抗原结合的抗原识别受体，并还表达外源性CD40L。

63.根据实施方式62所述的方法，其中，所述抗原结合受体是嵌合抗原受体。

64.根据实施方式63所述的方法，其中，所述嵌合抗原受体识别癌抗原。

65.根据实施方式62-64中任一项所述的方法，其中，所述免疫应答细胞选自T细胞、自然杀伤细胞、细胞毒性T细胞和调节性T细胞。

66.根据实施方式62-65中任一项所述的方法，其中，所述细胞因子是IL-12。

67.一种增加受试者中CD8+细胞毒性T细胞对癌细胞或病原体的应答的方法，其包括对受试者施用免疫应答细胞，所述免疫应答细胞具有分别与癌细胞或病原体的抗原结合的抗原识别受体，并还表达外源性CD40L。

68.根据实施方式67所述的方法，其中，所述抗原结合受体是嵌合抗原受体。

69.根据实施方式68所述的方法，其中，所述嵌合抗原受体识别癌抗原。

70.根据实施方式67-69中任意项所述的方法，其中，所述免疫应答细胞选自T细胞、自然杀伤细胞、细胞毒性T细胞和调节性T细胞。

71.一种增加具有癌症或具有病原体引起的疾病的受试者中树突状细胞的成熟的方法，其包括对受试者施用免疫应答细胞，所述免疫应答细胞具有分别与癌细胞或病原体的抗原结合的抗原识别受体，并还表达外源性CD40L。

72.根据实施方式71所述的方法，其中，所述抗原结合受体是嵌合抗原受体。

73.根据实施方式72所述的方法，其中，所述嵌合抗原受体识别癌抗原。

74.根据实施方式71-73中任一项所述的方法，其中，所述免疫应答细胞选自T细胞、自然杀伤细胞、细胞毒性T细胞和调节性T细胞。

75.一种降低受试者中肿瘤负荷的方法，其包括对受试者施用有效量的免疫应答细胞，从而诱导受试者中的肿瘤细胞死亡，所述免疫应答细胞具有抗原识别受体并表达外源性CD40L，所述抗原识别受体与第一抗原结合，其中该结合激活所述免疫应答细胞。

76.一种延长具有瘤形成的受试者的存活的方法，所述方法包括对受试者施用有效量的免疫应答细胞，从而延长受试者的存活，所述免疫应答细胞具有抗原识别受体并表达外源性CD40L，所述抗原识别受体与第一抗原结合，其中该结合激活所述免疫应答细胞。

77.一种治疗或预防受试者中瘤形成的方法，所述方法包括对受试者施用有效量的免疫应答细胞，从而治疗或预防受试者中的瘤形成，所述免疫应答细胞具有抗原识别受体并表达外源性CD40L，所述抗原识别受体与第一抗原结合，其中该结合激活所述免疫应答细胞。

78.一种核酸，其包含编码CAR和编码CD40L的序列，各序列任选地与启动子元件可操作地连接。

79.根据实施方式78所述的核酸，其包含在载体中。

80.根据实施方式79所述的核酸，其中，所述载体是病毒。

81.一种试剂盒，其用于治疗瘤形成、病原体感染、自身免疫性疾病或同种异体移植，其包含编码对要治疗的瘤形成、病原体、自身免疫性疾病或移植的抗原进行识别的CAR的核酸、以及编码与具有免疫抑制活性或免疫刺激活性的多肽结合的可溶性单链可变片段(scFv) 的核酸。

82.一种用于治疗癌症的试剂盒，所述试剂盒包含编码识别癌抗原的CAR的核酸、以及编码与具有免疫抑制活性或免疫刺激活性的多肽结合的可溶性单链可变片段(scFv)的核酸。

83.一种用于治疗癌症或病原体介导的病症的试剂盒，所述试剂盒包含编码识别癌或病原体的抗原的CAR的核酸、以及编码与具有免疫抑制活性或免疫刺激活性的多肽结合的可溶性单链可变片段(scFv) 的核酸。

84.一种用于治疗癌症或病原体介导的病症的试剂盒，所述试剂盒包含编码识别癌或病原体的抗原的CAR的核酸、以及编码CD40L的核酸。

附图说明

以下通过示例说明方式给出但无意于将本发明限于所述的具体实施方式的详细说明可以结合附图进行理解。

图1示出修饰成表达单独的嵌合抗原受体(CAR)或者还表达可分泌scFv(例如，αPD-1、αPD-Ll、αCTLA-4或αCD47)的T细胞。修饰成表达单独的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞在不友好的肿瘤微环境内经受到抑制。无意拘泥于特定理论，对这些细胞进行进一步修饰以表达可分泌的scFv来阻断免疫抑制信号转导，由于其调节肿瘤微环境并耐受抑制因子的能力而具有提高的抗肿瘤功能。

图2A和2B示出可分泌的抗-CD 47scFv构建体的结构。图2A示出设计成包含κ前导序列以使得输出该蛋白的可分泌抗-CD47 scFv的结构。可变重链(V_H)和轻链(V_L)与丝氨酸甘氨酸连接头(G₄S) 连接，并包含myc-标签以使得可以对scFv进行检测。图2B示出将可分泌scFv使用所示的P2A元件与1928z CAR构建体连接。

图3示出与κ前导序列可操作地连接的B6H12.2 scFv序列[SEQ ID NO:18]。将B6H12.2杂交瘤的可变重链(V_H)和可变轻链(V_L)序列经PCR扩增成具有κ前导序列、c-myc标签，并以丝氨酸甘氨酸连接头连接。示出核酸序列和氨基酸翻译。

图4示出与CDS前导序列可操作地连接的B6H12.2 scFv序列[SEQ ID NO:19]。将B6H12.2杂交瘤的可变重链(V_H)和可变轻链(V_L)序列经PCR扩增成具有CDS前导序列、c-myc探针，并以丝氨酸甘氨酸连接头连接。示出核酸序列和氨基酸翻译。

图5示出1928z-2A-B6H12.2(κ前导)构建体的核酸序列[SEQ ID NO:20]。将B6H12.2 scFv序列克隆到SFG表达载体中，以与靶向CD19 的1928z CAR一起表达。使用P2A元件连接两个元件，如图所示。

图6示出4H1128z-2A-B6Hl2.2(κ前导)构建体的核酸序列[SEQ ID NO:21]。将B6H12.2 scFv序列克隆到SFG表达载体中，以与靶向 MUC-CD的4H1128z嵌合抗原受体(CAR)一起表达。使用P2A元件连接两个元件，如图所示。

图7A和7B示出1928-2A-B6H12.2 293Glv9包装细胞的产生。使用1928z-2A-B6H12.2或1928z载体产生病毒包装细胞。图7A示出两种克隆即克隆5和6的选择，基于1928z CAR的表达，与对照1928z 293Glv9细胞相当。CAR表达通过流式细胞术和12dll抗体染色来确定。图7B示出一个实验，其中将来自1928z或1928z-2A-B6H12.2包装细胞的上清液与CD47⁺肿瘤细胞Nalm-6和Raji孵育，并将肿瘤细胞洗涤，并用CD47抗体染色。与用1928z上清液孵育(黑线)相比较，在 1928z-2A-B6H12.2上清液中孵育的肿瘤细胞具有降低的抗-CD47结合 (蓝线)。使用来自B6H12.2杂交瘤细胞的上清液作为对照(红线)。

图8A和8B示出1928z-2A-B6H12.2人外周血T细胞的产生。将人外周血T细胞用来自1928z或1928z-2A-B6H12.2包装细胞的上清液进行转导。图8A示出通过流式细胞术使用12d11抗体的CAR表达分析，以及用荧光标记的抗-c-myc标签抗体染色的结合的抗-CD47scFv 的分析。图8B示出抗-CD47 scFv阻断CD47的能力，其通过将T细胞用抗-CD47抗体染色而确定。与1928z T细胞(红线)相比较， 1928z-2A-B6H12.2 T细胞具有降低的抗-CD47结合(蓝线)。使用在 B6H12.2杂交瘤上清液中孵育的1928z T细胞作为对照(黑线)。

图9A-9C示出1928z-2A人外周血T细胞。进行流式细胞术，对 1928z和1928z-2A-B6H12.2 T细胞的表型进行表征。图9A示出1928z 和1928z-2A T细胞具有相当的CD4:CD8 T细胞比、以及相当的激活标记物CD69和CD25的表达。与1928z-2A-B6H12.2 T细胞相比较，1928z T细胞具有增加的CD62L表达。图9B示出1928z和1928z-2A-B6H12.2 T细胞分泌细胞因子的能力，其通过在与3T3(CD19⁺/B7.1⁺)aAPC细胞以及高尔基体转运抑制剂Golgi plug和Golgi Stop孵育后通过流式细胞术测定。在用3T3(CD19⁺/B7.1⁺)细胞刺激之后，1928z和1928z-2A-B6H12.2 T细胞产生水平相当的IL-2和IFNg。图9C示出，1928z和1928z-2A-B6H12.2 T细胞具有相当的细胞溶解能力，如通过使用Raji肿瘤细胞的标准⁵¹铬释放检验而测定的。

图10A和10B示出1928z-2A-B6H12.2 T细胞的抗肿瘤效力。 1928z-2A-B6H12.2 T细胞的体内抗肿瘤效力用临床前SCID-Beige小鼠模型考察。将小鼠用1×l0⁶ Nalm-6-萤火虫荧光素酶⁺肿瘤细胞进行静脉内接种，随后用5.7×l0⁶ CAR⁺1928z、1928z-2A-B6H12.2或对照的卵巢癌靶向的4H1128z-2A-B6H12.2 T细胞进行处理，也是静脉内接种。图 10A示出，与未经治疗的、用1928z或4H1128z-2A-B6H12.2处理的小鼠相比较，用1928z-2A-B6H12.2 T细胞处理的小鼠存活提高。图10B 示出，与未经治疗的、用1928z或4H1128z-2A-B6H12.2 T细胞处理的小鼠相比较，用1928z-2A-B6H12.2 T细胞处理的小鼠肿瘤负荷降低，使用生物发光成像来监测肿瘤进展。

图11示出与κ前导序列可操作地连接的5C4 scFv序列[SEQ ID NO:22]。5C4抗体克隆的可变重链(V_H)和可变轻链(V_L)序列设计有κ前导序列、c-myc标记，并用丝氨酸甘氨酸连接头连接。示出核酸序列和氨基酸翻译。

图12示出1928z-2A-5C4(κ前导)构建体的核酸序列[SEQ ID NO:23]。将5C4 scFv序列克隆到SFG表达载体中，以与靶向CD19的 1928z CAR一起表达。使用P2A元件来连接两个元件，如图所示。

图13示出4H1128z-2A-5C4(κ前导)构建体的核酸序列[SEQ ID NO:24]。将5C4scFv克隆到SFG表达载体中，以与靶向MUC-CD的 4H1128z CAR一起表达。使用P2A元件来连接两个元件，如图所示。

图14示出1928z-2A-5C4(κ前导)293Glv9细胞的产生。使用 1928z-2A-5C4产生病毒包装细胞。基于1928z CAR的表达选择两个克隆，即克隆A6和B6，1928z CAR的表达与对照的1928z 293Glv9细胞相当。通过流式细胞术和12d11抗体染色对CAR表达进行测定。

图15示出1928z-2A-5C4(κ前导)人外周血T细胞的产生。将人外周血T细胞用1928z或1928z-2A-5C4包装细胞的上清液转染。使用流式细胞术，使用12d11抗体对CAR表达进行分析，并使用荧光标记的抗-c-myc标签抗体染色对结合的抗-CD47 scFv进行分析。

图16示出3T3(CD19⁺/B7.1⁺)、Raji和Nalm-6细胞上的PD-L1 的表达。使用流式细胞术来测定已转导以表达PD-Ll的3T3 (CD19⁺/B7.1⁺)、Raji和Nalm-6细胞上PD-L1的表达。与对照的未转导细胞相比较，转导的细胞表达相当高水平的PD-L1，将划圈的群分选用于实验。

图17示出1928z和1928z-2A-5C4 T细胞扩增。将1928z和 1928z-2A-5C4 T细胞与3T3(CD19⁺/B7.1⁺)或3T3 (CD19⁺/B7.1⁺/PD-L1⁺)一起孵育，用台盼蓝监测T细胞扩增，并通过流式细胞术测定CAR表达。扩增和CAR表达与在3T3(CD19⁺/B7.1⁺) 细胞上扩增细胞的扩增和CAR表达相关。

图18示出与小鼠κ前导序列可操作地连接的J43 scFv序列[SEQ ID NO:25]。J43抗体克隆的可变重链(V_H)和可变轻链(V_L)序列设计有小鼠κ前导序列、c-myc标签，并用丝氨酸甘氨酸连接头连接。示出序列和氨基酸翻译。

图19示出19m28mziRESJ43(小鼠κ前导)构建体的核酸序列[SEQ ID NO:26]。将J43scFv克隆到SFG表达载体中，以与靶向CD19的 19m28mz CAR一起表达。使用内部核糖体进入位点(IRES)元件连接两个元件，如图所示。

图20示出4H11m28mziRESJ43(小鼠κ前导)构建体的核酸序列 [SEQ ID NO:27]。将J43 scFv克隆到SFG表达载体中，以与靶向 MUC-CD的4H11m28mz CAR一起表达。使用内部核糖体进入位点 (IRES)元件连接两个元件，如图所示。

图21示出将CART细胞基因修饰成表达scFv分子(“装甲 (armored)CAR T细胞”)以克服“不友好”肿瘤微环境的策略。CAR⁺ T细胞可以修饰成分泌具有免疫调节功能的拮抗性scFv。当激活针对同源抗原的CAR时(1)，装甲CAR修饰的T细胞可以诱导成分泌对融合CAR修饰的T细胞和内源性抗肿瘤T细胞上的抑制性PD-1T细胞受体拮抗的scFv，以提高抗肿瘤效应物功能(2)；诱导成分泌对融合CAR修饰的T细胞和内源性抗肿瘤T细胞上的抑制性CTLA-4T细胞受体拮抗的scFv，以提高抗肿瘤效应物功能(3)；或者诱导成分泌对肿瘤细胞上表达的CD47受体拮抗的scFv，以逆转肿瘤细胞为逃避宿主天然抗肿瘤应答识别的伪装，导致宿主巨噬细胞对肿瘤的识别和根除。

图22A-22D示出CD40L由人T-细胞的组成性表达。(A)编码人 CD40L的逆转录病毒构建体载体的示意图；LTR，长末端重复序列； SD、SA，剪接供体和受体；Ψ，包装元件。(B)逆转录病毒基因转移之后的CD4+和CD8+CD40L-修饰的T细胞的流式细胞术；x轴，APC- 结合的抗-人CD40L(CD154)。(C)与空白对照(mock)转导的T-细胞相比较，CD40L修饰的T细胞的增殖提高。(D)与空白对照转导的 T-细胞相比较，CD40L修饰的T细胞的可溶性CD40L(sCD40L)、IFN-γ 和GM-CSF的分泌提高。所有结果是至少三组独立实验的代表(*表示统计学显著)。

图23A和23B示出CD40+肿瘤细胞对CD40L修饰的T细胞的放大的免疫原性。(A)流式细胞术显示，与和来自同一供体的空白对照转导的T细胞(灰线)的培养相比较，在与CD40L-修饰的T-细胞(实线)共培养之后，DOHH2肿瘤细胞系上共刺激分子(CD80和CD86)、粘附分子(CD54、CD58和CD70)HLA分子(I类HLA和HLA-DR) 以及Fas-死亡受体(CD95)的上调。(B)在与CD40L-修饰的T细胞共培养之后，CD40-肿瘤(所示的NALM6)没有表现出表型变化。所有结果是至少三组独立实验的代表。

图24A和24B示出，CLL细胞对自体CD40L-修饰的T细胞的放大的免疫原性。(A)在用含有CD40L的逆转录病毒载体进行逆转录病毒基因转移之后，得自患者的CD40L修饰的T细胞的流式细胞术；x 轴，APC-结合的抗-人CD40L(CD154)。(B)流式细胞术显示，与和来自同一供体的空白对照转导的T细胞共培养(灰线)相比较，在与自体CD40L-修饰的T-细胞(实线)共培养之后，CLL细胞上共刺激分子(CD80和CD86)、粘附分子(CD54、CD58和CD70)HLA分子(I 类HLA和HLA-DR)以及Fas-死亡受体(CD95)的上调。所有结果是至少三组独立实验的代表。

图25A和25B示出CD40L-修饰的T细胞的IL-12分泌以及单核细胞来源的树突状细胞(moDC)的成熟。(A)来自三个不同供体的moDC 和CD40L修饰的T细胞之间的共培养(24小时)的培养基的细胞因子分析，表现出升高的IL-12p70分泌。(B)moDC的流式细胞术显示出在与CD40L修饰的T细胞共培养之后的成熟。所有结果是至少三组独立实验的代表。

图26A-C示出，人T细胞用CAR/CD40L载体有效转导表现出增强的细胞毒性。(A)含有1928z-IRES-CD40L和Pz1-IRES-CD40L基因的逆转录病毒的示意图；LTR，长末端重复序列：SD、SA，剪接供体和受体；Ψ，包装元件；CD8表示CD8前导序列；scFv，单链可变片段；VH和VL，可变重链和轻链；TM，跨膜结构域。(B)用于体内实验的人T-细胞的FACS分析，其转导成表达19-28z/CD40L载体(刺激前)，随后在AAPC(表达CD19和CD80的NIH 3T3成纤维细胞；所示的1928/CD40L T-细胞)上共培养之后CAR/CD40L的表达增强。 x轴，PE-结合的1928zCAR-特异性抗体(19e3)；y轴，APC-结合的抗-人CD40L(CD154)。(C)如标准51Cr释放检验所测定的，与19-28z T-细胞相比较，19-28z/40L T-细胞溶解DOHH2肿瘤细胞的能力显著增强。所有结果是至少三组实验的代表(*表示统计学显著)。

图27示出1928z/CD40L T-细胞输注之后的肿瘤根除和长期存活。在CAR-修饰的T-细胞的单次i.v.给药前2天通过静脉内(i.v.)注射接种DOHH2肿瘤细胞的SCID-Beige小鼠的存活曲线。与对照T细胞的组(1928z组n＝8；Pz1和Pz1/40L组n＝5)相比较，用1928z/CD40L T-细胞处理的小鼠(n＝10)表现出提高的长期存活。所有结果是至少两组实验的代表(*表示统计学显著)。

图28示出，CD40+肿瘤细胞对sCD40L的放大的免疫原性。(A) 流式细胞术显示，与sCD40L水平没有升高的培养基(空白对照转导的T-细胞培养基)(灰线)相比较，在与含有升高水平的sCD40L的处理培养基(CD40L-修饰的T-细胞培养基)(实线)共培养之后，DOHH2肿瘤细胞系上共刺激分子(CD80)、粘附分子(CD54、CD58和CD70) HLA分子(I类HLA和HLA-DR)以及Fas-死亡受体的上调。

图29示出，1928z/CD40L T细胞表现出增加的细胞毒性。如通过标准51Cr释放检验所测定的，与19-28z T-细胞相比较，19-28z/40L T- 细胞溶解Raji肿瘤细胞的能力显著增加。

具体实施方式

大体上讲，本发明提供至少表达抗原识别受体(例如TCR或CAR) 与(i)与免疫抑制抗原(例如αPD-1、αPD-L1、αCTLA-4或αCD47) 结合的scFv；(ii)与免疫刺激抗原(例如αCD28、αOX-40、αCD40 或α4-1BB)结合的scFv或(iii)CD40L的组合的细胞，包括基因修饰的免疫应答细胞(例如，T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T 淋巴细胞(CTL))，以及使用这些细胞治疗瘤形成和其他病理的方法，其中需要增加抗原特异性免疫应答。本发明至少部分地基于以下发现：与免疫抑制抗原(例如本文所示的CD47和PD-L1)结合的scFv可用于激活并刺激免疫应答细胞。具体地，本发明的scFv减少或防止激活的免疫应答细胞在肿瘤微环境中的免疫应答抑制。恶性肿瘤细胞已经发展出一些列保护其自身不受免疫识别和消除的机制。当前的方法提供在肿瘤微环境内的免疫原性以用于肿瘤根除，并且相对传统的过继性T细胞疗法表现出重大的突破。

肿瘤微环境

肿瘤具有对宿主免疫应答不友好的微环境，涉及一系列恶性肿瘤细胞保护其自身不受免疫识别和消灭的机制。这种“不友好的肿瘤微环境”包括许多种免疫抑制因子，包括浸润性调节CD4⁺T细胞(Treg)、骨髓来源的抑制性细胞(MDSC)、肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)，免疫抑制细胞因子(包括IL-10和TGF-β)，以及靶向激活T细胞所表达的免疫抑制受体的配体(CTLA-4和PD-1)的表达。这些免疫抑制机制在保持耐受性以及抑制不适当的免疫应答方面发挥作用，但是，在肿瘤微环境内，这些机制防止有效的抗肿瘤免疫应答。在遇到靶向的肿瘤细胞时，这些免疫抑制因子统统可以诱导过继性转移的CAR修饰 T细胞的显著的无变应性(anergy)或细胞凋亡。

细胞毒性T-淋巴细胞抗原4(CTLA-4)

CTLA-4是由活化的T细胞表达的抑制性受体，其在被其对应的配体(分别为CD80和CD86：B7-1和B7-2)接合时，介导激活T细胞的抑制或无变应性。在临床前和临床研究中，通过全身性抗体输注进行的CTLA-4阻断，尽管提高内源性抗肿瘤应答，但在临床环境中，具有显著的未预见到的毒性。无疑拘泥于特定理论，通过靶向肿瘤的 CAR修饰T细胞经递送拮抗性scFv进行的靶向CTLA-4阻断，使毒性得以降低，而且提供保护不受免疫抑制的肿瘤靶向T细胞的替代“内源性”群(CART细胞群)。可以使用临床前研究(例如，B细胞恶性肿瘤和卵巢癌的人异种移植肿瘤模型和鼠科肿瘤模型)来评测scFv分泌对于CAR修饰的T细胞群以及对于内源性抗肿瘤免疫应答的影响。抗-CTLA-4scFv可以产生自分泌小鼠抗-小鼠CTLA-4单克隆抗体的 9D9杂交瘤，或者分泌仓鼠抗-小鼠CTLA-4单克隆抗体的9Hl0杂交瘤。

程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)

PD-1在与其对应的配体PD-L1和PD-L2(在内源性巨噬细胞和树突状细胞上表达)接合时是激活T细胞的负免疫调节剂。PD-L1的上调是肿瘤细胞可以逃避宿主免疫系统的一种机制。再次，在临床前和最近公开的临床试验中，通过拮抗性抗体进行的PD-1阻断诱导了通过宿主内源性免疫系统介导的抗肿瘤应答。异种移植和同基因鼠科肿瘤模型可以用于表明，由肿瘤靶向的CAR修饰T细胞所分泌的拮抗性抗 -PD-1scFv提高这些分泌scFv的CAR修饰T细胞的抗肿瘤类效能。

CD47

CD47是具有广泛组织分布的膜蛋白，且其一已经在最近的临床前模型中表现出保护许多种肿瘤细胞不受巨噬细胞识别。在这些模型中，输注抗-CD47单克隆抗体引起所建立的肿瘤进展的减缓。换言之，在肿瘤细胞上的CD47阻断使这些肿瘤细胞暴露于宿主巨噬细胞的识别和吞噬。考虑到这一抗体的相当普遍存在的表达，全身性阻断抗体输注可能潜在地引起脱靶毒性。再次，与靶向递送的范例一致，CAR修饰的T细胞分泌直接递送至肿瘤微环境的类似阻断性抗-CD47 scFv，诱导/提高所需的抗肿瘤效果，在该情形中由天然免疫系统而非获得性宿主免疫系统介导。而且，该方法不限于治疗瘤形成，而可修改成大范围的需要增加抗原特异性免疫应答的应用，这样的应用不仅包括治疗瘤形成，而且用于提高针对病原体感染或传染性疾病的免疫应答，以及在自体免疫或同种异体移植的背景中增强调节性T细胞的免疫耐受性。

CD40L

CD40配体(CD40L、CD154)，一种属于肿瘤坏死因子(TNF) 基因超家族的II型跨膜蛋白，具有提高肿瘤特异性T-细胞功能的潜力。最初在激活的CD4+T-细胞上识别，CD40L的表达在许多种免疫、造血、上皮、内皮和平滑肌细胞上是可诱导的。在激活的T细胞中，CD40L 在数分钟内表达，在6小时内达到最高峰，然后在随后的12-24小时中下降。CD40L与其同源受体CD40结合，CD40在许多种免疫和非免疫细胞(包括B细胞、巨噬细胞和树突状细胞(DC))上组成性地表达。明显地，CD40还在若干血液和非血液恶性肿瘤中表达，包括慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、霍奇金氏淋巴瘤、鼻咽癌、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌和宫颈癌，表明CAR/CD40L T-细胞对于许多种恶性肿瘤的潜在应用。参见下文列在实施例6参考文献中的参考文献 8-17。

造血细胞谱系

哺乳动物造血(血)细胞提供范围很宽的生理学活性。造血细胞划分为淋系、髓系和红系。淋系，包括B、T、和自然杀伤(NK)细胞，提供抗体的产生、细胞免疫系统的调节、血液中外来物的检测、对宿主中外来细胞的检测等。如本文所用，术语“T细胞”是指在胸腺中成熟并主要负责细胞介导的免疫力的淋巴细胞。T细胞与获得性免疫系统有关。如本文所用，术语“自然杀伤(NK)细胞”是指作为细胞介导的免疫力的一部分并在天然免疫应答中发挥作用的淋巴细胞。它们不要求在先的活化来发挥其对目标细胞的细胞毒性作用。细胞毒性T 细胞(CTL或杀伤T细胞)是能够诱导感染的体细胞或肿瘤细胞死亡的淋巴细胞的子集。

用于本发明方法的细胞

本发明提供表达对免疫应答细胞进行激活的抗原识别受体(例如， TCR、CAR)和与免疫抑制抗原(例如，αPD-1、αPD-L1、αCTLA-4 或αCD47)结合的scFv的组合的细胞，以及使用这些细胞来治疗要求提高的免疫应答的疾病的方法。在一个方法中，使用肿瘤抗原特异性T 细胞、NK细胞、CTL细胞或其他免疫应答细胞来表达与免疫抑制抗原结合的scFv，以用于治疗或预防瘤形成。例如，表达对CD19进行识别的嵌合抗原受体1928z的T细胞在表达与CD47结合的scFv的T细胞中共表达。将这样的细胞施用给有需求的人类受试者，以用于治疗或预防血癌(例如，白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)。在另一个方法中，病毒抗原特异性T细胞、NK细胞、CTL细胞可以用于治疗病毒性疾病。例如，识别第一CMV抗原的嵌合共刺激抗原受体与结合PD-1的scFv 在细胞毒性T淋巴细胞中共表达，以治疗CMV。

可以将患者自身的T细胞基因修饰成靶向肿瘤，通过导入编码称作嵌合抗原受体(CAR)的人工T细胞受体的基因。第一代CAR通常由融合于可变跨膜结构域、融合于T细胞受体链的胞质信号转导结构域的来源于抗体的抗原识别结构域、单片段长度抗体(scFv)组成。还包含有邻近于C链的一个或两个共刺激受体信号转导结构域(包括 CD28、4-lBB和OX-40)提高CAR信号转导，分别得到第二代和第三代CAR。

肿瘤抗原特异性T淋巴细胞(和NK细胞)

可以用于本发明方法的肿瘤抗原特异性人淋巴细胞的类型包括，但不限于，基因修饰成表达嵌合抗原受体(CAR)的外周供体淋巴细胞(Sadelain,M.等人,2003 Nat RevCancer 3:35-45)、基因修饰成表达全长肿瘤抗原识别T细胞受体复合物(包括α和β杂二聚体)的外周供体淋巴细胞(Morgan,R.A.等人,2006 Science 314:126-129)、来源于肿瘤活组织检查中肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的淋巴细胞培养物(Panelli, M.C.等人,2000 JImmunol 164:495-504；Panelli,M.C.等人,2000 J Immunol 164:4382-4392)、以及采用人工抗原提呈细胞(AAPC)或脉冲树突状细胞的选择性地在体外扩增的抗原特异性外周血白细胞 (Dupont,J.等人,2005 Cancer Res 65:5417-5427；Papanicolaou,G.A.等人,2003Blood 102:2498-2505)。T细胞可以是自体的、同种异体的、或者在体外来源于工程化的祖细胞或干细胞。任何合适的肿瘤抗原(抗原肽)均适合用在本文所述的肿瘤相关的实施方式中。抗原的来源包括，但不限于，癌蛋白。抗原可以表达为肽或完整的蛋白或其部分。完整的蛋白或其部分可以是天然的或诱变的。

合适的抗原包括前列腺特异性膜抗原(PSMA)和前列腺干细胞抗原(PCSA)。

病毒抗原特异性T淋巴细胞(和NK细胞)

合适的用于例如在免疫受损的受试者中治疗病原体感染或其他感染性疾病的抗原包括，但不限于，巨细胞病毒(CMV)中存在的病毒抗原、Epstein Barr病毒(EBV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和流感病毒。

CTL的未纯化来源可以是本领域任何已知的，例如，骨髓、胎儿、新生儿或成人或其他的造血细胞来源，例如，胎肝、外周血或脐带血。可以使用多种技术来分离细胞。例如，最初，阴性选择方法可以除去非CTL。对于阳性选择和阴性选择，mAb对于识别与特定细胞谱系和 /或分化阶段相关的标记物特别有用。

较大比例的终分化细胞可以在最初通过相对较粗的分离而除去。例如，最初可以使用磁珠分离，以除去大量不相关的细胞。优选地，至少约80％、通常约70％的总造血细胞将在细胞分离之前除去。

分离方法包括，但不限于，密度梯度离心；再凝固(resetting)；与改变细胞密度的颗粒结合；用涂有抗体的磁珠进行磁性分离；亲和色谱；与mAb连接或结合使用的细胞毒性剂，包括，但不限于，补体和细胞毒素；和用与固体基质例如板、芯片连接的抗体进行淘选，淘析或任何其他传统技术。

用于分离和分析的技术包括，但不限于，流式细胞术，其可以具有不同程度的改进，例如，多种色彩通道、低角度和钝角光散射检测通道、阻抗通道。

可以通过使用与死亡细胞有关的染料例如碘化丙啶(PI)将细胞针对死亡细胞进行选择。优选地，将细胞收集在包含2％肽牛血清(FCS) 或0.2％牛血清白蛋白(BSA)的介质或者任何其他合适的优选为无菌的等渗介质中。

因此，本发明总体上提供免疫应答细胞，例如，病毒特异性或肿瘤特异性T细胞，其包含与第一抗原结合并激活免疫应答细胞的受体以及与第二抗原结合并刺激免疫应答细胞的受体。

载体

免疫应答细胞(例如，T细胞、CTL细胞、NK细胞)的基因修饰可以通过将基本上均质的细胞组合物用重组DNA构建体转导而实现。优选地，使用逆转录病毒载体(γ-逆转录病毒或慢病毒)将DNA构建体导入到细胞中。例如，可以将编码与抗原(例如，肿瘤抗原或其变体或片段)结合的受体的多核苷酸克隆到逆转录病毒载体中，且表达可以由其内源性启动子、由逆转录病毒长末端重复序列或者由对所关注的目标细胞类型特异的启动子驱动。也可以使用非病毒载体。

对于对细胞进行最初基因修饰以提供肿瘤或病毒抗原特异性细胞，通常使用逆转录病毒载体进行转导，但可以使用任何其他合适的病毒载体或非病毒递送系统。对于细胞的后续基因修饰以提供包含抗原提呈复合物(包含至少两种共刺激配体)的细胞，逆转录病毒基因转移(转导)同样证实是有效的。逆转录病毒载体和适当的包装系的组合也是合适的，其中衣壳蛋白作用于感染人细胞。许多种产生双嗜性病毒的细胞系是已知的，包括，但不限于PA12(Miller等人,(1985) Mol.Cell.Biol.5:431-437)；PA317(Miller等人,(1986)Mol.Cell.Biol. 6:2895-2902)；和CRIP(Danos等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:6460-6464)。非双嗜性颗粒也适用，例如，用VSVG、RD114或GALV 外壳假型化的的颗粒和任何其他本领域已知的。

可能的转导方法还包括细胞与生产细胞的直接共培养，例如，通过Bregni等人,(1992)Blood 80:1418-1422的方法，或者在存在或不存在适当生长因子和聚阳离子的情况下与单独的病毒上清液或浓缩载体储液一起培养，例如，通过Xu等人,(1994)Exp.Hemat.22:223-230；和Hughes等人,(1992)J.Clin.Invest.89:1817的方法。

可以使用其他的转导病毒载体在免疫应答细胞中表达本发明的共刺激配体。优选地，所选的载体表现出高效的感染和稳定的整合和表达(参见，例如Cayouette等人,Human Gene Therapy 8:423-430,1997； Kido等人,Current Eye Research 15:833-844,1996；Bloomer等人,Journal of Virology 71:6641-6649,1997；Naldini等人,Science272:263-267, 1996；和Miyoshi等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:10319,1997)。其他可以使用的病毒载体包括，例如，腺病毒、慢病毒、和腺伴随病毒载体、牛痘病毒、牛乳头状瘤病毒或疱疹病毒，例如Epstein-Barr病毒(另外参见，例如，the vectors of Miller,Human Gene Therapy 15-14, 1990；Friedman,Science 244:1275-1281,1989；Eglitis等人, BioTechniques 6:608-614,1988；Tolstoshev等人,Current Opinion inBiotechnology 1:55-61,1990；Sharp,The Lancet 337:1277-1278,1991； Cornetta等人,Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311-322, 1987；Anderson,Science226:401-409,1984；Moen,Blood Cells 17:407-416,1991；Miller等人,Biotechnology 7:980-990,1989；LeGal La Salle等人,Science 259:988-990,1993；和Johnson,Chest 107:77S-83S, 1995)。逆转录病毒是特别良好开发的，且已经用于临床环境中 (Rosenberg等人,N.Engl.J.Med 323:370,1990；Anderson等人,美国专利5,399,346)。

也可以将非病毒方法用于细胞中蛋白的表达。例如，核酸分子可以通过在脂质体转染的存在下施用核酸(Feigner等人,Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.84:7413,1987；Ono等人,Neuroscience Letters 17:259,1990； Brigham等人,Am.J.Med.Sci.298:278,1989；Staubinger等人,Methods in Enzymology 101:512,1983)，通过缺乏唾液酸基血清粘蛋白-多赖氨酸结合(Wu等人,Journal of Biological Chemistry 263:14621,1988；Wu 等人,Journal of Biological Chemistry 264:16985,1989)，或者在手术条件下通过微注射(Wolff等人,Science 247:1465,1990)，从而引入到细胞中。其他用于基因转移的非病毒方式包括在体外使用磷酸钙、DEAE 右旋糖苷、电穿孔和原生质体融合进行转染。脂质体对于将DNA递送至细胞中也是潜在有益的。正常基因移植到受试者的受感染组织中也可以通过将正常核酸在体转移到可培养细胞型中(例如，自体或异种原代细胞或其后代)，之后将细胞(或其后代)注射到靶标组织中或全身性注射而完成。重组受体也可以使用转座酶或定向核酸酶(例如锌指核酸酶、大范围核酸酶或TALE核酸酶)得到或获得。暂时的表达可以通过RNA电穿孔获得。

用在多核苷酸疗法中的cDNA表达可以由任何合适的启动子(例如，人巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)或金属硫蛋白启动子)指导，并通过任何合适的哺乳动物调控元件或内含子(例如，延伸因子1α增强子/启动子/内含子结构)调节。例如，如果需要的话，已知偏好地指导基因在特定细胞类型中表达的增强子可以用于指导核酸的表达。所使用的增强子可以包括，但不限于，特征为组织-或细胞特异性增强子的那些。或者，如果将基因组克隆用作治疗构件时，调控可以通过同源调控序列或如果需要的话通过得自异源的调控序列 (包括上述任意的启动子或调控元件)而介导。

所得的细胞可以在与用于未修饰细胞相似的条件下生长，由此修饰的细胞可以扩增并用于多种目的。

多肽和类似物

本发明还包括以在免疫应答细胞中表达时提高其抗肿瘤活性的方式进行修饰的CD19、αCD19、CD28、CD3ζ、4H1128z、B6H12.2 scFv、 5C4 scFv和J43 scFv多肽或其片段(例如，人化单克隆抗体)。本发明提供通过在序列中产生变化来优化氨基酸序列或核酸序列的方法。这些变化可以包括某些突变、缺失、插入或翻译后修饰。本发明还包括任何本发明的天然多肽的类似物。类似物与本发明天然多肽的差别可以在于氨基酸序列差别、翻译后修饰或者以上二者。本发明的类似物将通常表现出与本发明的天然氨基酸序列的全部或部分的至少85％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。序列比较的长度为至少5、10、15或20个氨基酸残基，优选至少25、50或75个氨基酸残基，且更优选多于100个氨基酸残基。再次，在确定同一性程度的示例性方法中，可以使用BLAST程序，概率评分为表示序列密切相关的e^-3与e^-100之间。修饰包括多肽的体内或体外化学衍生化，例如，乙酰化、羧基化、磷酸化或糖基化；这些修饰可以在多肽合成或处理过程中或者在用分离的修饰酶处理之后发生。类似物与本发明天然多肽的差异也可以在于一级序列的变化。这些包括天然的或诱导的(例如，得自通过辐射或暴露于乙烷硫酸二甲酯(ethanemethylsulfate)的随机诱变，或者通过记载于Sambrook,Fritsch andManiatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2d ed.),CSH Press,1989；或Ausubel等人(同上)的定点诱变)基因变体。另外包括环化的肽、分子和类似物，其含有除L-氨基酸以外的残基，例如， D-氨基酸或非天然存在或合成的氨基酸，例如，β或γ氨基酸。

除全长多肽外，本发明还提供本发明任一多肽或肽结构域的片段。如本文所用，术语“片段”是指至少5、10、13或15个氨基酸。在其他实施方式中，片段为至少20个连续氨基酸、至少30个连续氨基酸或者至少50个连续氨基酸，并且在其他实施方式中为至少60-80、100、 200、300或更多个连续氨基酸。本发明的片段可以通过本领域技术人员已知的方法产生，或者可以来自常规的氨基酸处理(例如，从新生多肽中移除生物活性不需要的氨基酸，或者通过另外可选的mRNA剪接或另外可选的蛋白加工事件来移除氨基酸)。

非蛋白类似物具有设计成模拟本发明蛋白的功能活性的化学结构。将这样的类似物根据本发明的方法进行给药。这样的类似物可以超过原始多肽的生理活性。类似物设计的方法是本领域公知的，且可以根据这些方法通过对化学结构进行修饰来进行类似物的合成，使得产生的类似物在免疫应答细胞中表达时增加原始多肽的抗肿瘤活性。这些化学修饰包括，但不限于，置换另外可选的R基团，以及改变参照多肽的特定碳原子处的饱和度。优选地，蛋白类似物相对耐受体内降解，引起在给药时更加长久的治疗效果。用于测量功能活性的检验包括，但不限于，在以下实施例中所述的那些。

共刺激配体

与至少一种共刺激配体的相互作用提供对于免疫细胞(例如T细胞)的完全激活来说非常重要的非抗原特异性信号。共刺激配体包括，但不限于，肿瘤坏死因子(TNF)配体、细胞因子(例如IL-2、IL-12、 IL-15或IL21)和免疫球蛋白(Ig)超家族配体。肿瘤坏死因子(TNF) 是参与全身炎症并刺激急性期反应的细胞因子。其主要作用在于对免疫细胞进行调节。肿瘤坏死因子(TNF)配体共享多种共同特征。大多数配体合成为含有短胞质链段和相对较长的胞外区域的II型跨膜蛋白(胞外C-端)。TNF配体包括，但不限于，神经生长因子(NGF)、 CD40L(CD40L)/CD154、CD137L/4-1BBL、肿瘤坏死因子α(TNFα)、 CD134L/OX40L/CD252、CD27L/CD70、Fas配体(FasL)、CD30L/CD153、肿瘤坏死因子β(TNFβ)/淋巴毒素-α(LTα)、淋巴毒素-β(LTβ)、CD257/B 细胞激活因子(BAFF)/Blys/THANK/Tall-1、糖皮质激素诱导的TNF 受体配体(GITRL)和TNF-相关的细胞凋亡诱导配体(TRAIL)、LIGHT (TNFSF14)。免疫球蛋白(Ig)超家族是一大类参与细胞识别、结合或粘附过程的细胞表面可溶性蛋白。这些蛋白与免疫球蛋白共享结构特征，即它们具有免疫球蛋白结构域(折叠)。免疫球蛋白超家族配体包括，但不限于，CD80和CD86，CD28的两种配体。

给药

可以将包含本发明的基因修饰的免疫应答细胞(例如，T细胞、NK细胞、CTL细胞或其祖细胞)的组合物全身性地或直接地提供给受试者，用以治疗瘤形成、病原体感染或感染性疾病。在一个实施方式中，将本发明的细胞直接注射到所关注的器官中(例如，受瘤形成影响的器官)。另外可选地，将包含基因修饰的免疫应答细胞的组合物直接提供给所关注的器官，例如，通过施用到循环系统(例如，肿瘤血管)中。可以在施用细胞之前、过程中或之后提供扩增剂和分化剂，以增加T细胞、NK细胞或CTL细胞的体外或体内产生。

可以将修饰的细胞在任何生理学可接受的载体中给药，通常是血管内给药，尽管它们也可以引入到骨或其他细胞可以找到再生和分化的合适位点的方便位点中(例如，胸腺)。通常，将会施用至少l×l0⁵细胞，最终达到l×l0¹⁰或更多。本发明的基因修饰的免疫应答细胞可以包括纯化的细胞群。本领域技术人员可以容易地使用各种公知方法例如荧光激活细胞分选(FACS)来确定群中基因修饰的免疫应答细胞的百分比。包含基因修饰的免疫应答细胞的群中的优选纯度范围为约 50％至约55％、约55％至约60％、以及约65％至约70％。更优选地，纯度为约70％至约75％、约75％至约80％、约80％至约85％；更优选地，纯度为约85％至约90％、约90％至约95％、以及约95％至约100％。剂量可以由本领域技术人员容易地调节(例如，纯度降低会要求剂量增加)。细胞可以通过注射、导管等引入。如果需要的话，还可以包括因子，包括，但不限于，白介素，例如IL-2、IL-3、IL-6、IL-11、IL7、IL12、ILlS、IL21以及其他白介素，菌落刺激因子例如G-、M-和 GM-CSF，干扰素例如γ-干扰素和红细胞生成素。

本发明的组合物包括药物组合物，其包含基因修饰的免疫应答细胞或其祖细胞以及药学可接受的载体。给药可以是自体的或异种的。例如，免疫应答细胞或祖细胞可以得自一个受试者，并施用给同一受试者或者不同的相容的受试者。本发明的源自外周血的免疫应答细胞或其子代(例如，体内、在体或体外获得的)可以经由局部注射给药，包括导管给药、全身性注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外给药而施用。当施用本发明的治疗组合物(例如，含有基因修饰的免疫应答细胞的药物组合物)时，通常将其配制成可注射形式(溶液、混悬液、乳液)的单位剂量。

制剂

本发明的包含基因修饰的免疫应答细胞的组合物可以方便地提供为无菌液体制剂，例如，等渗水溶液、混悬液、乳液、分散液或粘性组合物，其可以缓冲至选定的pH。液体制剂通常比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。此外，液体组合物在一定程度上更加方便给药，特别是通过注射。另一方面，粘性组合物可以在适当的粘度范围内配制，以提供与特定组织的更长的接触期。液体或粘性组合物可以包含载体，其可以是溶剂或含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)及其适当混合物的分散介质。

无菌可注射溶液可以通过以下方法制备：将用于实施本发明的基因修饰的免疫应答细胞与不同量的其他成份(如果需要的话)引入到所需量的适当溶剂中。这些组合物可以与合适的载体、稀释剂或赋形剂混合，例如，无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等。组合物还可以冻干。取决于给药途径和所需的制备，组合物可以含有辅助性物质，例如，润湿剂、分散剂或乳化剂(例如甲基纤维素)、pH缓冲剂、凝胶化或增粘添加剂、防腐剂、风味剂、着色剂等。可以参考标准教科书，例如“REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCE”,17thedition,1985(通过引用的方式并入本文)，以制备合适的制剂而无需过度的实验。

可以加入各种提高组合物稳定性和无菌性的添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。微生物作用的防止可以通过多种抗菌剂和抗真菌剂来确保，例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。通过使用延迟吸收的作用剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以产生可注射药物形式的延长吸收。但是，根据本发明，使用的任何载体、稀释剂或添加剂均必须与基因修饰的免疫应答细胞或其祖细胞相容。

组合物可以是等渗的，即，它们具有的渗透压可以与血液和泪液相同。本发明的组合物所需的等渗性可以使用氯化钠或其他药学可接受的作用剂例如右旋糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇或其他无机或有机溶质来实现。氯化钠对于含有钠离子的缓冲剂来说是特别优选的。

如果需要，组合物的粘度可以使用药学可接受的增稠剂而保持在选定的水平。优选甲基纤维素，因为它易于获得，经济，并且易于处理。其他合适的增稠剂包括，例如，黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆等。优选的增稠剂浓度将取决于所选的作用剂。要点在于使用将会实现所选粘度的量。显然，合适的载体和其他添加剂的选择将取决于精确的给药路径和特定剂量形式例如液体剂型的性质 (例如，组合物是否配制成溶液、混悬液、凝胶或其他液体形式例如延时释放形式或液体充填形式)。

本领域技术人员将会认识到，组合物的组分应当选择成在化学上呈惰性，且不影响本发明所述的基因修饰的免疫应答细胞的生存力或效力。这对于化学和药物原理熟练的技术人员来说不成问题，或者从当前公开内容及本文引用的文件，很容易通过参考标准教科书或通过简单的实验(不涉及过度实验)来避免问题。

涉及本发明的基因修饰免疫应答细胞的治疗用途的一个考虑是对实现最优效果所需的细胞的定量。要施用的细胞的数量将针对正被治疗的受试者而变化。在一个实施方式中，将10⁴至10¹⁰、10⁵至10⁹或者 10⁶至10⁸本发明的基因修饰的免疫应答细胞施用至人类受试者。更有效的细胞可以进而以更少的数量进行给药。在一些实施方式中，将至少约1×10⁸、2×10⁸、3×10⁸、4×10⁸和5×10⁸本发明的基因修饰免疫应答细胞施用至人类受试者。何为有效剂量的精确确定可以基于对于每个受试者的单独因素，包括特定受试者的体型大小、年龄、性别、体重和状况。由当前的公开内容和本领域知识，本领域技术人员可以很容易地确定剂量。

本领域技术人员可以容易地确定组合物中以及要在本发明方法中给药的细胞和任选的添加剂、媒介物和/或载体的量。通常而言，任何添加剂(除活性细胞和/或作用剂以外)以磷酸盐缓冲盐水中0.001-50％ (重量)溶液的量存在，且活性成分以微克至毫克的量级存在，例如，约0.0001wt％至约5wt％，优选为约0.0001wt％至约1wt％，进而更优选为约0.0001wt％至约0.05wt％，或者约0.001wt％至约20wt％，优选为约0.01wt％至约10wt％，进而更优选为约0.05wt％至约5wt％。当然，对于任何要给予动物或人的组合物，以及对于任何具体的给药方法，因而优选地确定：毒性，例如，通过测定在适当的动物模型例如啮齿动物如小鼠中的致死剂量(LD)和LD50；和组合物的剂量、其中组分的浓度以及施用组合物的时机，其引发适当的反应。由技术人员的知识、当前的公开内容以及本文引用的文件，这些确定不需要过度的实验。而且，依序给药的时间可以不经过度实验而确定。

治疗方法

本文提供治疗受试者中的瘤形成的方法，本文还包含用于治疗受试者例如免疫受损的人类受试者中的病原体感染或其他感染性疾病的方法。上述方法包括以有效实现所需效果的量施用本发明的T细胞、 NK细胞或CTL细胞，所述效果为减轻现有病状或预防复发。为进行治疗，施用量是有效产生所需效果的量。有效量可以在一次或系列给药中提供。有效量可以在大丸剂中或者通过连续输注而提供。

“有效量”(或者“治疗有效的量”)是在治疗时足以实现有益或所需的临床结果的量。有效量可以在一次或多次给药中给予受试者。就治疗而言，有效量是指足以减轻、减缓、稳定、逆转或减缓疾病进展，或者降低疾病的病理后果的量。有效量通常由医师基于个案确定，并在本领域技术人员的技能以内。当确定达到有效量的适当剂量时，通常考虑若干因素。这些因素包括受试者的年龄、性别和体重，要治疗的病状、病状的严重程度以及施用的抗原结合片段的形式和有效浓度。

对于使用抗原特异性T细胞的过继性免疫疗法，通常输注范围在 10⁶-10¹⁰(例如10⁹)的细胞剂量。在将基因修饰的细胞施用到宿主中并进行后续分化时，诱导出特异性地导向特定抗原的T细胞。T细胞的 “诱导”可以包括抗原特异性T细胞的失活，例如通过缺失或无反应性。失活特别可用于在自身免疫性疾病建立或重建耐受性。修饰的细胞可以通过本领域已知的任意方法进行使用，包括，但不限于，静脉内、皮下、结节内、瘤内、鞘内、胸膜内、腹膜内和直接到胸腺。

治疗方法

本发明提供在有需求的受试者中增加免疫应答的方法。在一个实施方式中，本发明提供治疗或预防受试者中瘤形成的方法。本发明提供特别可用于治疗具有不适合常规治疗性干预的血癌(例如，白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)或卵巢癌的受试者的疗法。适用于疗法的人类受试者通常包括可以通过临床标准区分的两个治疗组。具有“重度疾病” 或“高肿瘤负荷”的受试者是荷临床上可测量的肿瘤的受试者。临床上可测量的肿瘤是可以基于肿瘤质量而检测的肿瘤(例如，通过触诊、 CAT扫描、声波图、乳房X-线照片或X-射线；阳性生化或组织病理学标记物本身不足以识别该群体)。将包含在本发明中的药物组合物施用给这些受试者，以引发抗肿瘤应答，目的在于减轻他们的病状。理想地，作为结果发生肿瘤质量的减少，但是任何临床改善均构成益处。临床改善包括风险或进展速度降低或者肿瘤的病理学后果降低。

第二组合适的受试者在本领域中称作“辅助组”。他们是已经具有瘤形成史，但已经对另一治疗模式有反应的个体。在先的疗法可以包括，但不限于，手术切除、放疗和常规化疗。结果，这些个体没有临床上可测量的肿瘤。但是，他们疑似在初始肿瘤位点附近或者通过转移而处于疾病进展的风险中。这一组可以进一步细分成高风险个体和低风险个体。细分基于初始治疗之前或之后观察到的特征而作出。这些特征是临床领域已知的，并且对于每种不同的瘤形成均加以适当定义。高风险亚组典型的特征是肿瘤已经侵入邻近组织的那些，或者表现出牵涉到淋巴结的那些。

另一组具有瘤形成的遗传倾向性，但尚没有明显的瘤形成的临床体征。例如，对乳腺癌相关的基因突变测试呈阳性，但仍处于育龄年纪的女性可能希望在预防性治疗中接受一种或多种本文所述的抗原结合片段，以防止瘤形成的发生，直至适合进行预防性手术。

具有任意以下瘤形成的人类瘤形成受试者是特别适合的受试者：成胶质细胞瘤、黑色素瘤、成神经细胞瘤、腺癌、神经胶质瘤、软组织肉瘤和各种癌(包括前列腺癌和小细胞肺癌)。合适的癌症还包括任何肿瘤学领域已知者，包括但不限于，星形细胞瘤、纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、原始神经外胚瘤(PNET)、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、胰腺导管腺癌、小细胞和大细胞肺腺癌、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、上皮腺癌及其肝转移、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、肝细胞瘤、胆管癌、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、基底细胞癌、汗腺瘤、乳头状癌、皮脂腺癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、Wilms瘤、睾丸瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、多发性骨髓瘤、Waldenstrom 巨球蛋白血症和重链病、乳腺肿瘤例如导管和小叶腺癌、子宫颈鳞状和腺癌、子宫和卵巢上皮性癌、前列腺癌、膀胱的移行性鳞状细胞癌、 B和T细胞淋巴瘤(结节状和弥散性)浆细胞瘤、急性和慢性白血病、恶性黑色素瘤、软组织肉瘤和平滑肌肉瘤。

受试者可以具有进展形式的疾病，在该情形中治疗目的可以包括疾病进展的减轻或逆转，和/或副作用的减轻。受试者可以具有病症史，他们已经对其进行过治疗，在这种情况下，治疗目的将通常包括降低或延迟复发的风险。

因此，本发明提供治疗或预防受试者中瘤形成的方法，该方法包括施用有效量的免疫应答细胞，该免疫应答细胞包含与肿瘤抗原结合并激活免疫应答细胞的受体(例如，TCR、CAR)以及编码与具有免疫抑制活性的抗原(例如，CD47、PD-1、CTLA-4及其配体)结合的单链可变片段(scFv)的载体。在一个实施方式中，瘤形成选自血癌 (例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、脑癌、结肠癌、肠癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、成胶质细胞瘤和喉癌。在另一实施方式中，肿瘤抗原是以下中的一种或多种：碳酸酐酶IX(CAlX)、癌胚抗原(CEA)、CDS、CD7、 CDIO、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、 CD44、CD49f、CD56、CD74、CD133、CD138、巨细胞病毒(CMV) 感染细胞的抗原(例如，细胞表面抗原)、上皮糖蛋白-2(EGP-2)、上皮糖蛋白-40(EGP-40)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、受体酪氨酸- 蛋白激酶erb-B2,3,4、叶酸结合蛋白质(FBP)、胎儿乙酰胆碱受体 (AChR)、叶酸受体-α、神经节苷脂G2(GD2)、神经节苷脂G3(GD3)、人表皮生长因子受体2(HER-2)、人端粒酶逆转录酶(hTERT)、白介素-13受体亚基α-2(IL-13Rα2)、κ-轻链、激酶插入结构域受体(KDR)、路易斯Y(LeY)、L1细胞粘附分子(L1CAM)、黑色素瘤抗原家族A、1(MAGE-A1)、粘液素16(MUC16)、粘液素1(MUC1)、间皮素 (MSLN)、NKG2D配体、癌-睾丸抗原NY-ES0-1、癌胚抗原(h5T4)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)、血管内皮生长因子R2(VEGF-R2)或Wilms 肿瘤蛋白(WT-1)。

作为与肿瘤抗原结合并激活免疫应答细胞的受体(例如，TCR、 CAR)以及编码与具有免疫抑制活性的抗原(例如，CD47、PD-1、 CTLA-4及其配体)结合的单链可变片段(scFv)的载体的表面表达的结果，过继性转移的人T或NK细胞在肿瘤位点处被赋予放大且选择性的细胞溶解活性。而且，继其定位于肿瘤或者病毒感染及其增殖后，表达共刺激配体的T细胞将肿瘤或病毒感染位点变成对于大范围的参与生理性抗肿瘤或抗病毒应答的免疫细胞(肿瘤浸润性淋巴细胞、NK-、 NKT-细胞、树突状细胞和巨噬细胞)来说为高度有利的环境。

在其他实施方式中，本发明提供治疗具有病原体感染(例如，病毒感染、细菌感染、真菌感染、寄生虫感染或原生动物感染)的受试者的方法。本发明尤其可用于提高免疫受损的受试者中的免疫应答。示例性的对使用本发明方法的治疗敏感的病毒感染包括，但不限于，巨细胞病毒(CMV)、Epstein Barr病毒(EBV)、人免疫缺陷病毒(HIV) 和流感病毒感染。

因此，本发明提供治疗或预防受试者中病原体感染的方法，该方法包括施用有效量的本文所述的免疫应答细胞。

试剂盒

本发明提供用于治疗或预防瘤形成、病原体感染、免疫疾病或同种异体移植的试剂盒。在一个实施方式中，试剂盒包含单位剂型的含有有效量的免疫应答细胞的治疗或预防性组合物，上述免疫应答细胞包含激活性抗原受体和与具有免疫抑制活性的抗原结合的单链可变片段(scFv)。在特定实施方式中，细胞还包含共刺激配体。在一些实施方式中，试剂盒包含含有治疗或预防性疫苗的无菌容器；这样的容器可以是盒、安瓿、瓶、小瓶、管、袋子、小袋、泡罩或本领域已知的其他合适的容器形式。这些容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或其他适于容纳药物的材料制成。

如果需要，免疫应答细胞与用于将细胞施用至具有瘤形成、病原体感染、免疫疾病或同种异体移植或处于其发展风险中的受试者的说明书。说明书通常会包括有关使用组合物治疗或预防瘤形成、病原体感染、免疫疾病或同种异体移植的信息。在其他实施方式中，说明书包括以下的至少一种：对治疗剂的说明；用于治疗或预防瘤形成、病原体感染、免疫疾病或同种异体移植或其症状的剂量日程和给药；预防措施；警告；适应症；禁忌症；过量使用信息；不良反应；动物药理学；临床研究；和/或参考文献。说明书可以直接印刷在容器上(如果存在)，或者作为涂敷于容器的标签，或者作为在容器中或者与其一起提供的单独的纸张、小册子、卡片或折叠式印刷物。

实施例

除非另外指出，本发明的实施采用常规的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的技术，其均在技术人员知晓的范围以内。这些技术在文献中得以充分解释，例如， “Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,secondedition(Sambrook, 1989)；“Oligonucleotide Synthesis”(Gait,1984)；“Animal CellCulture” (Freshney,1987)；“Methods in Enzymology”“Handbook of ExperimentalImmunology”(Weir,1996)；“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” (Millerand Calos,1987)；“Current Protocols in Molecular Biology” (Ausubel,1987)；“PCR:The Polymerase Chain Reaction”,(Mullis,1994)； “Current Protocols inImmunology”(Coligan,1991)。这些技术适用于本发明的多核苷酸和多肽的制备，如此，可以在本发明的制备和实施中加以考虑。特别可用于具体实施方式的技术将在以下部分中讨论。

给出以下实施例，以对本领域普通技术人员提供如何进行并使用本发明的检验、筛选和治疗方法的充分公开和说明，并无意于对发明人视作其发明的范围进行限定。

实施例1.共表达嵌合抗原受体(CAR)和抗-SCD47scFv的T细胞根除肿瘤

产生特异性结合人CD47的scFv，用该scFv和识别肿瘤抗原 (CD19)的CAR修饰的人外周血T细胞在体外表现出抗肿瘤效力，并在临床前模型中提高抗肿瘤效力。

产生包含1928z-2A-B6H12.2(图1-5)的构建体，通过对CAR和 scFv序列进行测序而证实。此外，产生对照构建体，其具有对卵巢癌抗原MUC-CD特异的CAR，称为4H1128z(图6)。使用κ前导序列产生稳定的生产细胞系以用于构建体，并通过流式细胞术验证(图7A)。含有分泌的抗-CD47 scFv的来自包装细胞系的上清液，能够在基于流式细胞术的检验中阻断CD47抗体与Nalm-6和Raji肿瘤细胞的结合。另外将与来自包装细胞的上清液孵育的肿瘤细胞用抗-c-myc标签抗体进行染色，以说明scFv的结合(图7B)。

使用包装细胞来转导人外周血T细胞，其中转导效率通过CAR表达的流式细胞分析而评测(图8A)。分泌的scFv能够以自分泌的方式发挥作用，其中与1928z T细胞相比较，抗-CD47抗体已经降低了与 1928z-2A-B6H12.2 T细胞的结合。抗-c-myc标签抗体的阳性染色示出结合的scFv(图8B)。转导的T细胞的表型通过流式细胞术考察，并且表明在1928z-2A-B6H12.2与1928z T细胞之间是类似的，CD62L例外，其被发现在1928z-2A-B6H12.2 T细胞上是降低的(图9A)。产生抗-CD 47scFv的T细胞的功能使用多参数流式细胞术和标准51Cr释放检验进行考察。已表明，与1928z T细胞相比较，1928z-2A-B6H12.2 T细胞具有相当的细胞因子产生和细胞毒性功能(图9B和9C)。

1928z-2A-B6H12.2 T细胞在体内应答于肿瘤的能力使用临床前 SCID-Beige小鼠模型进行考察。将SCID-Beige小鼠静脉注射1×l0⁶修饰成表达萤火虫荧光素酶的Nalm-6肿瘤细胞，3天后将小鼠用5.7×10⁶ CAR⁺1928z或1928z-2A-B6Hl2.2或对照4H1128z-2A-B6H12.2 T细胞进行处理，也是静脉内注射。用生物发光成像在临床上对肿瘤进展进行监测。与使用1928z T细胞的处理相比较，对荷肿瘤的小鼠用 1928z-2A-B6H12.2 T细胞处理降低了肿瘤负荷，并提高了荷肿瘤的小鼠的存活(图10A和10B)。

实施例2.共表达嵌合抗原受体(CAR)和抗-人PD-1scFv的T细胞具有增加的增殖并且保持CAR的表达

基于抗-PD-1抗体(克隆5C4)的V_H和V_L链产生抗-人PD-1scFv (美国专利第8,008,449号)。5C4 scFv设计成包含κ前导序列、丝氨酸甘氨酸连接头和c-myc标签(图11)。将该scFv构建体克隆到SFG 逆转录病毒骨架中，以产生1928z-2A-5C4和4H1128z-2A-5C4(图12和13)。为开发与人PD-1结合的高亲和力scFv(例如，用于在 1928z/4H1128z CAR T细胞中表达)，对人抗体噬菌体展示文库进行筛选，确定与人PD-1(以及潜在地与小鼠PD-1)特异性结合的scFvs。

产生稳定的293Glv9包装细胞系，通过流式细胞术评测1928z CAR 和4H1128z CAR的表达(图14)。使用来自包装细胞的上清液来转导人外周血T细胞，通过流式细胞术评测转导效率，以检测CAR的表达 (图15)。

该抗-人PD-1scFv响应于人工抗原提呈细胞(aAPC)而增加T细胞增殖的能力被研究。产生PD-L1阳性肿瘤细胞和3T3 aAPC以用于研究(图16)。在将转导T细胞与表达人CD19、人B7.1和人PD-L1 的3T3 aAPC共培养之后，与1928z T细胞相比较，1928z-2A-C4 T细胞具有增加的增殖，并保持CAR的表达(图17)。可以使用流式细胞术、luminez细胞因子分析研究、⁵¹铬释放检验和SCID-Beige临床前模型来确定共表达1928z CAR和抗-PD1 scFV的表型和抗肿瘤功能，以确定体内的抗肿瘤功能。

实施例3.嵌合抗原受体(CAR)和抗-小鼠PD-1scFv的共表达刺激小鼠T细胞

基于抗-PD-1抗体克隆J43的V_H和V_L产生抗-小鼠PD-1scFv (Honjo等人的美国专利第7,858,746号)。J43 scFv设计成包含小鼠κ 链前导序列、丝氨酸甘氨酸连接头和c-myc标签(图18)。将该scFv 构建体克隆到表达靶向人CD19或人MUC-CD的CAR(其通过小鼠 C28和小鼠CD3ζ进行信号转导)的SFG逆转录病毒骨架中，从而刺激小鼠T细胞。使用这些构建体19m28mz-IRES-J43(图19)和 4H11m28mz-IRES-J43(图20)产生稳定的Phoenix包装细胞系，并对原代鼠科T细胞进行基因修饰，如之前所述(Lee等人,Cancer Res 2011, 71(8):2871)。将小鼠19m28mz和19m28mz-IRES-J43 T细胞与已经修饰成表达人CD19和小鼠PD-L1的EL4胸腺瘤肿瘤细胞一起培养，通过活细胞计数和CFSE标记来监测小鼠T细胞的增殖。

对于表达靶向MUC-CD抗原的4H11m28mz CAR的鼠科T细胞，可以应答于修饰成表达MUC-CD和小鼠PD-L1的IDS肿瘤细胞而进行功能评测(Chekmasova等人,Clin CancerRes,2010,16:3594)。如上所述，将结合鼠科PD-1的人scFv克隆到SFG-19m28mz和4H11m28mz 载体构建体中，并用于修饰鼠科T细胞。用于评测修饰成表达与鼠科 PD-1结合的人scFv的T细胞的体内抗肿瘤效果的同基因模型是可得的：使用ID8-MUC-CD肿瘤细胞的卵巢癌肿瘤模型，其经腹膜内接种到C57BL/6小鼠中；和表达人CD19而非小鼠CD19的转基因小鼠，其接种有修饰成表达人CD19的EL4胸腺瘤肿瘤细胞(Pegram等人, Blood 2012,119(18):4133)。因此，抗肿瘤效果可以在免疫感受态模型中加以评测，使得可以评测抗-PD-1scFv对肿瘤微环境的影响。

实施例4.嵌合抗原受体(CAR)和激动性scFv在免疫细胞中的共表达

在一个实施方式中，本发明提供免疫细胞，其表达抗原结合受体 (例如，CAR或TCR)以及与具有激动性免疫刺激活性的抗原(例如， CD28、OX-40、4-1BB及其配体)结合的单链可变片段(scFv)。为产生靶向共刺激分子4-1BB的激动性scFv，获得3H3杂交瘤细胞系(Shuford等人,J Exp Med 1997,186:47-55；由Mick Croft教授(拉荷亚过敏与免疫研究所)提供)。为产生靶向共刺激分子OX-40的激动性 scFv，获得OX-86杂交瘤细胞系(al-Shamkhani等人,Eur J Immunol1996, 26(8):1695-9；欧洲细胞保藏中心(EuropeanCollection of Cell Cultures) (目录编号96110601))。使用QIAgen RNAeasy试剂盒按照制备商的说明书(QIAgen,CA,USA)从细胞中分离杂交瘤mRNA，然后使用 New EnglandBiolabs Protoscript AMV第一链cDNA合成试剂盒按照制备商的说明书(New EnglandBiolabs,MA,USA)制备cDNA。然后使用以下简并引物对可变重链(VH)和轻链(VL)进行PCR扩增：

Orlandi引物(Orlandi等人,Proc.Natl.Acad.Sci.1989,86:3833-37)

VHFOR：5’-tga gga gac ggt gac cgt ggt ccc ttg gcc cca g-3’[SEQ ID NO:28]

VH1BACK：5'-agg tsm arc tgc ags agt cwg g-3'[SEQ ID NO:29]

VKFOR：5'-gtt aga tct cca gcttgg tcc c-3'[SEQ ID NO:30]

VK1BACK：5'-gac att cag ctg acc cag tct cca-3'[SEQ ID NO:31]

Cooper引物(Wang等人,Blood 2002,99:2459-2467)

Vk 5'-GGCTGCAGSTTCAGTGGCAGTGGRTCWGGRAC-3'[SEQ ID NO:32]，

Ck 5'-CTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAATGGG-3'[SEQ ID NO:33]；

RACE引物(Kettleborough等人,Eur.J Immunol1993,23:206-211)

VKfr1a：Ata tcc atg gca gac gtc cag atg atc cag tct cca[SEQ ID NO:34]

Vkfr1b：ata tcc atg gca gac att gtg ctg act cag tct cc [SEQ ID NO:35]

Vkfr1c：atatcc atg gca gat gtt gtg atg ace caa act cca [SEQ ID NO:36]

Vkfr1d：ata tcc atg gca caa att gtt ctc acc cag tct cc[SEQ ID NO:37]

Vkfr1e：ata tcc atg gca gac att gtg atg aca cag tct cca[SEQ ID NO:38]

Vkfrlf：ata tcc atg gca gat att gtg atg acg cag gct gca[SEQ ID NO:39]

Vkfr1g：ata tcc atg gca gac att gtg atg acc cag tct c[SEQ ID NO:40]

反向κ：gct tca aca gga atg agt gtt aac tcg agg tag[SEQ ID NO:41]

为将VH和VL组装到scFv中，在VH和VL链的PCR过程中加入丝氨酸甘氨酸连接头以及c-myc标签和鼠科Igκ链或CDS前导序列。将产生的多核苷酸克隆到编码1928z嵌合抗原受体(CAR)的现有逆转录病毒表达载体(SFG骨架)中，以产生SFG-1928z-2A-3H3或 1928z-2A-OX86。

如上描述产生稳定的包装细胞系以用于抗-小鼠PD-1J43 scFv，并在类似的过继性T细胞转移的鼠科模型中进行测试。

在本文呈现的结果表明，表达scFv分子的基因修饰的CART细胞(“装甲CART细胞”是免疫应答性的，并且可以克服“不友好的” 肿瘤微环境，因此，在瘤形成的治疗中有效。CAR⁺T细胞被修饰成分泌具有免疫调节功能的拮抗性scFv(图21)。在激活针对同源抗原的CAR时(1)，装甲CAR修饰的T细胞可以诱导成分泌对融合CAR修饰的T细胞和内源性抗肿瘤T细胞上的抑制性PD-1T细胞受体拮抗的 scFv，以提高抗肿瘤效应物功能(2)；诱导成分泌对融合CAR修饰的 T细胞和内源性抗肿瘤T细胞上的抑制性CTLA-4T细胞受体拮抗的scFv，以提高抗肿瘤效应物功能(3)；或者诱导成分泌对肿瘤细胞上表达的CD47受体拮抗的scFv，以逆转肿瘤细胞为逃避宿主天然抗肿瘤应答识别的伪装，导致宿主巨噬细胞对肿瘤的识别和根除。

除非另外指出，在此报道的结果使用以下方法和材料获得。抗-CD47 B6H12.2scFv的产生

B6H12.2杂交瘤细胞系得自美国组织保藏中心(American Tissue CultureCollection，ATCC,VA,USA；目录编号HB-9771)。使用QIAgen RNAeasy试剂盒根据制备商的说明书(QIAgen,CA,USA)从杂交瘤细胞中分离B6H12.2 mRNA，并使用New EnglandBiolabs Protoscript AMV第一链cDNA合成试剂盒根据制备商的说明书(New EnglandBiolabs,MA,USA)制备cDNA。使用设计成并入κ前导序列、丝氨酸甘氨酸连接头和c-myc标签(参考图1)的如下引物对可变重链(VH) 和轻链(VL)进行PCR扩增：

引物1.B6H12.2 VH正向引物[SEQ ID NO:42]：

5'-CCA TGG AGA CAG ACA CAC TCC TGC TAT GGG TAC TGC TGC TCT GGG TTCCAG GTT CCA CTG GTG ACG AGG TGC TGC AGC TGG TGG AGT CCG GGG-3'

引物2.B6H12.2 VH反向引物[SEQ ID NO:43]：

5'-AGA TCC ACC TCC ACC AGA TCC ACC TCC ACC TGA TCC ACC TCC ACC TGAGGA GAC GGT GAC TGA GGT TCC TTG ACC -3'

引物3.B6H12.2 VL正向引物[SEQ ID NO:44]：

5'-GGT GGA GGT GGA TCA GGT GGA GGT GGA TCT GGT GGA GGT GGA TCT GACATT GTG ATG ACT CAG TCT CCA GCC ACC-3'

引物4.B6H12.2 VL反向引物[SEQ ID NO:45]：

5'-CTC GAG TTA CAG ATC CTC TTC TGA GAT GAG TTT TTG TTG TTT GAT TTCCAG CTT GGT GCC TCC ACC GAA CG-3'

除以上设计以外，还使用以下可替代的正向引物产生具有CD8L 序列的scFv，以确定用于从T细胞输出scFv的有效前导序列：

引物5.B6H12.2 VH CD8L正向[SEQ ID NO:46]：

5'-TAT ACC ATG GCC TTA CCA GTG ACC GCC TTG CTC CTG CCG CTG GCC TTGCTG CTC CAC GCC GCC AGG CCG GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCC GGG-3'

根据制备商的说明书(Invitrogen,NY,USA)将VH和VL的PCR 产物克隆到pCR2.1TOPO中。通过MSKCC DNA测序核心设施使用 M13F2和M13R2引物(Invitrogen)进行测序，以确认VH和VL产物的序列。使用VH和VL的PCR产物以及引物1或5和4进行重叠PCR，产生抗-CD47 scFv(参见图1)。

将抗-CD47 scFv构建体克隆到编码1928z嵌合抗原受体(CAR) 的现有逆转录病毒表达载体(SFG骨架)中，以产生 SFG-1928z-2A-B6H12.2。对SFG-1928z-2A-B6H12.2 DNA进行测序，以确定序列。

产生稳定的用于人T细胞的包装细胞系

为产生稳定的包装细胞系，使用Promega磷酸钙转染试剂盒根据制备商的说明书(Promega)将H29细胞用10μg SFG-1928z-2A-B6H12.2 DNA进行瞬时转染。使用来自H29上清液的上清液来转导293Glv9细胞，随后将其亚克隆，产生稳定的包装细胞。基于1928z CAR的表达和293Glv9上清液转导人外周血T细胞的能力(在用12dll抗体染色之后通过流式细胞术测定)，来选择两个亚克隆(克隆5和克隆6)。人外周血T细胞的转导如之前所述进行(Brentjens等人,Clin Cancer Res 2007,13(18Ptl):5426)。

抗-CD47 scFv的产生/功能的评测

由1928z-2A-B6H12.2 293Glv9和转导的人外周血T细胞产生抗 -CD47 scFv通过将CD47⁺肿瘤细胞(Raji和Nalm-6)在这些细胞的上清液中孵育而进行确定。随后将肿瘤细胞洗涤，并用荧光结合的抗 -c-myc标签抗体(Cell Signaling,MA,USA)染色，以检测与肿瘤细胞结合的来自上清液的蛋白。还将肿瘤细胞用荧光结合的抗-CD47(克隆 B6H12.2，eBioscience)染色，以检测B6Hl2 scFv阻断CD47的能力。

体内过继性转移模型

对小鼠静脉内注射l×10⁶修饰成表达萤火虫荧光素酶的Nalm-6(第 0天)。在第3天，将小鼠用也是静脉内接种的5.7×10⁶CAR⁺T细胞进行处理。使用生物发光成像在临床上监测肿瘤进展，如之前所述(Santos 等人,Nature Medicine 2009,15(3):338)。

5C4抗-人PD-1scFv的产生

如上所述获得特异性地结合人PD-1的抗体克隆5C4的序列。将该序列修饰成包含κ前导序列、丝氨酸甘氨酸连接头和c-myc标签，并购自GeneArt(Invitrogen，图9)。如上所述，将该scFv克隆到SFG逆转录病毒骨架中，从而实现稳定包装细胞的产生、人外周血T细胞的转导、以及转导效率的评测。

抗-人PD-1功能的评测

将PD-1的配体，PD-L1，从孵育在200ng/ml重组人干扰素-γ(RnD systems,MN,USA)中的SKOV3(ATCC)肿瘤细胞中经PCR扩增出。用于扩增人PD-L1的引物如下所示：

引物6.人PD-L1正向引物[SEQ ID NO:47]

5'-CACGTGCCATGGATGAGGATAT TTGCTGTCTT TATAT-3'

引物7.人PD-L1反向引物[SEQ ID NO:48]

5'CTCGAGTTACGTCTCCTCCAAATGTGTATCACTTT3'

将人PD-L1序列克隆到SFG逆转录病毒骨架中，并转导到3T3、 Raji和Nalm-6细胞系中，如之前所述(Brentjens等人,Clin Cancer Res 2007,13(18 Pt 1):5426)。将细胞用抗-PD-L1抗体(克隆MIH1，BD Pharmingen,CA,USA)染色，并进行FACS分选，以确保总细胞群表达PD-L1(图14)。

将人1928z-2A-5C4和1928z T细胞与3T3(CD19/B7.1/PD-L1) aAPC一起培养，使用台盼蓝排除法进行活细胞计数，并进行流式细胞术以确定CAR的表达。这与T细胞在和3T3(CD19/B7.1)aAPC一起培养时的扩增相关。

抗-小鼠PD-1scFv的产生

如上所述获得与鼠科PD-1特异结合的抗体(克隆名称为J43)的序列。将该序列修饰成包含κ链前导序列和c-myc标签序列，用丝氨酸甘氨酸连接头形成scFv，并购自GeneArt(Invitrogen，图16)。将其克隆到编码鼠科CAR的现有逆转录病毒表达载体(SFG)中，其中信号转导通过小鼠CD28和CD3ζ分子而介导。产生19m28mz-IRES-J43 和4H11m28mz-IRES-J43，以分别靶向B细胞和卵巢瘤(图17和18)。

抗-小鼠PD-1功能的评测

从Renca肿瘤细胞(ATCC)经PCR扩增出PD-1配体PD-L1，用于扩增小鼠PD-L1的引物如下所示：

引物8.小鼠PD-L1正向引物[SEQ ID NO:49]

5'-TAT TAC ACG TGT TAC ATG AGG ATA TTT GCT GTC TTT-3'

引物9.小鼠PD-L1反向引物[SEQ ID NO:50]

5'TAT AGG ATC CTC GAG GAT GTT ACG TCT CCT CCA AAT GTG TA 3'

将抗-小鼠PD-1的scFv克隆到SFG逆转录病毒骨架中，并转导到 3T3 aAPC、IDS和EL4细胞系中。将用抗-PD-L1抗体(克隆MIH1， BD Pharmingen)染色的细胞进行FACS分选，以确保总细胞群表达 PD-L1。

CTL铬释放杀死检定

将表达所需抗原的靶标细胞用51Cr标记，并以不断降低的效应物: 靶比与T细胞共培养。培养4小时以后，取出上清液，并将其用于测量释放自铬的放射性。通过减去不与25T细胞一起培养的靶标细胞的背景放射性，并除以通过自使用0.2％Triton X-100而完全溶解的靶标细胞测量的放射性，从而确定特异性溶解。

实施例5.阻断CD47会改善CAR T细胞疗法

T细胞可以行基因修饰成通过嵌合抗原受体(CAR)的表达而靶向肿瘤抗原。CD19-特异性CAR T细胞的过继性转移已经在一些血液学恶性肿瘤中表现出临床效力，但具有大淋巴结病的慢性淋巴细胞性白血病患者对CAR T细胞疗法的反应未达到最佳。而且，CAR T细胞疗法在临床试验中对实体瘤未能表现出效力。在本实施例中，通过经由从CAR T细胞中分泌阻断CD47的单链可变片段(scFv)来补充天然抗肿瘤免疫应答，CAR T细胞的临床效力得到增强。之前的研究表明，阻断肿瘤细胞上的CD47与巨噬细胞上的SIRPa之间的相互作用会引起肿瘤细胞的吞噬作用。为利用这一效果，将T细胞修饰成表达 CD19-特异性CAR(1928z)，并分泌对克隆自B6H12.2杂交瘤的人CD47 有特异性的scFv(1928z/B6H12.2 T细胞)。经显示，1928z/B6H12.2 T 细胞分泌对人CD47特异的功能性scFv，其在体外不影响CAR-介导的细胞因子分泌或细胞毒性。1928z/B6H12.2 T细胞而不是1928z T细胞的上清液在体外刺激巨噬细胞吞噬肿瘤细胞。在临床前鼠科模型中， 1928z/B6H12.2 T细胞的过继性转移介导了提高的抗肿瘤作用，并根除 Nalm6肿瘤。这一新的策略将CAR T细胞介导的作用与天然免疫细胞介导的肿瘤细胞的破坏结合，有助于提高CAR T细胞治疗的抗肿瘤效力。

实施例6.通过组成性CD40L表达提高嵌合抗原受体修饰的T-细胞的抗肿瘤效力

使用表达嵌合抗原受体(CAR)的基因修饰T细胞而进行的过继性细胞疗法对于B-ALL患者来说是有希望的疗法。但是，在大多数临床试验中，CAR-修饰的T-细胞未能表现出显著的治疗益处，特别是在低级B-细胞恶性肿瘤和实体瘤背景中。在本实施例部分所示的实验中，我们通过将T-细胞改造成组成性地表达CD40配体(CD40L、CD154) 来进一步提高CAR-修饰的T-细胞的抗肿瘤效力。修饰成组成性地表达 CD40L的T-细胞(CD40L-修饰的T细胞)增加了增殖和促炎TH1细胞因子的分泌。而且，CD40L-修饰的T-细胞通过上调在肿瘤细胞表面上的共刺激分子(CD80和CD86)、粘附分子(CD54、CD58和CD70)、 HLA分子(I类和HLA-DR)和Fas死亡受体(CD95)而放大了CD40+ 肿瘤细胞的免疫原性。此外，CD40L-修饰的T-细胞经来自单核细胞的树突状细胞而诱导成熟并刺激促炎细胞因子IL-12的分泌。最后，靶向肿瘤的CAR/CD40L T-细胞在全身性淋巴瘤的异种器官移植模型中增加了针对CD40+肿瘤的细胞毒性，并延长了荷肿瘤小鼠的存活。这些临床前数据支持了还修饰成组成性表达CD40L的CAR T-细胞的临床应用，其预期有增强的抗肿瘤效力和改善的临床成果。

材料和方法

细胞培养

将DoHH2、Raji和NALM-6(美国菌种保藏中心(American Type CultureCollection))肿瘤细胞系保持在补充有10％热灭活胎牛血清 (FBS)、非必需氨基酸、丙酮酸钠、HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N’-2- 乙磺酸)缓冲剂和2-巯基乙醇(Invitrogen)的RPMI1640培养基(Gibco) 中。293GP-GLV9逆转录病毒生产细胞系已经在之前有过描述，将其在补充有10％FBS的DMEM(Invitrogen)中培养。²⁹将NIH-3T3人工抗原提呈细胞(AAPC)在之前所述的补充有10％热灭活供体牛犊血清 (DCS)的DMEM中培养。³⁰在纪念斯隆-凯特琳癌症中心(MSKCC) IRB许可的操作指南95-054下使用BD Vacutainer CPT管(Becton Dickinson)根据制备商的说明从健康供体的外周血中分离人T-细胞。患者T-细胞和CLL细胞得自在MSKCC IRB-许可的操作指南06-138 下进行治疗的患者，并使用Dynabeads ClinExVivoCD3/CD28珠 (Invitrogen)分离。将T-细胞在补充有10％FBS和20IU/mL IL-2(R&DSystems)的RPMI 1640中培养。单核细胞来源的树突状细胞(moDC) 得自健康供体的组织培养塑料-粘附的外周血单核细胞(PBMC)，并如之前所述在补充有1％混合的人A/B血清、HEPES缓冲剂、2-巯基乙醇(Invitrogen)、白介素-4(IL-4；500IU/ml-R&D Systems)和粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF；1000IU/ml–R&D Systems)的 RPMI 1640中培养。³¹所有培养基均补充有2mmol/L L-谷氨酰胺 (Invitrogen)、100单位/mL青霉素和100μg/ml链霉素(Invitrogen)。

逆转录病毒构建体的构建

使用以下引物(1)5’-CACGTGCATGATCGAAACATACAACCAA ACTTCTCCCCGATCTGC-‘3[SEQ ID NO:3]和(2)5’-CTCGAGGGATC CTCAGAGTTTGAGTAAGCCAAAGGA-3’[SEQ ID NO:4]，由分离的健康供体PBMC中经PCR扩增出人CD40L cDNA(图22A)。使用SFG 载体骨架来构建编码人CD40L的γ-逆转录病毒载体。³²1928z和Pz1(抗 -前列腺特异性膜抗原CAR；抗-PSMA)SFG-载体的构建已经在之前有过描述。^33,34使用重叠PCR产生1928z-IRES-40L和Pz1-IRES-40Lγ- 逆转录病毒载体的构建(图26A)。³⁵

人T-淋巴细胞的逆转录病毒转导

稳定的293GP-GLV9逆转录病毒生产细胞系的生成和人T-细胞的基因修饰已经在之前有过描述。^29,36对于T-细胞转导，将分离的健康供体PBMC用2μg/mL的植物血凝素(PHA)(Sigma)激活，而将患者来源的T-细胞分离、激活并使用Dynabeads ClinExVivo CD3/CD28珠根据制备商的建议进行扩增。如之前记载的，将激活的T-细胞在涂有纤维连接蛋白(retronectin)的非组织培养物处理的板上进行逆转录病毒转导。³⁶在第7天通过流式细胞术来评测基因转移。对照的空白对照 (mock)转导的T-细胞以相同方式产生，除上清液得自空的 293GP-GLV9细胞培养物外。用ViaCount试剂(EMD Millipore) 根据制备商的说明通过easyCyte^TM细胞计数器评测CD40L修饰的T-细胞的增殖。如上所述，使用基因改造成表达目标抗原(CD19或 PSMA)的NIH-3T3鼠科成纤维细胞来源的AAPC，并连同共刺激 (CD80)，进行用于体内实验的修饰的T-细胞的扩增。³⁰

共培养检定

将肿瘤细胞(DOHH2、Raji、Ph⁺ALL 3.1、NALM-6)以5:1的比率与CD40L-修饰的T-细胞以及空白对照转导的T-细胞共培养。3天后进行流式细胞术，以测定肿瘤细胞的表型。将moDC(2.5x10⁵)以1:5 比率与自体CD40L-修饰的T-细胞或空白对照转导的T-细胞共培养，24 小时后在Luminex IS100系统上对组织培养上清液进行IL-12p70分析 (参见下文)。另外将moDC以5:1的比率与CD40L-修饰的T-细胞以及空白对照转导的T-细胞共培养，24小时后通过流式细胞术分析 moDC的表型。

细胞毒性检定

如之前所述，使用标准⁵¹Cr释放检定来确定转导的T-细胞的细胞溶解能力。³⁴

细胞因子检测检定

使用MILLIPLEX人细胞因子检测系统(Millipore Corp.)，并结合 Luminex IS100系统和IS 2.3软件(Luminex Corp.)根据制备商的说明，评测组织培养上清液中的细胞因子检测。.

流式细胞术

使用FACScan细胞计进行流式细胞术，并使用FlowJo 9.2版本软件(Tree Star)分析数据。使用CAR特异性亚美尼亚仓鼠单克隆抗体 19E3(1928z)和12D11(1928z和Pz1，MSKCC单克隆抗体设施)检测CAR的表达。使用小鼠抗-人CD154(BD Biosciences)检测CD40L 的表达。将人T-细胞用小鼠抗-人CD3(BD Biosciences)、CD4和CD8 (Invitrogen)染色。将moDC用小鼠抗-人CD11b、HLA-DR、CD83 和CD86(Invitrogen)染色。使用小鼠抗-人CD19、CD40、CD54、CD80、CD86、HLA-I类和HLA-DR(Invitrogen)、CD58、CD70和CD95(BDBiosciences)检测DOHH2、Raji和NALM6肿瘤细胞表型。

CAR T-细胞体内研究

我们对8-12周龄的SCID/Beige(CB17.Cg-Prkdc^scidLyst^bg-J/Crl)小鼠(CharlesRiver Laboratories)通过静脉内注射接种DOHH2肿瘤细胞 (5x10⁵细胞)。两天后，将小鼠静脉内输注转导的T-细胞(1x10⁷ CAR T-细胞)。在临床上监测肿瘤进展，当疾病变得临床上明显时(后肢麻痹发展或对刺激反应降低)将小鼠无痛致死。所有鼠科研究均根据纪念斯隆-凯特琳癌症中心机构动物护理和使用委员会批准的操作指南 (00-05-065)进行。

统计学分析

所有分析均使用Graphpad Prism 5.0软件计算，存活数据使用对数秩分析评测，且所有其他分析用Mann-Whitney检验(单尾)实现。

结果

人T-细胞的CD40L构成性表达

我们最初用CD40L逆转录病毒载体转导来自健康供体的T-细胞 (图22A)。CD40L基因对T-细胞的逆转录病毒转导常规地引起≥40％基因转移，CD40L在CD4+和CD8+T-细胞子集中均稳定表达(图22B)。与相同三个供体产生的空白对照转导的T-细胞相比较，CD40L-修饰的 T-细胞的增殖显著增加(图22C)。对CD40-修饰的T-细胞的组织培养基进行分析，显示出如所预计的，与空白对照转导的T-细胞相比较，可溶性CD40L(sCD40L)显著增加，并且促炎性细胞因子IFN-γ和 GM-CSF的分泌显著增加(图22D)。

CD40L-修饰的T-细胞改变CD40+肿瘤细胞系和患者来源的CLL细胞的表型

为考察CD40L/CD40通路对改变肿瘤细胞表型的能力，进行 CD40+B-细胞肿瘤细胞与CD40L-修饰的T-细胞或空白对照转导的T- 细胞的共培养。与CD40L-修饰的T-细胞、而非空白对照转导的T-细胞的一起培养，引起DOHH2肿瘤细胞表面上共刺激分子(CD80和CD86)、粘附分子(CD54、CD58和CD70)、HLA分子(I类HLA和 HLA-DR)和Fas死亡受体(CD95)的上调(图23A)。当DOHH2肿瘤细胞在CD40L-修饰的T细胞的含有升高水平sCD40L的条件培养基中培养时，表型变化也很明显(图28)。为确定肿瘤细胞上CD40的表达是否对改变肿瘤细胞表型而言为必要的，进行CD40-肿瘤细胞系 (NALM6)与CD40L-修饰的T-细胞以及空白对照转导的T-细胞的共培养。这些研究没有引起表型的变化，说明需要肿瘤的CD40表达来诱导CD40L介导的肿瘤细胞表型的变化(图23B)。

为在临床相关背景中进一步验证该作用，我们将得自CLL患者的 CD40L-修饰的T-细胞与自体CLL肿瘤细胞共培养。得自CLL患者的 T-细胞的逆转录病毒转导常规地引起≥40％的基因转移，CD40L基因的表达稳定(图24A)。在该背景下，源自患者的CD40L-修饰的T-细胞、而非空白对照转导的T细胞表现出上调自体CLL细胞表面上共刺激分子、粘附分子、HLA分子和Fas死亡受体的能力(图24B)。

CD40L-修饰的T-细胞诱导IL-12p70分泌并介导moDC的成熟

鉴于CD40L在DC成熟和促炎细胞因子IL-12分泌中的作用，我们接下来考察CD40L-修饰的T-细胞是否可以在与自体moDC共培养时诱导出相同的作用。显著地，我们发现，CD40L-修饰的T-细胞在含有三个不同供体的moDC和自体CD40L-修饰的T-细胞的共培养中诱导出 IL-12p70的分泌(图25A)。在与CD40L-修饰的T-细胞而非空白对照转导的T细胞的共培养之后，还观察到通过表面共刺激分子(HLA-DR、 CD86和CD83)的上调而确定的moDC成熟(图25B)。

T-细胞的CAR和CD40L表达引起增加的体外和体内细胞毒性

我们接下来使用双顺反子逆转录病毒载体(1928z/CD40L；Figure 26A)来检测T-细胞表达抗-CD19 CAR(1928z)和CD40L的能力。T- 细胞的转导常规地引起1928z和CD40L的≥40％的表达(1928z/CD40L T-细胞；图26B)。还产生包含抗-CD19 CAR(1928z)和抗-PSMACAR 的对照逆转录病毒载体(Pz1和Pz1/CD40L；图26B)。为检测 1928z/CD40L T-细胞的体外抗肿瘤活性，进行标准的4小时⁵¹Cr释放检定。在与包含修饰成仅表达1928z CAR的T细胞的对照T-细胞组相比较时，CD40L的组成性表达在统计学上提高1928z T-细胞针对CD19+肿瘤细胞的溶解能力(图26C)。还显示出针对其他CD19+/CD40+肿瘤细胞系的增强的细胞毒性(图29)。

为考察1928z/CD40L T-细胞的体内抗肿瘤活性，我们使用全身性 DOHH2淋巴瘤的异种器官移植模型。我们之前已经观察到，在 SCID/Beige小鼠中，全身性DOHH2肿瘤细胞对于CD19-靶向的CAR T- 细胞疗法是明显难治的。为评测CD40L对CAR T-细胞的进一步修饰是否在该模型中增强抗肿瘤效力，我们用CAR/CD40L T-细胞接种并治疗荷全身性DOHH2肿瘤的SCID/Beige小鼠。显著地，与用1928z T- 细胞或对照T-细胞(Pz1和Pz1/CD40L T-细胞)的处理相比较，使用 1928z/CD40L T-细胞的处理表现出提高的存活，并在30％用1928z/40L T-细胞处理的小鼠中引起长期存活(图27)。

讨论

使用CAR T-细胞的过继性疗法已经在B-细胞恶性肿瘤患者中显示出有希望的临床反应。^2-4这些研究已经显示出CAR T-细胞作为唯一抗肿瘤效应物细胞的效力。但是，这一方法对具有稳健免疫抑制肿瘤微环境的肿瘤可能成功率有限。⁵而且，以其目前的形式，CAR T-细胞未能显示出在靶标抗原丢失后应答肿瘤逃逸的能力。⁶克服这些限制的一种可能的方法是通过CD40L的组成性表达来进一步改造CAR T-细胞，以致力于提高T-细胞的细胞溶解能力/增殖，放大肿瘤免疫原性，并提高DC抗原提呈/功能。通过CD40L的组成性表达对CAR T-细胞的修饰还可以进一步激活内源性免疫应答，从而提高抗肿瘤效力。

为评测T-细胞的CD40L组成性表达的作用，我们首先开发出含有单独CD40L基因的逆转录病毒载体。当在T-细胞中转导时，表现出 CD4⁺和CD8⁺T-细胞子集的组成性表达(图22B)。尽管更常见地与 CD4⁺细胞有关，记忆CD8⁺T-细胞中的CD40L表达和辅助功能最近才得以报道。³⁷还已知CD40L表达促进T-细胞增殖和促炎性TH1细胞因子(IFN-γ、GM-CSF)的分泌。^21,22与来自同一供体的类似激活但空白对照转导的T-细胞相比较，CD40L-修饰的T-细胞表现出分泌促炎性细胞因子的能力，并且增强增殖(图22C和22D)。通过CD40L的表达武装T-细胞具有提高其抗肿瘤功能/激活的潜力。

细胞表面蛋白(包括HIAI类、共刺激分子和/或粘附分子)的下调常常被肿瘤用于避免免疫识别。^5,38,39随着恶性肿瘤细胞表面上Fas 死亡受体的减少，还会发生细胞凋亡耐受。⁴⁰为抵消这一点，CD40L 可以与恶性肿瘤细胞上的CD40相互作用，以介导共刺激分子(CD80 和CD86)、粘附分子(CD54、CD58和CD70)、HLA分子(HLA I类和HLA-DR)的上调，并通过恶性B-细胞肿瘤上的Fas/FasL通路促进细胞凋亡。^41,42CD40L-修饰的T-细胞改变CD40+肿瘤细胞的表型，导致这些关键表面蛋白的上调，从而抵消肿瘤细胞的免疫逃避能力(图2)。这一作用依赖于肿瘤细胞的CD40表达，因为当CD40-肿瘤细胞与 CD40L-修饰的T-细胞共培养时，不存在表型变化(图23A-B)。这一作用也在更加临床相关的背景中观察到，其中源自CLL患者的共培养的CD40L-修饰的T-细胞放大自体CLL细胞的免疫原性(图24A-B)。这一发现表明了T-细胞通过组成性CD40L表达保留了放大自体恶性肿瘤细胞的免疫原性的能力。重要的是，细胞与细胞的接触不是改变肿瘤细胞表型的必要条件，因为含有水平升高的sCD40L的培养基引起类似的表型变化(图28)。在之前公开的使用以编码CD40L的腺病毒载体转导的自体CLL肿瘤细胞(Ad-CD40L CLL细胞)的疫苗研究中，已经显示出通过CD40L/CD40通路放大癌细胞的免疫原性会诱导内源性抗肿瘤应答。^27,28输注进一步修饰成组成性地表达CD40L的肿瘤特异性T细胞还可以具有类似的诱导内源性抗肿瘤应答的能力。这可以通过补充内源性抗肿瘤T或NK细胞引起表位扩展，从而限制通过下调单个靶标抗原的肿瘤逃逸能力。

树突状细胞(DC)功能在肿瘤微环境内受到阻碍。通常，DC在淋巴结内成熟、迁移并提呈抗原，从而刺激免疫系统对恶性肿瘤或病原体存在的适应性武装。⁵但是，暴露于抑制性肿瘤微环境的DC具有诱导T_regs并耐受肿瘤特异性T-细胞的矛盾功能。⁴³为抵消这一点， CD40L/CD40通路可以推进DC抗原提呈、促炎细胞因子IL-12的产生，并促进CD8+T细胞的细胞毒性功能。^19,20之前已经显示，激动剂CD40 抗体激活DC，并促进CD8⁺T-细胞应答，从而取代对于CD4⁺T-细胞辅助的需求。²⁶而且，已经显示，CD40L-修饰的肿瘤特异性CD8⁺T-细胞刺激DC的成熟，并放大荷肿瘤小鼠中过继性转移的CD8⁺T细胞的抗肿瘤应答。⁴⁴为测试CD40L-修饰的T-细胞放大人DC功能的能力，使用自体moDC的体外共培养实验。显著的是，CD40L-修饰的T-细胞刺激moDC的IL-12p70分泌(图25A-B)。IL-12是具有若干免疫刺激功能(包括提高T-细胞增殖、细胞毒性能力和介导对Treg抑制的耐性的能力，正如我们和其他人在之前示出的)的多效性细胞因子。^7,45 CAR/40L T-细胞刺激DC产生IL-12的能力可以解释成过继性转移的 CAR T-细胞的增强的抗肿瘤作用，以及内源性肿瘤特异性T-细胞和自然杀伤(NK)细胞的补充和激活。通过促进在紧邻肿瘤处产生IL-12，我们预测到与先前在全身性IL-12给药之后示出严重毒性的研究相反的最下的IL-12相关毒性。除刺激IL-12产生以外，CD40L-修饰的T- 细胞还促进DC的成熟，这在CAR T-细胞毒性的背景中应当进一步提高DC肿瘤抗原摄取和提呈，从而引起效应物T-细胞和NK细胞对内源性抗肿瘤应答的补充/激活(图25A-B)。综合考虑，增强的DC功能应当解释成基因修饰的肿瘤特异性T-细胞通过补充内源性抗肿瘤免疫应答而提高的抗肿瘤效力。

已经显示，在输注到CD40L-缺陷的小鼠中之后，CD40L在骨髓或胸腺细胞上的组成性表达引起T-淋巴增生性疾病。⁴⁷在胸腺细胞不间断的CD40L刺激之后，胸腺内产生的无性系种群可能已引起恶性转化 (而不是CD40L-修饰细胞的插入瘤形成(insertionaloncogenesis))。尽管我们已经注意到在输注CAR/CD40L T-细胞之后的最小化的细胞毒性以及恶性转化的不存在，考虑到恶性T-细胞转化，可以合意地在逆转录病毒载体内包含有效的自杀基因，例如iCasp9。⁴⁸

实施例6参考文献

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本发明实施方式

根据前述说明，显而易见的是，可以对本文所述的发明做出变化和修改以使其适合于各种用途和条件。这些实施方式也在权利要求的范围以内。

在本文变量的任意定义中对元素名录的列举包括变量作为任何单一元素或所列元素的组合(或亚组合)的定义。本文中对实施方式的列举包括实施方式作为任何单一实施方式或者与任何其他实施方式或其部分组合。

本申请的一些主题可能涉及到美国专利申请第12/593,751号，其是2010年3月8日提交的国际专利申请PCT/US2008/004251根据35 U.S.C.§371的美国国家阶段申请，其要求2007年3月30日提交的美国临时申请系列第60/921,144号优先权，其公开内容通过引用的方式全部并入本文。

在此通过引用的方式将本说明书中提及的所有专利和公开物并入，其程度如同具体且分别地表明将各个独立的专利和公开物经引用而并入。

序列表

<110> 纪念斯隆-凯特琳癌症中心

<120> 用于免疫疗法的组合物和方法

<130> 072734.0152

<140> PCT/US2014/018667

<141> 2014-02-26

<150> 61/769,543

<151> 2013-02-26

<160> 56

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 164

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Lys Trp Lys Ala Leu Phe Thr Ala Ala Ile Leu Gln Ala Gln Leu

1 5 10 15

Pro Ile Thr Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys

20 25 30

Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala

35 40 45

Leu Phe Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr

50 55 60

Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg

65 70 75 80

Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met

85 90 95

Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

100 105 110

Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

115 120 125

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

130 135 140

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

145 150 155 160

Leu Pro Pro Arg

<210> 2

<211> 220

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val

1 5 10 15

Thr Gly Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr

20 25 30

Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser

35 40 45

Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu

50 55 60

Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser

65 70 75 80

Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr

85 90 95

Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys

100 105 110

Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser

115 120 125

Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro

130 135 140

Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly

145 150 155 160

Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile

165 170 175

Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met

180 185 190

Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro

195 200 205

Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

210 215 220

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成引物

<400> 3

cacgtgcatg atcgaaacat acaaccaaac ttctccccga tctgc 45

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成引物

<400> 4

ctcgagggat cctcagagtt tgagtaagcc aaagga 36

<210> 5

<211> 255

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu

1 5 10 15

Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro

20 25 30

Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys

35 40 45

Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile

50 55 60

Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser

65 70 75 80

Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly

85 90 95

Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu

100 105 110

Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln

115 120 125

Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys

130 135 140

Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro

145 150 155 160

Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala

165 170 175

Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu

180 185 190

Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu

195 200 205

Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

210 215 220

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

225 230 235 240

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

245 250 255

<210> 6

<211> 183

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

Met Glu Arg Val Gln Pro Leu Glu Glu Asn Val Gly Asn Ala Ala Arg

1 5 10 15

Pro Arg Phe Glu Arg Asn Lys Leu Leu Leu Val Ala Ser Val Ile Gln

20 25 30

Gly Leu Gly Leu Leu Leu Cys Phe Thr Tyr Ile Cys Leu His Phe Ser

35 40 45

Ala Leu Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val

50 55 60

Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln

65 70 75 80

Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn

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Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu

100 105 110

Val Asn Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln

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Leu Lys Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr

130 135 140

Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu

145 150 155 160

Asp Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn

165 170 175

Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu

180

<210> 7

<211> 486

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<220>

<221> MOD_RES

<222> (486)..(486)

<223> 任何氨基酸

<400> 7

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro

20 25 30

Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser

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Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu

50 55 60

Trp Ile Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly

65 70 75 80

Lys Phe Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr

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Ala Tyr Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr

100 105 110

Phe Cys Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr

145 150 155 160

Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val

165 170 175

Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln

180 185 190

Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Tyr

195 200 205

Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr

210 215 220

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Lys Asp Leu Ala Asp

225 230 235 240

Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr Ser Gly Gly Gly

245 250 255

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260 265 270

Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val

275 280 285

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290 295 300

Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser

305 310 315 320

Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg

325 330 335

Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro

340 345 350

Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe

355 360 365

Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro

370 375 380

Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly

385 390 395 400

Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro

405 410 415

Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr

420 425 430

Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly

435 440 445

Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln

450 455 460

Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln

465 470 475 480

Ala Leu Pro Pro Arg Xaa

485

<210> 8

<211> 1458

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多核苷酸

<400> 8

ccatggctct cccagtgact gccctactgc ttcccctagc gcttctcctg catgcagagg 60

tgaagctgca gcagtctggg gctgagctgg tgaggcctgg gtcctcagtg aagatttcct 120

gcaaggcttc tggctatgca ttcagtagct actggatgaa ctgggtgaag cagaggcctg 180

gacagggtct tgagtggatt ggacagattt atcctggaga tggtgatact aactacaatg 240

gaaagttcaa gggtcaagcc acactgactg cagacaaatc ctccagcaca gcctacatgc 300

agctcagcgg cctaacatct gaggactctg cggtctattt ctgtgcaaga aagaccatta 360

gttcggtagt agatttctac tttgactact ggggccaagg gaccacggtc accgtctcct 420

caggtggagg tggatcaggt ggaggtggat ctggtggagg tggatctgac attgagctca 480

cccagtctcc aaaattcatg tccacatcag taggagacag ggtcagcgtc acctgcaagg 540

ccagtcagaa tgtgggtact aatgtagcct ggtatcaaca gaaaccagga caatctccta 600

aaccactgat ttactcggca acctaccgga acagtggagt ccctgatcgc ttcacaggca 660

gtggatctgg gacagatttc actctcacca tcactaacgt gcagtctaaa gacttggcag 720

actatttctg tcaacaatat aacaggtatc cgtacacgtc cggagggggg accaagctgg 780

agatcaaacg ggcggccgca attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga 840

agagcaatgg aaccattatc catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc 900

ccggaccttc taagcccttt tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg gcttgctata 960

gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg agcaggctcc 1020

tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc aagcattacc 1080

agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc cagagtgaag ttcagcagga 1140

gcgcagagcc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag ctcaatctag 1200

gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct gagatggggg 1260

gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag aaagataaga 1320

tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc aaggggcacg 1380

atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc cttcacatgc 1440

aggccctgcc ccctcgcg 1458

<210> 9

<211> 491

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 9

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro

20 25 30

Gly Gly Ser Leu Lys Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

35 40 45

Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Leu Ser Pro Glu Met Arg Leu Glu

50 55 60

Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Ala Gly Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Asp

65 70 75 80

Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr

85 90 95

Leu His Leu Gln Met Gly Ser Leu Arg Ser Gly Asp Thr Ala Met Tyr

100 105 110

Tyr Cys Ala Arg Gln Gly Phe Gly Asn Tyr Gly Asp Tyr Tyr Ala Met

115 120 125

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu

145 150 155 160

Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr

165 170 175

Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys

180 185 190

Asn Gln Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Glu Leu

195 200 205

Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

210 215 220

Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val

225 230 235 240

Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asn Leu

245 250 255

Leu Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala

260 265 270

Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn

275 280 285

Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu

290 295 300

Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly

305 310 315 320

Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe

325 330 335

Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn

340 345 350

Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr

355 360 365

Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser

370 375 380

Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr

385 390 395 400

Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys

405 410 415

Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn

420 425 430

Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu

435 440 445

Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly

450 455 460

His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr

465 470 475 480

Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490

<210> 10

<211> 1475

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多核苷酸

<400> 10

ccatggctct cccagtgact gccctactgc ttcccctagc gcttctcctg catgcagagg 60

tgaagctgca ggagtcaggg ggaggcttcg tgaagcctgg agggtccctc aaagtctcct 120

gtgcagcctc tggattcact ttcagtagct atgccatgtc ctgggttcgc ctgagtccgg 180

agatgaggct ggagtgggtc gcaaccatta gcagtgctgg tggttacatc ttctattctg 240

acagtgtgca gggacgattc accatttcca gagacaatgc caagaacacc ctgcacctgc 300

aaatgggcag tctgaggtct ggggacacgg ccatgtatta ctgtgcaagg cagggatttg 360

gtaactacgg tgattactat gctatggact actggggcca agggaccacg gtcaccgtct 420

cctcaggtgg aggtggatca ggtggaggtg gatctggtgg aggtggatct gacattgagc 480

tcacccagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact atgagctgca 540

aatccagtca gagtctgctc aacagtagaa cccgaaagaa ccagttggct tggtaccagc 600

aaaaaccagg acagtctcct gaactgctga tctactgggc atccactagg caatctggag 660

tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc atcagcagtg 720

tgcaggctga agacctggca gtttattact gccagcaatc ttataatcta ctcacgttcg 780

gtcctgggac caagctggag atcaaacggg cggccgcaat tgaagttatg tatcctcctc 840

cttacctaga caatgagaag agcaatggaa ccattatcca tgtgaaaggg aaacaccttt 900

gtccaagtcc cctatttccc ggaccttcta agcccttttg ggtgctggtg gtggttggtg 960

gagtcctggc ttgctatagc ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc tgggtgagga 1020

gtaagaggag caggctcctg cacagtgact acatgaacat gactccccgc cgccccgggc 1080

ccacccgcaa gcattaccag ccctatgccc caccacgcga cttcgcagcc tatcgctcca 1140

gagtgaagtt cagcaggagc gcagagcccc ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct 1200

ataacgagct caatctagga cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc 1260

gggaccctga gatgggggga aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg 1320

aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc 1380

ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct 1440

acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgc 1475

<210> 11

<211> 250

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 11

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Asp Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Gly Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu

130 135 140

Ser Val Thr Pro Gly Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln

145 150 155 160

Thr Ile Ser Asp Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser

165 170 175

Pro Arg Leu Leu Ile Lys Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro

180 185 190

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile

195 200 205

Asn Ser Val Glu Pro Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly

210 215 220

His Gly Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

225 230 235 240

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

245 250

<210> 12

<211> 235

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 12

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

130 135 140

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

145 150 155 160

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

165 170 175

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

180 185 190

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

195 200 205

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg

210 215 220

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

225 230 235

<210> 13

<211> 421

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 13

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Met Gly Leu Gly Leu Gln Trp Val Phe Phe Val

20 25 30

Ala Leu Leu Lys Gly Val His Cys Glu Val Arg Leu Leu Glu Ser Gly

35 40 45

Gly Gly Leu Val Lys Pro Glu Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala

50 55 60

Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Phe Met Ser Trp Val Arg Gln Ala

65 70 75 80

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala His Ile Tyr Thr Lys Ser Tyr

85 90 95

Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ser Gly Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile

100 105 110

Ser Arg Asp Asp Ser Arg Ser Met Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu

115 120 125

Arg Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Gly Ser Gly

130 135 140

Tyr Pro Ser Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Ser Ala Thr Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Ala Cys

165 170 175

Asp Ser Thr Thr Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

180 185 190

Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Val

195 200 205

Asn Val Gly Glu Thr Val Lys Ile Thr Cys Ser Gly Asp Gln Leu Pro

210 215 220

Lys Tyr Phe Ala Asp Gln Phe His Gln Arg Ser Asp Gln Thr Ile Leu

225 230 235 240

Gln Val Ile Tyr Asp Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg

245 250 255

Ile Ser Gly Ser Ser Ser Gly Thr Thr Ala Thr Leu Thr Ile Arg Asp

260 265 270

Val Arg Ala Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Phe Ser Gly Tyr Val

275 280 285

Asp Ser Asp Ser Lys Leu Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Gln Leu Thr

290 295 300

Val Leu Gly Gly Pro Lys Ser Ser Pro Lys Val Thr Val Phe Pro Pro

305 310 315 320

Ser Pro Glu Glu Leu Arg Thr Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Val

325 330 335

Asn Asp Phe Tyr Pro Gly Ser Ala Thr Val Thr Trp Lys Ala Asn Gly

340 345 350

Ala Thr Ile Asn Asp Gly Val Lys Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Gly

355 360 365

Gln Asn Tyr Met Thr Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Ala Asp Gln Trp

370 375 380

Lys Ser His Asn Arg Val Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Glu Thr

385 390 395 400

Val Glu Lys Ser Leu Ser Pro Ala Glu Cys Leu Glu Gln Lys Leu Ile

405 410 415

Ser Glu Glu Asp Leu

420

<210> 14

<211> 1274

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多核苷酸

<400> 14

ccatggagac agacacactc ctgctatggg tactgctgct ctgggttcca ggttccactg 60

gtgacatggg attgggactg cagtgggttt tctttgttgc tcttttaaaa ggtgtccact 120

gtgaggtgcg gcttctggag tctggtggag gattagtgaa gcctgagggg tcactgaaac 180

tctcctgtgt ggcctctgga ttcaccttca gtgactattt catgagctgg gtccgccagg 240

ctccagggaa ggggctggag tgggttgctc acatatacac gaaaagttat aattatgcaa 300

cttattactc gggttcggtg aaaggcagat tcaccatctc cagagatgat tcccgaagca 360

tggtctacct gcaaatgaac aacctgagaa ctgaggacac ggccacttat tactgtacaa 420

gagatggaag cggatatccc tctctggatt tctggggtca agggacccaa gtcactgtct 480

cctcagccac aacaacagcc ccatctgtct atcccttggc ccctgcctgt gacagcacaa 540

ccaaatcggg tggaggtgga tcaggtggag gtggatctgg tggaggtgga tcttatgagc 600

tgactcagcc accttcagca tcagtcaatg taggagagac tgtcaaaatc acctgctctg 660

gggaccaatt gccgaaatat tttgcagatt ggtttcatca aaggtcagac cagaccattt 720

tgcaagtgat atatgatgat aataagcgcc cctcggggat ccctgaaaga atctctgggt 780

ccagctcagg gacaacagcc accttgacca tcagagatgt ccgggctgag gatgaaggtg 840

actattactg tttctcagga tatgttgata gtgatagcaa attgtatgtt tttggcagcg 900

gaacccagct caccgtccta ggtggaccca agtcttctcc caaagtcaca gtgtttccac 960

cttcacctga ggagctccgg acaaacaaag ccacactggt gtgtctggtt aatgacttct 1020

acccgggttc tgcaacagtg acctggaagg caaatggagc aactatcaat gatggggtga 1080

agactacaaa gccttccaaa cagggccaaa actacatgac cagcagctac ctaagtttga 1140

cagcagacca gtggaaatct cacaacaggg tttcctgcca agttacccat gaaggggaaa 1200

ctgtggagaa gagtttgtcc cctgcagaat gtctcgaaca aaaactcatc tcagaagagg 1260

atctgtaact cgag 1274

<210> 15

<211> 21

<212> PRT

<213> 智人

<400> 15

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp

20

<210> 16

<211> 21

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus sp.）

<400> 16

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp

20

<210> 17

<211> 21

<212> PRT

<213> 未知物

<220>

<223> 未知物的说明：CDS前导肽

<400> 17

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 18

<211> 824

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多核苷酸

<400> 18

ccatggagac agacacactc ctgctatggg tactgctgct ctgggttcca ggttccactg 60

gtgacgaggt gcagctggtg gagtccgggg gagacttagt gaagcctgga gggtccctga 120

aactctcctg tgcagcctct ggattcactt tcagtggcta tggcatgtct tgggttcgcc 180

agactccaga caagaggctg gagtgggtcg caaccattac tagtggtggt acttacacct 240

actatccaga cagtgtgaag gggcgattca ccatctccag agacaatgcc aagaacaccc 300

tgtacctgca aatagacagt ctgaagtctg aggatacagc catatatttc tgtgcaagat 360

ccctcgcggg aaatgctatg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc gtctcctcag 420

gtggaggtgg atcaggtgga ggtggatctg gtggaggtgg atctgacatt gtgatgactc 480

agtctccagc caccctgtct gtgactccag gagatagagt ctctctttcc tgcagggcca 540

gccagactat tagcgactac ttacactggt atcaacaaaa atcacatgag tctccaaggc 600

ttctcatcaa atttgcttcc caatccattt ctgggatccc ctccaggttc agtggcagtg 660

gatcaggctc agatttcact ctcagtatca acagtgtgga acctgaagat gttggagtgt 720

attactgtca aaatggtcac ggctttcctc ggacgttcgg tggaggcacc aagctggaaa 780

tcaaagaaca aaaactcatc tcagaagagg atctgtaact cgag 824

<210> 19

<211> 824

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多核苷酸

<400> 19

ccatggcctt accagtgacc gccttgctcc tgccgctggc cttgctgctc cacgccgcca 60

ggccggaggt gcagctggtg gagtccgggg gagacttagt gaagcctgga gggtccctga 120

aactctcctg tgcagcctct ggattcactt tcagtggcta tggcatgtct tgggttcgcc 180

agactccaga caagaggctg gagtgggtcg caaccattac tagtggtggt acttacacct 240

actatccaga cagtgtgaag gggcgattca ccatctccag agacaatgcc aagaacaccc 300

tgtacctgca aatagacagt ctgaagtctg aggatacagc catatatttc tgtgcaagat 360

ccctcgcggg aaatgctatg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc gtctcctcag 420

gtggaggtgg atcaggtgga ggtggatctg gtggaggtgg atctgacatt gtgatgactc 480

agtctccagc caccctgtct gtgactccag gagatagagt ctctctttcc tgcagggcca 540

gccagactat tagcgactac ttacactggt atcaacaaaa atcacatgag tctccaaggc 600

ttctcatcaa atttgcttcc caatccattt ctgggatccc ctccaggttc agtggcagtg 660

gatcaggctc agatttcact ctcagtatca acagtgtgga acctgaagat gttggagtgt 720

attactgtca aaatggtcac ggctttcctc ggacgttcgg tggaggcacc aagctggaaa 780

tcaaagaaca aaaactcatc tcagaagagg atctgtaact cgag 824

<210> 20

<211> 2337

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多核苷酸

<400> 20

atggctctcc cagtgactgc cctactgctt cccctagcgc ttctcctgca tgcagaggtg 60

aagctgcagc agtctggggc tgagctggtg aggcctgggt cctcagtgaa gatttcctgc 120

aaggcttctg gctatgcatt cagtagctac tggatgaact gggtgaagca gaggcctgga 180

cagggtcttg agtggattgg acagatttat cctggagatg gtgatactaa ctacaatgga 240

aagttcaagg gtcaagccac actgactgca gacaaatcct ccagcacagc ctacatgcag 300

ctcagcggcc taacatctga ggactctgcg gtctatttct gtgcaagaaa gaccattagt 360

tcggtagtag atttctactt tgactactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 420

ggtggaggtg gatcaggtgg aggtggatct ggtggaggtg gatctgacat tgagctcacc 480

cagtctccaa aattcatgtc cacatcagta ggagacaggg tcagcgtcac ctgcaaggcc 540

agtcagaatg tgggtactaa tgtagcctgg tatcaacaga aaccaggaca atctcctaaa 600

ccactgattt actcggcaac ctaccggaac agtggagtcc ctgatcgctt cacaggcagt 660

ggatctggga cagatttcac tctcaccatc actaacgtgc agtctaaaga cttggcagac 720

tatttctgtc aacaatataa caggtatccg tacacgtccg gaggggggac caagctggag 780

atcaaacggg cggccgcaat tgaagttatg tatcctcctc cttacctaga caatgagaag 840

agcaatggaa ccattatcca tgtgaaaggg aaacaccttt gtccaagtcc cctatttccc 900

ggaccttcta agcccttttg ggtgctggtg gtggttggtg gagtcctggc ttgctatagc 960

ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc tgggtgagga gtaagaggag caggctcctg 1020

cacagtgact acatgaacat gactccccgc cgccccgggc ccacccgcaa gcattaccag 1080

ccctatgccc caccacgcga cttcgcagcc tatcgctcca gagtgaagtt cagcaggagc 1140

gcagagcccc ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 1200

cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga 1260

aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 1320

gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgaa 1380

ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag 1440

gccctgcccc ctcgcggatc tggagcaaca aacttctcac tactcaaaca agcaggtgac 1500

gtggaggaga atcccggacc catggagaca gacacactcc tgctatgggt actgctgctc 1560

tgggttccag gttccactgg tgacgaggtg cagctggtgg agtccggggg agacttagtg 1620

aagcctggag ggtccctgaa actctcctgt gcagcctctg gattcacttt cagtggctat 1680

ggcatgtctt gggttcgcca gactccagac aagaggctgg agtgggtcgc aaccattact 1740

agtggtggta cttacaccta ctatccagac agtgtgaagg ggcgattcac catctccaga 1800

gacaatgcca agaacaccct gtacctgcaa atagacagtc tgaagtctga ggatacagcc 1860

atatatttct gtgcaagatc cctcgcggga aatgctatgg actactgggg tcaaggaacc 1920

tcagtcaccg tctcctcagg tggaggtgga tcaggtggag gtggatctgg tggaggtgga 1980

tctgacattg tgatgactca gtctccagcc accctgtctg tgactccagg agatagagtc 2040

tctcttccct gcagggccag ccagactatt agcgactact tacactggta tcaacaaaaa 2100

tcacatgagt ctccaaggct tctcatcaaa tttgcttccc aatccatttc tgggatcccc 2160

tccaggttca gtggcagagg atcaggctca gatttcactc tcagtatcaa cagtgtggaa 2220

cctgaagatg ttggagtgta ttactgtcaa aatggtcacg gctttcctcg gacgttcggt 2280

ggaggcacca agctggaaat caaagaacaa aaactcatct cagaagagga tctgtaa 2337

<210> 21

<211> 1644

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多核苷酸

<400> 21

catggctctc ccagtgactg ccctactgct tcccctagcg cttctcctgc atgcagaggt 60

gaagctgcag gagtcagggg gaggcttcgt gaagcctgga gggtccctca aagtctcctg 120

tgcagcctct ggattcactt tcagtagcta tgccatgtcc tgggttcgcc tgagtccgga 180

gatgaggctg gagtgggtcg caaccattag cagtgctggt ggttacatct tctattctga 240

cagtgtgcag ggacgattca ccatttccag agacaatgcc aagaacaccc tgcacctgca 300

aatgggcagt ctgaggtctg gggacacggc catgtattac tgtgcaaggc agggatttgg 360

taactacggt gattactatg ctatggacta ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc 420

ctcaggtgga ggtggatcag gtggaggtgg atctggtgga ggtggatctg acattgagct 480

cacccagtct ccatcctccc tggctgtgtc agcaggagag aaggtcacta tgagctgcaa 540

atccagtcag agtctgctca acagtagaac ccgaaagaac cagttggctt ggtaccagca 600

aaaaccagga cagtctcctg aactgctgat ctactgggca tccactaggc aatctggagt 660

ccctgatcgc ttcacaggca gtggatctgg gacagatttc actctcacca tcagcagtgt 720

gcaggctgaa gacctggcag tttattactg ccagcaatct tataatctac tgcaacaaac 780

ttctcactac tcaaacaagc aggtgacgtg gaggagaatc ccggacccat ggagacagac 840

acactcctgc tatgggtact gctgctctgg gttccaggtt ccactggtga cgaggtgcag 900

ctggtggagt ccgggggaga cttagtgaag cctggagggt ccctgaaact ctcctgtgca 960

gcctctggat tcactttcag tggctatggc atgtcttggg ttcgccagac tccagacaag 1020

aggctggagt gggtcgcaac cattactagt ggtggtactt acacctacta tccagacagt 1080

gtgaaggggc gattcaccat ctccagagac aatgccaaga acaccctgta cctgcaaata 1140

gacagtctga agtctgagga tacagccata tatttctgtg caagatccct cgcgggaaat 1200

gctatggact actggggtca aggaacctca gtcaccgtct cctcaggtgg aggtggatca 1260

ggtggaggtg gatctggtgg aggtggatct gacattgtga tgactcagtc tccagccacc 1320

ctgtctgtga ctccaggaga tagagtctct ctttcctgca gggccagcca gactattagc 1380

gactacttac acaggtatca acaaaaatca catgagtctc caaggcttct catcaaattt 1440

gcttcccaat ccatttctgg gatcccctcc aggttcagtg gcagtggatc aggctcagat 1500

ttcactctca gtatcaacag tgtggaacct gaagatgttg gagtgtatta ctgtcaaaat 1560

ggtcacggct ttcctcggac gttcggtgga ggcaccaagc tggaaatcaa agaacaaaaa 1620

ctcatctcag aagaggatct gtaa 1644

<210> 22

<211> 801

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多核苷酸

<400> 22

atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60

gaccaggtgc agctggtgga gtctggggga ggcgtggtcc agcctgggag gtccctgaga 120

ctcgactgta aagcgtctgg aatcaccttc agtaactctg gcatgcactg ggtccgccag 180

gctccaggca aggggctgga gtgggtggca gttatttggt atgatggaag taaaagatac 240

tatgcagact ccgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaattccaa gaacacgctg 300

tttctgcaaa tgaacagcct gagagccgag gacacggctg tgtattactg tgcgacaaac 360

gacgactact ggggccaggg aaccctggtc accgtctcct caggtggagg tggatcaggt 420

ggaggtggat ctggtggagg tggatctgaa attgtgttga cacagtctcc agccaccctg 480

tctttgtctc caggggaaag agccaccctc tcctgcaggg ccagtcagag tgttagtagt 540

tacttagcct ggtaccaaca gaaacctggc caggctccca ggctcctcat ctatgatgca 600

tccaacaggg ccactggcat cccagccagg ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc 660

actctcacca tcagcagcct agagcctgaa gattttgcag tttattactg tcagcagagt 720

agcaactggc ctcggacgtt cggccaaggg accaaggtgg aaatcaaaga acaaaaactc 780

atctcagaag aggatctgta a 801

<210> 23

<211> 2332

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多核苷酸

<400> 23

atggctctcc cagtgactgc cctactgctt cccctagcgc ttctcctgca tgcagaggtg 60

aagctgcagc agtctggggc tgagctggtg aggcctgggt cctcagtgaa gatttcctgc 120

aaggcttctg gctatgcatt cagtagctac tggatgaact gggtgaagca gaggcctgga 180

cagggtctag agtggattgg acagatttat cctggagatg gtgatactaa ctacaatgga 240

aagttcaagg gtcaagccac actgactgca gacaaatcct ccagcacagc ctacatgcag 300

ctcagcggcc taacatctga ggactctgcg gtctatttct gtgcaagaaa gaccattagt 360

tcggtagtag atttctactt tgactactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 420

ggtggaggtg gatcaggtgg aggtggatct ggtggaggtg gatctgacat cgagctcacc 480

cagtctccaa aattcatgtc cacatcagta ggagacaggg tcagcgtcac ctgcaaggcc 540

agtcagaatg tgggtactaa tgtagcctgg tatcaacaga aaccaggaca atctcctaaa 600

ccactgattt actcggcaac ctaccggaac agtggagtcc ctgatcgctt cacaggcagt 660

ggatctggga cagattccac tctcaccatc actaacgtgc agtctaaaga cttggcagac 720

tatttctgtc aacaatataa caggtatccg tacacgtccg gaggggggac caagctggag 780

atcaaacggg cggccgcaat tgaagttatg tatcctcctc cttacctaga caatgagaag 840

agcaatggaa ccattatcca tgtgaaaggg aaacaccttt gtcccaagtc ccctatttcc 900

cggaccttct aagccctttg ggtgctggtg gtggttggtg gagtcctggc ttgctatagc 960

cgctagtaac agtggccttt attattttct gggtgaggag taagaggagc aggctcctgc 1020

acagtgacta catgaacatg actccccgcc gccccgggcc cacccgcaag cattaccagc 1080

cctatgcccc accacgcgac ttcgcagcct atcgctccag agtgaagttc agcaggagcg 1140

cagagccccc cgcgtaccag cagggccaga accagctcta taacgagctc aatctaggac 1200

gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag atggggggaa 1260

agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg 1320

cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg 1380

gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg 1440

ccctgccccc tcgcggatct ggagcaacaa acttctcact actcaaacaa gcaggtgacg 1500

tggaggagaa tcccggaccc atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct 1560

gggttccagg ttccactggt gaccaggtgc agctggtgga gtctggggga ggcgtggtcc 1620

agcctgggag gtccctgaga ctcgactgta aagcgtctgg aatcaccttc agtaactctg 1680

gcatgcactg ggtccgccag gctccaggca aggggctgga gtgggtggca gttatttggt 1740

atgatggaag taaaagatac tatgcagact ccgtgaaggg ccgattcacc atctccagag 1800

acaattccaa gaacacgctg tttctgcaaa tgaacagcct gagagccgag gacacggctg 1860

tgtattactg tgcgacaaac gacgactact ggggccaggg aaccctggtc accgtctcct 1920

caggtggagg tggatcaggt ggaggtggat ctggtggagg tggatctgaa attgtgttga 1980

cacagtctcc agccaccctg tctttgtctc caggggaaag agccaccctc tcctgcaggg 2040

ccagtcagag tgttagtagt tacttagcct ggtaccaaca gaaacctggc caggctccca 2100

ggctcctcat ctatgatgca tccaacaggg ccactggcat cccagccagg ttcagtggca 2160

gtgggtctgg gacagacttc actctcacca tcagcagcct agagcctgaa gattttgcag 2220

tttattactg tcagcagagt agcaactggc ctcggacgtt cggccaaggg accaaggtgg 2280

aaatcaaaga acaaaaactc atctcagaag aggatctgta actcgaggat cc 2332

<210> 24

<211> 1640

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多核苷酸

<400> 24

catggctctc ccagtgactg ccctactgct tcccctagcg cttctcctgc atgcagaggt 60

gaagctgcag gagtcagggg gaggcttcgt gaagcctgga gggtccctca aagtctcctg 120

tgcagcctct ggattcactt tcagtagcta tgccatgtcc tgggttcgcc tgagtccgga 180

gatgaggctg gagtgggtcg caaccattag cagtgctggt ggttacatct tctattctga 240

cagtgtgcag ggacgattca ccatttccag agacaatgcc aagaacaccc tgcacctgca 300

aatgggcagt ctgaggtctg gggacacggc catgtattac tgtgcaaggc agggatttgg 360

taactacggt gattactatg ctatggacta ctggggccaa gggaccacgg tcaccgtctc 420

ctcaggtgga ggtggatcag gtggaggtgg atctggtgga ggtggatctg acattgagct 480

cacccagtct ccatcctccc tggctgtgtc agcaggagag aaggtcacta tgagctgcaa 540

atccagtcag agtctgctca acagtagaac ccgaaagaac cagttggctt ggtaccagca 600

aaaaccagga cagtctcctg aactgctgat ctactgggca tccactaggc aatctggagt 660

ccctgatcgc ttcacaggca gtggatctgg gacagatttc actctcacca tcagcagtgt 720

gcaggctgaa gacctggcag tttattactg ccagcaatct tataatctac tgcaacaaac 780

ttctcactac tcaaacaagc aggtgacgtg gaggagaatc ccggacccat ggagacagac 840

acactcctgc tatgggtact gctgctctgg gttccaggtt ccactggtga ccaggtgcag 900

ctggtggagt ctgggggagg cgtggtccag cctgggaggt ccctgagact cgactgtaaa 960

gcgtctggaa tcaccttcag taactctggc atgcactggg tccgccaggc tccaggcaag 1020

gggctggagt gggtggcagt tatttggtat gatggaagta aaagatacta tgcagactcc 1080

gtgaagggcc gattcaccat ctccagagac aattccaaga acacgctgtt tctgcaaatg 1140

aacagcctga gagccgagga cacggctgtg tattactgtg cgacaaacga cgactactgg 1200

ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca ggtggaggtg gatcaggtgg aggtggatct 1260

ggtggaggtg gatctgaaat tgtgttgaca cagtctccag ccaccctgtc tttgtctcca 1320

ggggaaagag ccaccctctc ctgcagggcc agtcagagtg ttagtagtta cttagcctgg 1380

taccaacaga aacctggcca ggctcccagg ctcctcatct atgatgcatc caacagggcc 1440

actggcatcc cagccaggtt cagtggcagt gggtctggga cagacttcac tctcaccatc 1500

agcagcctag agcctgaaga ttttgcagtt tattactgtc agcagagtag caactggcct 1560

cggacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaagaac aaaaactcat ctcagaagag 1620

gatctgtaac tcgaggatcc 1640

<210> 25

<211> 1266

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多核苷酸

<400> 25

atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60

gacatgggat tgggactgca gtgggttttc tttgttgctc ttttaaaagg tgtccactgt 120

gaggtgcggc ttctggagtc tggtggagga ttagtgaagc ctgaggggtc actgaaactc 180

tcctgtgtgg cctctggatt caccttcagt gactatttca tgagctgggt ccgccaggct 240

ccagggaagg ggctggagtg ggttgctcac atatacacga aaagttataa ttatgcaact 300

tattactcgg gttcggtgaa aggcagattc accatctcca gagatgattc ccgaagcatg 360

gtctacctgc aaatgaacaa cctgagaact gaggacacgg ccacttatta ctgtacaaga 420

gatggaagcg gatatccctc tctggatttc tggggtcaag ggacccaagt cactgtctcc 480

tcagccacaa caacagcccc atctgtctat cccttggccc ctgcctgtga cagcacaacc 540

aaatcgggtg gaggtggatc aggtggaggt ggatctggtg gaggtggatc ttatgagctg 600

actcagccac cttcagcatc agtcaatgta ggagagactg tcaaaatcac ctgctctggg 660

gaccaattgc cgaaatattt tgcagattgg tttcatcaaa ggtcagacca gaccattttg 720

caagtgatat atgatgataa taagcgcccc tcggggatcc ctgaaagaat ctctgggtcc 780

agctcaggga caacagccac cttgaccatc agagatgtcc gggctgagga tgaaggtgac 840

tattactgtt tctcaggata tgttgatagt gatagcaaat tgtatgtttt tggcagcgga 900

acccagctca ccgtcctagg tggacccaag tcttctccca aagtcacagt gtttccacct 960

tcacctgagg agctccggac aaacaaagcc acactggtgt gtctggttaa tgacttctac 1020

ccgggttctg caacagtgac ctggaaggca aatggagcaa ctatcaatga tggggtgaag 1080

actacaaagc cttccaaaca gggccaaaac tacatgacca gcagctacct aagtttgaca 1140

gcagaccagt ggaaatctca caacagggtt tcctgccaag ttacccatga aggggaaact 1200

gtggagaaga gtttgtcccc tgcagaatgt ctcgaacaaa aactcatctc agaagaggat 1260

ctgtaa 1266

<210> 26

<211> 3325

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多核苷酸

<400> 26

catggctctc ccagtgactc ccctactgct acccctagcg ttctcctgca tgcagaggtg 60

aagctgcagc agtctggggc tgagctggtg aggcctgggt cctcagtgaa gatttcctgc 120

aaggcttctg gctatgcatt cagtagctac tggatgaact gggtgaagca gaggcctgga 180

cagggtcttg agtggattgg acagatttat cctggagatg gtgatactaa ctacaatgga 240

aagttcaagg gtcaagccac actgactgca gacaaatcct ccagcacagc ctacatgcag 300

ctcagcggcc taacatctga ggactctgcg gtctatttct gtgcaagaaa gaccattagt 360

tcggtagtag atttctactt tgactactgc ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 420

ggtggaggtg ggcaggggag gtggatctgg ggaggtggat ctgacattga gctcacccag 480

tctccaaaat tcatgtccac atcagtagga cacagggtca gcgtcacctg caaggccagt 540

cagaatgtgg gtactaatgt agcctggtat caacagaaac caggacaatc tcctaaacca 600

ctgatttact cggcaaccta ccggaacagt ggagtccctg agcgcttcac aggcagtgga 660

tctgggacag atttcactct caccatcact aacgtgcagt ctaaagactt ggcagactat 720

ttctgtcaac aatataacag gtagccgtac acgtccggag gggggaccaa gctggagatc 780

aaacgggcgg ccgcaattga gttcatgtac cctccgcctt acctagacaa cgagaggagc 840

aatggaacta ttattcacat aaaagagaaa catctttgtc atactcagtc atctcctaag 900

ctgttttggg cactggtcgt ggttgtggag tcctgttttg ttatggcttg ctagtgacag 960

tggctcttgt gttatctgga caaatagtag aaggaacaga ctccttcaaa gtgactacat 1020

gaacatgact ccccggaggg cagggctcac tcgaaagcct taccagccct acgcccctgc 1080

cagagacttt gcagcgtacc gccccagagc aaaattcagc aggagtgcag agactgctgc 1140

caacctgcag gaccccaacc agctctacaa tgagctcaat ctagggcgaa gagaggaata 1200

tgacgtcttg gagaagaagc cggctcggga tccagagatg gcagccaaac agcagaggag 1260

caggaacccc caggaaggcg tatacaatgc actgcagaaa gacaagatgg cagaagccta 1320

cagtgagatc ggcacaaaag gcgagaggcg gagaggcaag gggcacgatg gcctttacca 1380

gggtctcagc actgccacca aggacaccta tgatgggctg catatgcaga ccctggcccc 1440

tcgctaacag ccactcgagg atccgcccct ctccctcccc cccccctaac gttactggcc 1500

gaagccgctt ggaataaggc cggtgtgcgt ttgactatat gttattttcc accatattgc 1560

cgtcttttgg caatgtgagg gcccggaaac ctggccctgt cttcttgacg agcattccta 1620

ggggtctttc ccctctcgcc aaaggaatgc agggtctgtt gaatgtcgtg aaggaagcag 1680

ttcctctgga agcttcttga agacaaacaa cgtctgtagc gaccctttgc aggcagcgga 1740

accccccacc tggcgacagg tgcctcagcg accaaaggcc acgtgtataa gatacaccag 1800

caaaggcggc acaaccccag tgccacgttg tgagttggat agttgtggaa agagtcaaat 1860

ggctctcctc aagcgtattc aacaaggggc tgaaggatgc ccagaaggta ccccattgta 1920

tgggatctga tctggggcct cggtcacatg ctttacatgt gtttagtcga ggttaaaaaa 1980

acgtctaggc cccccgaacc acggggacgt ggttttcctt tgaaaaacac gatgataata 2040

tggccacaaa ctgccatgga gacagacaca ctcctgctaa gggtactgct gctctgggtt 2100

ccaggttcca ctggagacat gggattggga ctgcagaggg ttttctttgt tgctctttta 2160

aaaggtgtcc actgtgaggt gcggcttctg gagtctggtg gaggattagt gaagcctgag 2220

gggtcactga aatctcctgt gtggcctcag gattcacctt cagagactat ttcatgagct 2280

gggtccgcca ggctccaggg aaggggctgg agtgggttgc tcacatatac acgaaaagtt 2340

ataattatgc aacttattac tcgggttcgg tgaaaggcag attcaccatc tccagagatg 2400

attcccgaag catggtctac cgcaaatgaa caacctgaga actgaggaca cggccactta 2460

ttactgtaca agagatggaa gcggatatcc ctctctggat ttctggggtc aagggaccca 2520

agtcactgtc tcctcagcca caacaacagc cccatctgtc tatcccttgg cccctgcctg 2580

tgacagcaca accaaatcgg gtggaggtgg atcaggtgga ggtggatctg gtggaggtgg 2640

atcttatgag ctgactcagc caccttcagc atcagtcaat gtaggagaga ctgtcaaaat 2700

cacctgctct ggggaccaat tgccgaaata ttttgcagat tggtttcatc aaaggtcaga 2760

ccagaccatt ttgcaagtga tatatgatga taataagcgc ccctcgggga tccctgaaag 2820

aatctctggg tccagctcag ggacaacagc caccttgacc atcagagatg tccgggctga 2880

ggatgaaggt gactattact gtttctcagg atatgttgat agtgatagca aattgtatgt 2940

ttttggcagc ggaacccagc tcaccgtcct aggtggaccc aagtcttctc ccaaagtcac 3000

agtgtttcca ccttcacctg aggagctccg gacaaacaaa gccacactgg tgtgtctggt 3060

taatgacttc tacccgggtt ctgcaacagt gacctggaag gcaaatggag caactatcaa 3120

tgatggggtg aagactacaa agccttccaa acagggccaa aactacatga ccagcagcta 3180

cctaagtttg acagcagacc agtggaaatc tcacaacagg gtttcctgcc aagttaccca 3240

tgaaggggaa actgtggaga agagtttgtc ccctgcagaa tgtctcgaac aaaaactcat 3300

ctcagaagag gatctgtaac tggag 3325

<210> 27

<211> 3333

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多核苷酸

<400> 27

ctctcccagt gactgcccta ctgcttcccc tagcgctact cctgcatgca gaggtgaagc 60

tgcaggagtc agggggaggc ttcgtgaagc ctggagggtc cctcaaagtc tcctgtgcag 120

cctctggatt cactttcagt agctatgcca tgtcctgggt tcgcctgagt ccggagatga 180

ggctggagtg ggtcgcaacc attagcagtg ctggtggtta catcttctat tctgacagtg 240

tgcagggacg attcaccatt tccagagaca atgccaagaa caccctgcac ctgcaaatgg 300

gcagtctgag gtctggggac agggccatgt attactgtgc aaggcaggga tttggtaact 360

acggtgatta ctatgctatg gactactggg gccaagggac cacggtcacc gtctcctcag 420

gtggaggtgg atcaggtgga ggtggatctg gtggaggtgg atctgacatt gagctcaccc 480

agtctccatc ctccctggct gtgtcagcag gagagaaggt cactatgagc tgcaaatcca 540

gtcagagtct gctcaacagt agaacccgaa agaaccagtt ggcttggtac cagcaaaaac 600

caggacagtc tcctgaactg ctgatctact gggcatccac taggcaatct ggagtccctg 660

atcgcttcac aggcagtgga tctgggacag atttcactct caccatcagc agtgtgcagg 720

ctgaagacct ggcagtttat tactgccagc aatcttataa tctactggga ccaagctgga 780

gatcaaacgg gcggccgcaa ttgagttcat gtaccctccg ccttacctag acaacgagag 840

gagcaatgga actattattc acataaaaga gaaacatctt tgtcatactc agtcatctcc 900

taagctgttt tgggcactgg tcgtggttgc tggagtccag ttttgttatg gcttgctagt 960

gacagtggct ctttgtgtta tctggacaaa tagtagaagg aacagactcc ttcaaagtga 1020

ctacatgaac atgactcccc ggaggcctgg gctcactcga aagccttacc agccctacgc 1080

ccctgccaga gactttgcag cgtaccggcc cagagcaaaa ttcagcagga gtgcagagac 1140

tgctgccaac ctgcaggacc ccaaccagct ctacaatgag ctcaatctag ggcgaagaga 1200

ggaatatgac gtcttggaga agaagcggcc tcgggatcca gagatgggag gcaaacagca 1260

gaggaggagc aacccccagg aaggcgtata caatgcactg cagaaagaca agatggcaga 1320

agcctacagt gagatcggca caaaaggcga gaggcggaga ggcaaggggc acgatggcct 1380

ttaccagggt ctcagcactg ccaccaagga cacctatgat gccctgcata tgcagaccct 1440

ggcccctcgc taacagccac tcgaggatcc gcccctctcc ctcccccccc cctaacgtta 1500

ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca 1560

tattgccgtc ttttggcaat gtgagggccc ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca 1620

ttcctagggg tctttcccct ctcgccaaag gaatgcaggg tctgttgaat gtcgtgaagg 1680

aagcagttcc tctggaagct tcttgaagac aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc 1740

agcggaaccc cccacctggc gacaggtgcc tctgcgacca aaggccacgt gtataagata 1800

cacctgcaaa ggcggcacaa ccccagtgcc acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag 1860

tcaaatggct ctcctcaagc gtattcaaca aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc 1920

attgtatggg atctgatctg gggcctcggt cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt 1980

aaaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgatg 2040

ataatatggc cacaaactgc catggagaca gacacactcc tgctatgggt actgctgctc 2100

tgggttccag gttccactgg tgacatggga ttgggactgc agtgggtttt ctttgttgct 2160

cttttaaaag gtgtccactg tgaggtgcgg cttctggagt ctggtggagg attagtgaag 2220

cctgaggggt cactgaaact ctcctgtgtg gcctctggat tcaccttcag tgactatttc 2280

atgagctggg tccgccaggc tccagggaag gggctggagt gggttgctca catatacacg 2340

aaaagttata attatgcaac ttattactcg ggttcggtga aaggcagatt caccatctcc 2400

agagatgatt cccgaagcat ggtctacctg caaatgaaca acctgagaac tgaggacacg 2460

gccacttatt actgtacaag agatggaagc ggatatccct ctctggattt ctggggtcaa 2520

gggacccaag tcactgtctc ctcagccaca acaacagccc catctgtcta tcccttggcc 2580

cctgcctgtg acagcacaac caaatcgggt ggaggtggat caggtggagg tggatctggt 2640

ggaggtggat cttatgagct gactcagcca ccttcagcat cagtcaatgt aggagagact 2700

gtcaaaatca cctgctctgg ggaccaattg ccgaaatatt ttgcagattg gtttcatcaa 2760

aggtcagacc agaccatttt gcaagtgata tatgatgata ataagcgccc ctcggggatc 2820

cctgaaagaa tctctgggtc cagctcaggg acaacagcca ccttgaccat cagagatgtc 2880

cgggctgagg atgaaggtga ctattactgt ttctcaggat atgttgatag tgatagcaaa 2940

ttgtatgttt ttggcagcgg aacccagctc accgtcctag gtggacccaa gtcttctccc 3000

aaagtcacag tgtttccacc ttcacctgag gagctccgga caaacaaagc cacactggtg 3060

tgtctggtta atgacttcta cccgggttct gcaacagtga cctggaaggc aaatggagca 3120

actatcaatg atggcgtgaa gactacaaag ccttccaaac agggccaaaa ctacatgacc 3180

agcagctacc taagtttgac agcagaccag tggaaatctc acaacagggt ttcctgccaa 3240

gttacccatg aaggggaaac tgtggagaag agtttgtccc ctgcagaatg tctcgaacaa 3300

aaactcatct cagaagagga tctgtaactc gag 3333

<210> 28

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成引物

<400> 28

tgaggagacg gtgaccgtgg tcccttggcc ccag 34

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成引物

<400> 29

aggtsmarct gcagsagtcw gg 22

<210> 30

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成引物

<400> 30

gttagatctc cagcttggtc cc 22

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成引物

<400> 31

gacattcagc tgacccagtc tcca 24

<210> 32

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成引物

<400> 32

ggctgcagst tcagtggcag tggrtcwggr ac 32

<210> 33

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成引物

<400> 33

ctcattcctg ttgaagctct tgacaatggg 30

<210> 34

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成引物

<400> 34

atatccatgg cagacgtcca gatgatccag tctcca 36

<210> 35

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成引物

<400> 35

atatccatgg cagacattgt gctgactcag tctcc 35

<210> 36

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成引物

<400> 36

atatccatgg cagatgttgt gatgacccaa actcca 36

<210> 37

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成引物

<400> 37

atatccatgg cacaaattgt tctcacccag tctcc 35

<210> 38

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成引物

<400> 38

atatccatgg cagacattgt gatgacacag tctcca 36

<210> 39

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成引物

<400> 39

atatccatgg cagatattgt gatgacgcag gctgca 36

<210> 40

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成引物

<400> 40

atatccatgg cagacattgt gatgacccag tctc 34

<210> 41

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成引物

<400> 41

gcttcaacag gaatgagtgt taactcgagg tag 33

<210> 42

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成引物

<400> 42

ccatggagac agacacactc ctgctatggg tactgctgct ctgggttcca ggttccactg 60

gtgacgaggt gctgcagctg gtggagtccg ggg 93

<210> 43

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成引物

<400> 43

agatccacct ccaccagatc cacctccacc tgatccacct ccacctgagg agacggtgac 60

tgaggttcct tgacc 75

<210> 44

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成引物

<400> 44

ggtggaggtg gatcaggtgg aggtggatct ggtggaggtg gatctgacat tgtgatgact 60

cagtctccag ccacc 75

<210> 45

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成引物

<400> 45

ctcgagttac agatcctctt ctgagatgag tttttgttgt ttgatttcca gcttggtgcc 60

tccaccgaac g 71

<210> 46

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成引物

<400> 46

tataccatgg ccttaccagt gaccgccttg ctcctgccgc tggccttgct gctccacgcc 60

gccaggccgg aggtgcagct ggtggagtcc ggg 93

<210> 47

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成引物

<400> 47

cacgtgccat ggatgaggat atttgctgtc tttatat 37

<210> 48

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成引物

<400> 48

ctcgagttac gtctcctcca aatgtgtatc acttt 35

<210> 49

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成引物

<400> 49

tattacacgt gttacatgag gatatttgct gtcttt 36

<210> 50

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成引物

<400> 50

tataggatcc tcgaggatgt tacgtctcct ccaaatgtgt a 41

<210> 51

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 51

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 52

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成肽

<400> 52

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 53

<211> 271

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 53

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe

35 40 45

Thr Phe Ser Gly Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys

50 55 60

Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr

65 70 75 80

Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala

85 90 95

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Ile Asp Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Leu Ala Gly Asn Ala Met Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln

145 150 155 160

Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly Asp Arg Val Ser Leu Ser

165 170 175

Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln

180 185 190

Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Phe Ala Ser Gln Ser

195 200 205

Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp

210 215 220

Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro Glu Asp Val Gly Val Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Gln Asn Gly His Gly Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr

245 250 255

Lys Leu Glu Ile Lys Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

260 265 270

<210> 54

<211> 271

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 54

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu

20 25 30

Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe

35 40 45

Thr Phe Ser Gly Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys

50 55 60

Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr

65 70 75 80

Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala

85 90 95

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Ile Asp Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Leu Ala Gly Asn Ala Met Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln

145 150 155 160

Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly Asp Arg Val Ser Leu Ser

165 170 175

Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln

180 185 190

Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Phe Ala Ser Gln Ser

195 200 205

Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp

210 215 220

Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro Glu Asp Val Gly Val Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Gln Asn Gly His Gly Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr

245 250 255

Lys Leu Glu Ile Lys Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

260 265 270

<210> 55

<211> 266

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 55

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val

20 25 30

Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile

35 40 45

Thr Phe Ser Asn Ser Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr

65 70 75 80

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser

85 90 95

Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

115 120 125

Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu

145 150 155 160

Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln

165 170 175

Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala

180 185 190

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro

195 200 205

Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

210 215 220

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser

225 230 235 240

Ser Asn Trp Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

245 250 255

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

260 265

<210> 56

<211> 422

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列的说明：合成多肽

<400> 56

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Met Gly Leu Gly Leu Gln Trp Val Phe Phe Val

20 25 30

Ala Leu Leu Lys Gly Val His Cys Glu Val Arg Leu Leu Glu Ser Gly

35 40 45

Gly Gly Leu Val Lys Pro Glu Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala

50 55 60

Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Phe Met Ser Trp Val Arg Gln Ala

65 70 75 80

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala His Ile Tyr Thr Lys Ser Tyr

85 90 95

Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ser Gly Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile

100 105 110

Ser Arg Asp Asp Ser Arg Ser Met Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu

115 120 125

Arg Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Thr Arg Asp Gly Ser Gly

130 135 140

Tyr Pro Ser Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Ser Ala Thr Thr Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Ala

165 170 175

Cys Asp Ser Thr Thr Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

180 185 190

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser

195 200 205

Val Asn Val Gly Glu Thr Val Lys Ile Thr Cys Ser Gly Asp Gln Leu

210 215 220

Pro Lys Tyr Phe Ala Asp Trp Phe His Gln Arg Ser Asp Gln Thr Ile

225 230 235 240

Leu Gln Val Ile Tyr Asp Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu

245 250 255

Arg Ile Ser Gly Ser Ser Ser Gly Thr Thr Ala Thr Leu Thr Ile Arg

260 265 270

Asp Val Arg Ala Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Phe Ser Gly Tyr

275 280 285

Val Asp Ser Asp Ser Lys Leu Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Gln Leu

290 295 300

Thr Val Leu Gly Gly Pro Lys Ser Ser Pro Lys Val Thr Val Phe Pro

305 310 315 320

Pro Ser Pro Glu Glu Leu Arg Thr Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu

325 330 335

Val Asn Asp Phe Tyr Pro Gly Ser Ala Thr Val Thr Trp Lys Ala Asn

340 345 350

Gly Ala Thr Ile Asn Asp Gly Val Lys Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln

355 360 365

Gly Gln Asn Tyr Met Thr Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Ala Asp Gln

370 375 380

Trp Lys Ser His Asn Arg Val Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Glu

385 390 395 400

Thr Val Glu Lys Ser Leu Ser Pro Ala Glu Cys Leu Glu Gln Lys Leu

405 410 415

Ile Ser Glu Glu Asp Leu

420