一种来自丝状真菌粗糙脉胞菌的新型诱导型启动子及其应用
阅读说明：本技术 一种来自丝状真菌粗糙脉胞菌的新型诱导型启动子及其应用 (Novel inducible promoter from filamentous fungus neurospora crassa and application thereof ) 是由 刘晓光 张会霞 路福平 于 2020-05-19 设计创作，主要内容包括：本发明针对目前工业上甾体生物转化羟化反应投料量偏低的问题,提供一种诱导型启动子,其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。该启动子能够用于构建粗糙脉孢工程菌,为构建高效催化甾体化合物羟化反应的基因工程菌株奠定坚实的基础,对于提高甾体化合物的生物转化效率具有重要的意义。(Aiming at the problem of low feeding amount of steroid biotransformation hydroxylation reaction in the current industry, the invention provides an inducible promoter, the nucleotide sequence of which is shown as SEQ ID NO: 1 is shown. The promoter can be used for constructing rough vein spore engineering bacteria, lays a solid foundation for constructing a genetic engineering strain for efficiently catalyzing hydroxylation reaction of steroid compounds, and has important significance for improving biotransformation efficiency of steroid compounds.)
本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种新颖的运用于构建粗糙脉孢工程菌启动子。
背景技术
甾体激素类药物是目前仅次于抗生素的第二大类药物，在临床上具有极其重要的医药价值，在维持生命、调节生理功能、免疫功能、机体生长、皮肤病治疗及生育控制等方面具有良好的作用。化学合成在甾体化合物的研究和生产过程中仍具有举足轻重的地位，而在甾体激素药物的生产中，微生物转化技术已成为许多甾体化合物或其中间体合成路线中不可缺少的关键技术。大量事实表明，甾体化合物工业是将化学合成技术和生物技术相结合应用于工业生产的一个典范。
微生物对甾体化合物的转化反应多种多样，比较典型的微生物转化反应主要有羟基化、脱氢、边链降解等。其中，甾体化合物生物催化羟基化尤为重要。目前，甾体化合物的生物催化羟基化因其高效性，已广泛应用到抗炎药、免疫抑制剂、促孕剂、利尿剂、同化剂以及避孕药的生产中。
细菌和真菌都可以催化甾体的羟基化反应，但目前成功应用于工业生产的大多为丝状真菌如曲霉和青霉等。在甾体化合物生物催化过程中，菌体自身的催化活性直接影响产物的转化效率。随着分子生物学的发展，构建具有高转化能力的基因工程菌株以提高甾体转化效率成为近年来的研究热点。丝状真菌中催化羟基化反应的羟基化酶属于P450酶系，但目前对于参与反应的羟化酶研究相对较少，国内外相关羟化酶启动子也未见报道，其表达调控机制更不明确。
采用粗糙脉孢菌催化甾体化合物脱氧可的松醋酸酯的C11β位羟基化反应，合成氢化可的松(如图1)。与化学合成方法相比，其反应条件较温和，具有较高的区域选择性，立体选择性和化学选择性，易于纯化，且转化率高，生产成本低，对环境友好。研究证明，粗糙脉孢菌(FGSC9717)是羟化效果优良的候选菌株。已有的研究证实丝状真菌的甾体C11β-羟化酶在转录水平上受甾体底物诱导，但有关羟化酶的诱导机制及其相关基因尚未见文献报道。
因此，对于来源于P450羟化酶基因启动子的研究，将为阐述羟化酶的生物催化反应分子机制奠定良好基础，同时也为构建下一代高效工程菌提供了关键的基因资源，对于甾体药物生物催化羟基化的高效生产具有重要的意义。
发明内容
：本发明的目的是针对目前工业上甾体生物转化羟化反应转化效率偏低的问题，为构建粗糙脉孢工程菌提供一种诱导型启动子Pshn，该启动子能够诱导P450羟化酶基因CYP5311B2(简称为CYP-7)的表达，为构建高效催化甾体化合物羟化反应的基因工程菌株奠定坚实的基础，对于提高甾体化合物的生物转化效率具有重要的意义。
本发明所述粗糙脉孢菌启动子Pshn来源于粗糙脉孢菌FGSC9717，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明所述粗糙脉孢菌启动子Pshn也可以是能与SEQ ID NO：1所示序列杂交并且具有启动子功能的核苷酸序列。
含有本发明所述粗糙脉孢菌启动子Pshn的表达盒、表达载体、重组载体或宿主细胞也属于本发明的保护范围。
基因扩增含有本发明所述粗糙脉孢菌启动子Pshn DNA全长或部分片段的引物序列也属于本发明的保护范围。
本发明所述粗糙脉孢菌启动子Pshn，可用于甾体化合物羟化酶基因的诱导表达。
本发明所述粗糙脉孢菌启动子Pshn，可用于丝状真菌粗糙脉孢菌中甾体化合物羟化酶基因的诱导表达。
本发明所述的粗糙脉孢菌启动子Pshn，可用于包括但不限于甾体11β-羟化酶、15α-羟化酶、11α-羟化酶、16α-羟化酶、7α-羟化酶、14α-羟化酶或9α-羟化酶基因的诱导表达。所述基因表达的羟化酶可以催化包括但不限于甾体化合物C11β、C15α、C11α、C16α、C7α、C14α或C9α的羟基化反应。
本发明所述的诱导型启动子Pshn，可用于构建诱导表达羟化酶的基因工程重组菌。所述基因工程重组菌可以是丝状真菌。
附图说明
：图1：脱氧可的松醋酸酯的11β羟基化生物催化反应。
图2：启动子Pshn产物验证电泳图；M：Marker；Pshn：启动子Pshn。
图3A：Pshn启动子表达载体pMF272-Pshn-CYP-7的构建示意图。
图3B：重组表达载体pMF272-Pshn-CYP-7酶切验证；M：10kb DNA ladder；1：酶切产物。
图4：Pshn启动子表达载体pMF272-Pshn-CYP-7通过限制性内切酶处理进行线性化；M：10kb DNA ladder；1：质粒线性化产物。
图5：11β-羟化酶CYP-7基因表达盒定点整合和基因重组菌验证；M：10kb DNAladder；1、2、3：Pshn-CYP-7杂核重组菌株转化子。M：10kb DNA ladder，w：粗糙脉孢菌野生型
图6：重组菌株与19018杂交后，11β-羟化酶CYP-7基因表达盒定点整合和基因重组菌验证；M：10kb DNA ladder，w：粗糙脉孢菌野生型，1、2：Pshn-CYP-7纯核重组表达菌株。
图7：粗糙脉孢菌重组菌与蓝色犁头霉菌株的甾体底物投料量的比较。
图8：粗糙脉孢菌重组菌发酵过程中对甾体底物的转化率。
具体实施方式
：
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
涉及菌株：粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)FGSC9717真菌遗传保藏中心，粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)19018，蓝色犁头霉(Absidia coerulea)As3.65，天津科技大学微生物菌种保藏中心。
所用的酶及试剂：
限制性内切酶EcoRI、NotI、XbaI、BamHI、Solution I连接试剂盒及Pyrobest DNA聚合酶购买自Takara公司。甲醇、乙腈、乙酸乙酯、石油醚及二氯甲烷购买自天津化学试剂六厂。其他常规试剂为进口分装或国产分析纯。引物的合成及序列的测定由北京华大公司完成。
所用培养基：
10×Vogel’s：称取二水合柠檬酸钠26g，硝酸钾25.2g，磷酸二氢氨28.8g，磷酸二氢钾16g，七水合硫酸镁2g，二水合氯化钙1g，用800mL双蒸馏水溶解，加微量元素盐溶液1mL，生物素500uL，氯仿少量，补加水至1L，滴加少量氯仿，4℃保存。
10×Fig’s母液：称取L-山梨糖20g，D-果糖0.5g，D-葡萄糖0.5g，加双蒸馏水并定容到100mL，115℃灭菌20min，4℃冰箱保存。
20×BDES溶液：称取L-山梨糖20g，蔗糖1g，D-果糖1g，溶于双蒸馏水80ml，并加水定容至100mL，115℃灭菌20min，4℃冰箱保存备用。
YPD培养基(g/L)：蛋白胨20，酵母粉10，葡萄糖20，115℃灭菌20min。
MM基本培养基(组氨酸营养缺陷型筛选培养基)：10×Vogel’s缓冲液10mL，蔗糖2g，双蒸馏水定容到100mL，115℃灭菌20min。
MM斜面培养基：10×Vogel’s缓冲液10mL，蔗糖2g，琼脂粉1.5g，加双蒸馏水定容至100mL，115℃灭菌20min。
TopAgar固体培养基：10×Vogel’s 10mL，琼脂粉1.0g，双蒸馏水定容至90mL，121℃灭菌20min。微波炉加热溶解，倒板前加入10mL 10×Fig’s母液混匀。
BottomAgar培养基：10×Vogel’s 10mL，琼脂粉1.5g，加双蒸馏水至80mL，121℃灭菌20min，倒板前加入10mL10×Fig’s母液。
BDES固体培养基：10×Vogel’s 10mL，琼脂粉1.8g，加双蒸馏水至80mL，115℃高压灭菌20min，倒板前加入5mL20×BDES母液。
合成杂交培养基(Synthesis crossing，SC)：称取硝酸钾0.5g，磷酸氢二钾0.7g，磷酸二氢钾0.5g，七水合硫酸镁0.5g，无水氯化钙0.1g，氯化钠0.1g，微量元素100uL，生物素100uL，蔗糖2g，加双蒸馏水溶解，继续加水到1L，琼脂粉15g，115℃灭菌20min。
产酶培养基：10×Vogel’s 10mL，葡糖糖0.5g，双蒸馏水定容至100mL，115℃灭菌20min。
LB培养基(g/L)：蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母粉5g，加水溶解并定容至1L，121℃灭菌20min。
实施例1启动子序列的获得
通过转录组测序和酿酒酵母异源表达鉴定一个羟化酶基因cDNA。利用PCR扩增和DNA测序获得该羟化酶基因的基因序列(GenBank：X15033.1)。进一步以粗糙脉孢菌的核基因组为模板，以获得的羟化酶基因的基因序列设计引物，上游：5’-GCCCCCCTCATGTCTAGC-3’，下游：5’-CGGCGCGAAGTAGCGCTG-3’，通过反向PCR(Inverse-PCR)扩增，获得一段长约950bp的产物片段(如图2所示)，将PCR产物连接T载体，设计通用引物进行DNA测序，获得诱导型启动子Pshn的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
实施例2启动子Pshn诱导表达载体的构建
本实施例中所用重组载体为pYES2-CYP-7，表达载体为pMF272-GFP。
构建过程所涉及引物如下：
Pshn-NotI-F：GCGGCCGCCGTAGCACAACGTCGAGC
Pshn-BamHI-R：GGATCCGATGGCTGTTGTCGCTGA
用引物(Pshn-NotI-F/Pshn-BamHI-R)通过PCR扩增得到Pshn，通过酶切/酶联构建重组表达载体pMF272-Pshn-CYP-7。
构建的表达载体如图3A所示，将重组质粒进行酶切分析。载体pMF272大小为8.4kb，其中Pccg1和EGFP片段大小是1.6kb，Pshn+CYP-7的片段是2.5kb。经XbaI单酶切后，琼脂糖凝胶电泳结果(图3B)显示约7.7kb和1.5kb的片段，证实表达载体构建成功，命名为pMF272-Pshn-CYP-7。
pfoI酶切处理表达质粒，将粗糙脉孢菌甾体11β-羟化酶的表达载体pMF272-Pshn-CYP-7进行线性化，如图4所示。
实施例3粗糙脉孢菌的电转化与培养
将制备好的表达载体(pMF272-Pshn-CYP-7)线性化片段通过电击转化的方法将目标基因整合到粗糙脉孢菌基因组his3位点上，将组氨酸营养缺陷型初步筛选得到转化子接种于MM基本培养基，28℃培养7～8天后，收集孢子备用。
在组氨酸缺陷型筛选基础上，还需通过菌落PCR的方法验证目标片段是否成功转化至粗糙脉孢菌基因组上。PCR引物为CYP-7-yan-F/R。PCR结果如图5所示。
CYP-7-yan-F：GGCCACAGCTGCAGTCCT
CYP-7-yan-R：AGGACAGGCATGTTTACCC
实施例4粗糙脉孢菌转化子与粗糙脉孢菌19018进行杂交
利用上述得到的粗糙脉孢菌阳性转化子与粗糙脉孢菌19018进行杂交，得到含有11β-羟化酶基因的粗糙脉孢菌纯合子，获得诱导型Pshn重组菌株。重组菌株目标基因验证并以粗糙脉孢菌出发菌(野生型)作为对照见图6。
具体实验流程为：分别将粗糙脉孢菌转化子和粗糙脉孢菌19018分别接种于MM基本固体斜面培养基中，于28℃培养箱培养7～8至孢子成熟，使用1mol/mL山梨醇收集孢子。将粗糙脉孢菌转化子孢子悬液分别接种于合成杂交培养基粗糙滤纸一侧，于25℃培养5天。再将粗糙脉孢菌19018孢子接种于滤纸的另一端，于25℃培养2～3周至长出黑色的子囊孢子。
实施例5基因工程菌的筛选验证及其对甾体化合物投料量的检测
随机选取子囊孢子生长得到的粗糙脉孢，提取基因组DNA，用引物CYP-7-yan-F/R对基因组DNA进行扩增。并以粗糙脉孢菌出发菌(野生型)基因组作为对照。
为了考察重组粗糙脉孢菌的脱氧可的松醋酸酯11β-羟基化活性。已知蓝色犁头霉的底物投料量为2g/L将诱导型启动子Pshn基因重组粗糙脉孢菌的底物投料量与蓝色犁头霉进行比较。
将粗糙脉孢菌培养好后，首先将甾体底物脱氧可的松醋酸酯通过球磨机研磨后，使其颗粒直径在10～15μm。向甾体底物脱氧可的松醋酸酯加适量甲醇，适当加热使底物溶解，加入重组粗糙脉孢菌发酵液中，摇晃均匀后放入摇床(28℃，转速180r/min)继续培养，适时取样，萃取，测定转化情况，并适时补加甾体底物。
结果如图7所示。在整个取样检测底物转化情况下，底物全部转完时，蓝色犁头霉底物投料量达到2g/L，重组粗糙脉孢菌底物投料量可达5g/L。
实施例6基因工程菌对甾体化合物转化效率的检测
将粗糙脉孢菌培养好后，首先将甾体底物脱氧可的松醋酸酯通过球磨机研磨后，使其颗粒直径在10～15μm。向甾体底物脱氧可的松醋酸酯加适量甲醇，适当加热使底物溶解，加入重组粗糙脉孢菌发酵液中，摇晃均匀后放入摇床(28℃，转速180r/min)继续培养，适时取样测定转化率。
结果如图8所示。在整个发酵时间段，重组菌株所表现出的转化率。诱导型启动子Pshn基因重组菌在48h左右转化率达到80％。以上结果表明诱导型启动子Pshn基因重组菌株，催化甾体化合物羟化反应转化率提高约15％，同时转化时间缩短了12h。
虽然上述已公开了本发明较佳的实施方式，但其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的为准。
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