PPARγ通过促进MMP9+肿瘤相关巨噬细胞的末端分化影响肝癌的应用
阅读说明：本技术 PPARγ通过促进MMP9+肿瘤相关巨噬细胞的末端分化影响肝癌的应用 (Application of PPAR gamma in influencing liver cancer by promoting terminal differentiation of MMP9+ tumor-related macrophages ) 是由 周钢桥 杨爱清 卢一鸣 权诚 于 2021-08-23 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物医药领域,特别涉及PPARγ通过促进MMP9+肿瘤相关巨噬细胞的末端分化影响肝癌的应用。本发明研究结果表明：MMP9+TAMs在肝癌组织中比例升高,且与患者的不良预后显著相关；进一步实验结果表明：PPARγ通过诱导MMP9+TAMs的分化促进肝癌的恶化；敲低或敲除PPARγ后THP1细胞诱导成MMP9+TAMs的比例降低,敲低或敲除PPARγ后PBMC细胞诱导成MMP9+TAMs的比例降低；敲低或敲除PPARγ的THP1细胞诱导成TAMs后肝癌细胞的迁移、侵袭及成管能力降低；敲低或敲除PPARγ的PBMC诱导成TAMs后肝癌细胞的迁移、侵袭及成管能力降低。(The invention relates to the field of biological medicines, in particular to application of PPAR gamma in influencing liver cancer by promoting terminal differentiation of MMP9+ tumor-related macrophages. The research result of the invention shows that: MMP9+ TAMs are elevated in proportion in liver cancer tissues and significantly correlated with poor prognosis in patients; further experimental results show that: PPAR γ promotes the progression of liver cancer by inducing the differentiation of MMP9+ TAMs; the proportion of the THP1 cells induced to MMP9+ TAMs is reduced after the PPAR gamma is knocked down or knocked out, and the proportion of the PBMC cells induced to MMP9+ TAMs is reduced after the PPAR gamma is knocked down or knocked out; after the THP1 cells with PPAR gamma knocked down or knocked out are induced to be TAMs, the migration, invasion and tube forming capacity of the liver cancer cells are reduced; after the PBMC knocking down or knocking out PPAR gamma induces TAMs, the migration, invasion and tube forming capability of the liver cancer cells are reduced.)
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别涉及PPARγ通过促进MMP9+肿瘤相关巨噬细胞的末端分化影响肝癌的应用。
背景技术
肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)存在于肿瘤微环境中，是白细胞内滤液的主要成分。TAMs由于其在肿瘤发生、发展和转移中的重要作用，越来越被视为肿瘤微环境中的重要靶点。TAMs可通过多种机制促进肿瘤的进展，包括诱导血管生成、细胞外基质重塑、刺激癌细胞增殖、迁移和侵袭，以及抑制适应性免疫。然而，肿瘤相关巨噬细胞分化的内源性调控机制仍不清楚。
TAMs表达促进乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌和卵巢癌血管生成和组织重塑以及抑制抗肿瘤免疫反应的因子，这些癌症中高水平的TAMs与不良预后相关。在微环境信号的作用下，失活的巨噬细胞(M0)分化为M1(经典激活)样、M2(交替激活)样或其他未知的极化巨噬细胞。现在人们普遍认为，TAMs实际上描述了在肿瘤环境中浸润的巨噬细胞，其表现形式与经典的M1或M2巨噬细胞不同，这取决于肿瘤微环境的细胞因子平衡，这激活了TAMs的致瘤功能，如与肿瘤细胞存活、增殖和分裂相关的功能。鉴于TAMs在肿瘤发展中的重要作用，靶向TAMs功能如细胞募集、存活和极化[6]最近已成为抑制癌症进展的一种新的治疗方法。然而，TAMs的治疗应用仍处于起步阶段，与TAM相关的治疗策略只能提供适度的临床益处。
因此，寻求新的方法来调节TAMs的致瘤功能，有助于进一步探讨靶向TAMs在肿瘤免疫治疗中的临床应用，具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的实验表明：MMP9+TAMs在肝癌组织中比例升高，且与患者的不良预后显著相关。进一步的研究发现：敲低PPARγ后THP1细胞诱导成MMP9+TAMs的比例降低；敲低PPARγ后PBMC细胞诱导成MMP9+TAMs的比例降低；敲低PPARγ的THP1细胞诱导成TAMs后肝癌细胞的迁移、侵袭及成管能力降低；敲低PPARγ的PBMC诱导成TAMs后肝癌细胞的迁移、侵袭及成管能力降低。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了MMP9+TAMs作为靶标或生物标记物在制备预防和/或治疗肝癌的药物中的应用。
本发明还提供了敲低或敲除PPARγ在制备抑制细胞诱导成MMP9+TAMs的制剂或药物中的应用。
本发明还提供了敲低或敲除PPARγ在制备抑制肝癌细胞的迁移、侵袭和/或成管能力的制剂或药物中的应用。
本发明还提供了敲低或敲除PPARγ在制备预防和/或治疗肝癌的药物中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，所述细胞包括THP1细胞或PBMC细胞。
本发明还提供了PPARγ的抑制剂在制备预防和/或治疗肝癌的药物中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，所述PPARγ抑制剂能够敲低或敲除PPARγ，或抑制PPARγ的活性。
本发明还提供了预防和/或治疗肝癌的药物，包括PPARγ的抑制剂以及药物上可接受的辅料。
本发明通过通路富集分析发现MMP9+TAMs影响的分子生物学事件，通过分别在HCC肝组织单细胞细胞和PBMC诱导的巨噬细胞中分选出MMP9+TAMs，与肝癌细胞共培养后进行功能实验，确定MMP9+TAMs在HCC中的功能。最后，分析MMP9+TAMs的分化轨迹和驱动转录因子-PPARγ，探究PPARγ诱导MMP9+TAMs分化过程及具体的分子机制。最终，本发明解析PPARγ通过促进MMP9+TAMs的末端分化促进HCC的进展分子机制，从而为当前肝癌的免疫治疗开发新的治疗靶点和/或生物标记物。
为了生成HCC多细胞生态系统的单细胞图谱，本发明收集并测序了10例原发性或转移性HCC患者的细胞，这些患者代表了HCC在肿瘤淋巴结转移阶段和肝炎病毒感染状态的分布。通过一系列的分析，本发明标记基因注释了53个细胞簇，包括15个肝细胞和胆管细胞簇、14个T细胞和自然杀伤(NK)细胞簇、14个髓细胞簇、5个B细胞簇、3个内皮细胞簇和2个成纤维细胞簇揭示了HCC复杂细胞生态系统的存在。
随后，本发明鉴定了总共15883个髓样细胞，它们被分成14个簇，其中大多数(11/14)与巨噬细胞相关。我们我们接下来研究了这些肿瘤内巨噬细胞亚群的临床相关性，发现肿瘤中较高丰度的MMP9+TAM与TCGA-LIHC队列中较差的总生存率密切相关。
在本发明中，将从临床样本分析及体外功能实验探究MMP9+TAMs在HCC进展中的作用。
为了探究影响MMP9+TAMs分化的具体分子机制，本发明使用StemID2通过利用单个细胞的树状拓扑结构和转录组组成来重建细胞谱系。本发明发现MMP9+巨噬细胞可能是一组终末分化的TAM，可以通过来自MoMFs和TREM2+巨噬细胞的两个不同的分化轨迹累积。
此外，本发明利用Scient研究了分化轨迹背后的潜在驱动转录因子(TFs)。本发明观察到巨噬细胞簇显示出不同的活化TF，在MMP9+TAM中有5种TF被特异性活化，包括PPARG、MITF、MXI1、TCF12和TCF4。其中，PPARG(即PPARγ)在MMP9+TAM亚群中的活性都显著升高(增加了三倍)。
在本发明中，首先将敲低PPARγ敲低THP1细胞和人外周血单核细胞(PBMC)诱导成肿瘤相关细胞(TAM)-like细胞，流式分析检测MMP9+TAMs细胞的比例，确认PPARγ是MMP9+TAMs分化的诱导转录因子。其次，将导成肿瘤相关细胞(TAM)-like细胞与用活细胞染料标记的肝癌细胞共培养，检测PPARγ对肝癌细胞的迁移、侵袭及血管生成的影响。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示MMP9+TAM与TCGA-LIHC队列中较差的总生存率密切相关，采用Cox比例风险回归模型分析发现肿瘤中MMP9+TAMs(C23)的高丰度预示TCGA-LIHC队列中HCC患者的总生存率(OS)较差；
图2示MMP9+TAM在肝癌组织中显著高于非肝癌组织；其中，图2(a)示肝癌患者原发肿瘤和非肿瘤肝组织中MMP9+TAMs流式分选门控策略；图2(b)示5例原发性肝癌组织中MMP9+TAMs的比例明显高于非肿瘤肝组织中MMP9+TAMs的比例；
图3示MMP9+TAMs促进肝癌细胞的侵袭和迁移；其中，图3(a-b)示从原发性肿瘤(PT)及非肿瘤肝(NTL)组织中分离的MMP9+TAMs分别与LM3细胞共培养，检测LM3细胞的迁移(a)与和侵袭(b)能力；图3(c)示从原发性肿瘤(PT)及非肿瘤肝(NTL)组织中分离的MMP9+TAMs分别与人脐静脉内皮细胞(HUVECs)共培养，检测HUVECs的成管能力；
图4示THP1诱导为TAM-like细胞的体系；
图5示PPARγ敲低后THP1细胞诱导成MMP9+TAMs的比例降低；其中，图5(a)示PPARγ敲低的THP-1细胞及对照细胞，诱导成TAM-like细胞后，流式分选MMP9+TAMs的荧光活化细胞分选门控策略；图5(b)示三次重复实验发现，PPARγ敲低的THP-1巨噬细胞中MMP9+TAMs的比例显著低于对照组。
统计显著性采用配对t检验；
图6示PPARγ敲低后THP1细胞诱导成的巨噬细胞中MMP9+TAMs的信号基因表达降低；其中，图6(a)示用RT-qPCR检测单独培养(不共培养)、与肝癌细胞LM3共培养(共培养-对照)或PPARγ敲低后与肝癌细胞LM3共培养(共培养-敲低PPARγ)后诱导成的巨噬细胞中PPARG和MMP9+TAMs信号基因的表达水平；图6(b)示用ELISA法测定不同组(n＝6)THP-1巨噬细胞培养液中MMP9+TAMs关键效应分子MMP9和SPP1的蛋白水平；图6(c)示THP-1巨噬细胞单独培养(不共培养)或与HCC细胞LM3共培养(共培养)与6个巨噬细胞亚群之间转录组范围的基因表达相关性；
图7示PBMC诱导为TAM-like细胞的体系；
图8示PPARγ敲低后PBMC细胞诱导成的巨噬细胞中MMP9+TAMs的信号基因表达降低；其中，图8(a)示用RT-qPCR检测单独培养(不共培养)、与肝癌细胞LM3共培养(共培养-对照)或PPARγ敲低后与肝癌细胞LM3共培养(共培养-敲低PPARγ)后诱导成的巨噬细胞中PPARG和MMP9+TAMs信号基因的表达水平；图8(b)示用ELISA法测定不同组PBMC巨噬细胞培养液中MMP9+TAMs关键效应分子MMP9和SPP1的蛋白水平；
图9示敲低PPARγ的THP1细胞诱导成TAMs后肝癌细胞的迁移、侵袭及成管能力降低敲；其中，图9(a、b)示经与不同处理后的THP-1巨噬细胞共培养的LM3细胞的迁移(a)和侵袭(b)能力；图9(c)示人脐静脉内皮细胞(HUVECs)经与不同组THP-1巨噬细胞共培养后形成的管数分析。
具体实施方式
本发明公开了PPARγ通过促进MMP9+肿瘤相关巨噬细胞的末端分化影响肝癌的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的PPARγ通过促进MMP9+肿瘤相关巨噬细胞的末端分化影响肝癌的应用
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 MMP9+TAMs在肝癌组织中比例升高，且与患者的不良预后显著相关
为了探究MMP9+TAMs在肝癌发生中的作用，首先，我们从Broad FireHose(http://gdac.broadinstitute.org/)下载了TCGA肝细胞癌(TCGA-LIHC)队列中原发性肿瘤和非肿瘤肝组织的标准化基因表达数据以及临床数据。肿瘤或非肿瘤肝组织中一种细胞亚型的丰度是通过其所有标记基因在大量RNA序列中的对数转化基因表达数据的总和来估计的。为了评估非恶性细胞的组成与患者预后之间的关系，我们将一种细胞亚型的丰度除以HCC单细胞数据集中确定的所有患者共享免疫和基质细胞类型的丰度之和，使其标准化。我们应用Cox比例风险模型分析发现肿瘤中较高丰度的MMP9+TAM与TCGA-LIHC队列中较差的总生存率密切相关(HR＝1.5，P＝0.03，图1)。
进一步，我们采用流式分选的方法验证MMP9+TAMs在HCC中比例显著高于非癌组织。我们采集了5例新鲜肝癌组织及对应的癌组织，采用美天妮单细胞解离仪将组织解离成单细胞悬液，采用死细胞吸附磁珠，将死细胞去除，如图2(a)所示，用流式分析肝癌组织及对应的癌旁组织中MMP9+TAMs(CD45+CD68+CD11b+)细胞的比例。如图2(b)所示，我们对5对肝癌样本的数据进行了统计分析，发现原发性肿瘤中MMP9+TAMs的比例显著高于非肿瘤肝(P＝0.0034，配对t检验)。
实施例2 MMP9+TAMs促进肝癌细胞的侵袭、迁移和血管生成
为了研究MMP9+TAMs在HCC进展中的作用，我们采集了新鲜肝癌组织及对应的癌组织，采用美天妮单细胞解离仪将组织解离成单细胞悬液，采用死细胞吸附磁珠将死细胞去除，后采用流式分选的方法从原发性肿瘤中分离了CD45+CD68+CD11b-巨噬细胞，并从非肿瘤肝脏中分离了整个巨噬细胞群(CD45+CD68+)作为对照。将分选的出的细胞与用活细胞染料标记的LM3细胞共同接种在无基质胶及有基质胶的Transwell小室中接触共培养16小时，探究MMP9+TAMs在肝癌细胞系LM3迁移和侵袭中的作用。如图3(a-b)所示，与两个对照组相比，分选出的MMP9+TAMs显著促进了LM3细胞的迁移和侵袭。
随后，我们将分选的出的细胞与用活细胞染料标记的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)接触共培养在μ-玻片中1-4小时，探究MMP9+TAMs在血管生成中的作用。如图3(c)所示，与对照组相比，分选出的MMP9+TAMs显著促进HUVEC细胞的成管能力。
实施例3敲低PPARγ后THP1细胞诱导成MMP9+TAMs的比例降低
为了探究PPARγ是MMP9+TAMs分化的诱导转录因子，我们首先采用慢病毒感染的方法构建了稳定敲低PPARγ(序列见表1)的THP1细胞。如图4所示，我们将稳定敲低PPARγ的THP1细胞及对照细胞分别用PMA处理24小时使THP1细胞诱导成瘤M0型巨噬细胞，后与肝癌细胞LM3非接触共培养48小时，同时，培养基更换为1640培养基和HCC-CM培养基的混合液，诱导成为TAM-like细胞，后采用流式分析检测MMP9+TAMs的比例。
表1.PPARγ的shRNA序列信息
如图5(a)所示，我们采用CD45+CD68+CD11b+标注MMP9+TAMs，发现敲低PPARγ后THP1诱导成的MMP9+TAMs比例(33.1％)显著低于对照组(50.5％)。如图5(b)所示我们进行了三次独立重复实验，发现敲低PPARγ后THP1诱导成的MMP9+TAMs比例显著低于对照组。
随后，我们收集共培养后及不共培养后的细胞，提取RNA后使用RT-qPCR检测PPARG、MMP9、SPP1、CD11b和VEGFA的mRNA水平，发现与不共培养的对照细胞相比，共培养的THP-1巨噬细胞表现显著更高水平的PPARG和MMP9+TAM(MMP9、SPP1和CD11b)的特征(图6a)；采用ELISA检测发现在共培养基中也检测到较高水平的MMP9和SPP1蛋白(图6b)；同时我们将提取的RNA进行了测序分析，发现在所有巨噬细胞亚群中，共培养的THP-1巨噬细胞与MMP9+TAMs(巨噬细胞亚群6)的基因表达谱具有最高的相似性(图6c)。这些结果表明，共培养的THP-1巨噬细胞与MMP9+TAMs有许多共同的特性。另外，在共培养组，PPARγ敲低后，MMP9+TAMs特征分子(MMP9、SPP1和CD11b)的mRNA水平显著降低(图6a)；采用ELISA检测也发现MMP9和SPP1蛋白水平也显著降低(图6b)。
实施例4敲低PPARγ后PBMC细胞诱导成MMP9+TAMs的比例降低
进一步，我们在人外周血单核细胞(PBMC)中重复实验。如图7所示，将从人外周血中分离的PBMC静置培养48小时，得到MoMFs，后与肝癌细胞LM3非接触共培养48小时，同时，培养基更换为1640培养基和HCC-CM培养基的混合液，诱导成为TAM-like细胞。
我们收集共培养后及不共培养后的细胞，提取RNA后使用RT-qPCR检测PPARG、MMP9、SPP1、CD11b和VEGFA的mRNA水平，发现与不共培养的对照细胞相比，共培养的THP-1巨噬细胞表现显著更高水平的PPARG和MMP9+TAM(MMP9、SPP1和CD11b)的特征(图8a)；采用ELISA检测发现在共培养基中也检测到较高水平的MMP9和SPP1蛋白(图8b)。这些结果表明，共培养的THP-1巨噬细胞与MMP9+TAMs有许多共同的特性。另外，在共培养组，PPARγ敲低后，MMP9+TAMs特征分子(MMP9、SPP1和CD11b)的mRNA水平显著降低(图8a)；采用ELISA检测也发现MMP9和SPP1蛋白水平也显著降低(图8b)。
实施例5敲低PPARγ的THP1细胞诱导成TAMs后肝癌细胞的迁移、侵袭及成管能力降低
我们将稳定敲低PPARγ的THP1细胞及对照细胞分别用PMA处理24用使THP1细胞诱导成M0型巨噬细胞，后与肝癌细胞LM3非接触共培养48小时，同时，培养基更换为1640培养基和肝癌细胞条件培养基(HCC-CM)培养基的混合液，诱导成为TAM-like细胞。随后，TAM-like细胞与用活细胞染料标记的LM3细胞共同接种在无基质胶及有基质胶的Transwell小室中接触共培养16小时，探究MMP9+TAMs在肝癌细胞系LM3迁移和侵袭中的作用。如图9(a-b)所示，与不共培养组相比，共培养组-对照中肝癌细胞的迁移、侵袭能力显著增加；在共培养组中，与对照组相比，敲低PPARγ的THP1细胞诱导成TAMs后肝癌细胞的迁移、侵袭能力降低。
随后，我们将TAM-like细胞与用活细胞染料标记的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)接触共培养在μ-玻片中1-4小时，探究敲低PPARγ的THP1巨噬细胞在血管生成中的作用。如图9中(c)所示，与不共培养组相比，共培养组-对照中HUVEC细胞的成管能力显著增加；在共培养组中，与对照组相比，敲低PPARγ的THP1细胞诱导成TAMs后HUVEC细胞的成管能力降低。
实施例6敲低PPARγ的PBMC诱导成TAMs后肝癌细胞的迁移、侵袭及成管能力降低
将敲低PPARγ的PBMC细胞及对照细胞静置培养48小时，得到MoMFs，后与肝癌细胞LM3非接触共培养48小时，同时，培养基更换为1640培养基和HCC-CM培养基的混合液，诱导成为TAM-like细胞。分别用PMA处理24用使THP1细胞诱导成M0型巨噬细胞，后与肝癌细胞LM3非接触共培养48小时，同时，培养基更换为1640培养基和肝癌细胞条件培养基(HCC-CM)培养基的混合液，诱导成为TAM-like细胞。随后，TAM-like细胞与用活细胞染料标记的LM3细胞共同接种在无基质胶及有基质胶的Transwell小室中接触共培养16小时，探究MMP9+TAMs在肝癌细胞系LM3迁移和侵袭中的作用。如图9(a-b)所示，与不共培养组相比，共培养组-对照中肝癌细胞的迁移、侵袭能力显著增加；在共培养组中，与对照组相比，敲低PPARγ的THP1细胞诱导成TAMs后肝癌细胞的迁移、侵袭能力降低。
随后，我们将TAM-like细胞与用活细胞染料标记的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)接触共培养在μ-玻片中1-4小时，探究敲低PPARγ的THP1巨噬细胞在血管生成中的作用。如图9(c)所示，与不共培养组相比，共培养组-对照中HUVEC细胞的成管能力显著增加；在共培养组中，与对照组相比，敲低PPARγ的THP1细胞诱导成TAMs后HUVEC细胞的成管能力降低。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> PPARγ通过促进MMP9+肿瘤相关巨噬细胞的末端分化影响肝癌的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtttgagttt gctgtgaag 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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