髓系细胞触发受体2在制备脓毒症相关功能产品中的应用
阅读说明：本技术 髓系细胞触发受体2在制备脓毒症相关功能产品中的应用 (Application of myeloid cell trigger receptor 2 in preparation of sepsis related functional products ) 是由 黄曦 明思奇 吴永坚 王之影 于 2021-05-19 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物医药技术领域,公开了髓系细胞触发受体2在制备脓毒症相关功能产品中的应用。本发明揭示了TREM-2在脓毒症诊断和治疗中的作用。依据包括两方面,一方面TREM-2在脓毒症患者中表达升高且与患者病情密切相关。另一方面,阻断TREM-2可缓解脓毒症小鼠的症状,并提高小鼠的生存率。该发明为临床脓毒症诊断、干预和治疗提供了良好的策略,具有十分广阔的应用前景。(The invention relates to the technical field of biological medicines, and discloses application of a myeloid cell trigger receptor 2 in preparation of functional products related to sepsis. The invention discloses the role of TREM-2 in sepsis diagnosis and treatment. According to two aspects, on the one hand, TREM-2 is expressed in patients with sepsis and is closely related to the condition of the patients. On the other hand, blocking TREM-2 can alleviate symptoms of sepsis mice and increase survival rates of mice. The invention provides a good strategy for clinical sepsis diagnosis, intervention and treatment, and has very wide application prospect.)
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，更具体的，涉及髓系细胞触发受体2在制备脓毒症相关功能产品中的应用。
背景技术
脓毒症是感染引起的机体免疫反应失调而导致危及生命的器官功能障碍的临床综合征，主要诱因包括感染，创伤，外科手术，烧伤等。脓毒症发展到后期会导致脓毒性休克，多器官功能衰竭等严重并发症，使其成为临床上高死亡率的危重病之一。最新数据显示,全球每年有3150万人罹患脓毒症,其中死亡人数高达530万。尽管近年来脓毒症患者的生存率在逐步提高，但脓毒症的长期死亡率仍达到了20％-50％，若发展为脓毒性休克，死亡率会增加至40％-50％。同时，脓毒症的医疗保健支出在不断攀升，仅在美国，每年用于脓毒症治疗的费用已高达170亿。因此，脓毒症已成为全球重大的公共卫生问题。面对如此严重的疾病威胁，深入研究脓毒症的致病机制并寻找有效地治疗控制措施成为迫切需求。
髓系细胞触发受体(Triggering receptor expressedon myeloid cells,TREM)是一类表达于髓系细胞表面的跨膜受体，属于免疫球蛋白超家族，由胞外的单一免疫球蛋白可变区，带正电的跨膜区及一段短的胞内段组成。TREM受体在人和鼠的染色体上分别定位于6P21及17C3，主要表达于髓系细胞尤其是单核细胞和中性粒细胞，在自然杀伤细胞(Natural killer cells,NKs)、粒细胞和树突状细胞上也有表达，但是在淋巴细胞上表达较低。其中TREM-2因在神经退行性疾病，肿瘤，自身免疫性疾病等多种疾病中发挥重要调控作用而备受关注。TREM-2可参与调控细胞的多种功能，包括细胞增殖与存活，细胞吞噬，神经发育以及炎症反应等。TREM-2错义突变会促进神经系统退行性疾病发生。缺失了TREM2的小胶质细胞和巨噬细胞对神经元，细胞碎片及细菌的吞噬能力减弱。此外，TREM-2可识别并结合载脂蛋白，在脂质代谢中发挥重要调控作用。目前TREM2的确切配体仍然未知，但已报道可与TREM-2结合的物质包括葡聚糖、脂多糖、热休克蛋白、载脂蛋白等。这些研究均表明，TREM-2有成为免疫治疗靶点的巨大前景。
目前临床治疗脓毒症以对症治疗为主，尚无特效治疗药物。脓毒症涉及到的机体反应非常复杂，涉及了包括免疫应答及细胞代谢等生理过程在内的诸多方面。阐明脓毒症的致病机制并找到可干预的靶点，对于脓毒症治疗至关重要。为了提高脓毒症患者的生存率，亟需寻找一种新的免疫检查点分子来提高脓毒症的诊断效率和预后评估准确性，同时增加脓毒症的治疗疗效。
发明内容
为了克服现有技术所提出的上述缺陷，本发明的首要目的是提供TREM-2在制备用于诊断脓毒症的制剂中的应用。
本发明的第二个目的是提供TREM-2在制备用于脓毒症预后评估制剂中的应用。
本发明的第三个目的是提供TREM-2在制备治疗脓毒症的制剂中的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
TREM-2在制备用于诊断脓毒症的制剂中的应用，所述制剂用于检测TREM-2的表达，且TREM-2的表达与脓毒症正相关。
TREM-2在制备用于脓毒症预后评估制剂中的应用，所述制剂用于检测TREM-2的表达，且TREM-2的表达与脓毒症患者的疾病严重程度呈正相关。
本发明一方面研究发现：1、脓毒症患者外周血单核细胞及T淋巴细胞TREM-2表达升高，提升可将TREM-2作为脓毒症的辅助诊断指标；2、TREM-2表达与脓毒症患者疾病密切相关，提示TREM-2可以作为脓毒症的预后评估指标。
优选的，上述脓毒症包括细菌性脓毒症、病毒性脓毒症、真菌性脓毒症、创伤所致脓毒症、脓毒症休克以及由于脓毒症导致的各种并发症；所述诊断试剂具有依据TREM-2的表达诊断患者是否罹患脓毒症或评估患者疾病严重程度的功能；所述治疗试剂可通过阻断TREM-2达到减轻脓毒症症状并提高生存率的效果。
因此，在实际应用中，可以通过检测TREM-2的表达来鉴别诊断受试者是否罹脓毒症。同时，根据TREM-2表达高低可判断患者的病情严重程度，从而对脓毒症患者预后进行评估。
优选的，所述制剂包含能够与TREM-2特异性结合的抗体，或者TREM-2的配体。
更优选的，所述TREM-2来自于CD11b+和/或CD3+T细胞。
本发明另一方面研究发现：1、在脓毒症小鼠模型中，敲除TRME-2可有效提高小鼠生存率；2、TREM-2敲除的脓毒症小鼠肺部肺泡壁增厚减少，肺泡结构完整性增加，炎性浸润减轻；3、敲除TRME-2可抑制脓毒症小鼠血清及脏器研磨液中炎性因子的产生；4、TREM-2敲除的脓毒症小鼠血清和肝脏甘油三酯累积减少，脂肪酸氧化相关分子表达增加，巨噬细胞脂肪酸氧化率增加。
因此，可以通过阻断TREM-2，达到延缓疾病进展，提高生存率，减少炎症因子产生，提高脂肪酸氧化代谢，减少脓毒症引起的器官损伤的目的。
因此，本发明还提供TREM-2在制备用于治疗/缓解脓毒症的功能产品中的应用，所述功能产品具备阻断TREM-2的功能。
优选的，所述功能产品包括：TREM-2蛋白抑制剂、TREM-2基因缺陷或者沉默的免疫相关细胞、其分化细胞或者基因重组构建体中的一种或者多种。
更优选的，所述功能产品包括：
(i)以TREM-2转录本为靶序列，且能够激活TREM-2基因表达产物的表达或基因转录的激活型抗体、核苷酸、慢病毒或腺病毒；
(ii)含有TREM-2互补序列，且能够在转入体内后形成促进TREM-2基因表达产物的表达或基因转录的激活分子的构建体；
(iii)激活TREM-2基因序列后的免疫相关细胞、其分化细胞或构建体。
具体的，所述功能产品选自TREM-2小分子抑制剂、TREM-2-Fc融合蛋白、TREM-2特异性阻断抗体、靶向TREM-2的siRNA、TREM-2敲除或者沉默的试剂及免疫细胞、TREM-2基因缺陷小鼠来源的免疫细胞。
优选的，所述治疗/缓解包括以下至少一种情况：
(1)提高脓毒症生存率；
(2)延缓脓毒症疾病进展；
(3)减少脓毒症引起的炎性因子产生；
(4)缓解脓毒症所致的器官损伤；
(5)缓解脓毒症所致的脂肪酸氧化代谢紊乱。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明揭示了TREM-2在脓毒症诊断和治疗中的作用。依据包括两方面，一方面TREM-2在脓毒症患者中表达升高且与患者病情密切相关。另一方面，阻断TREM-2可缓解脓毒症小鼠的症状，并提高小鼠的生存率。该发明为临床脓毒症诊断、干预和治疗提供了良好的策略，具有十分广阔的应用前景。
附图说明
图1相关性分析显示，TREM-2在脓毒症患者外周血单核细胞及T淋巴细胞中表达上调；
图2相关性分析显示，TREM-2在脓毒症患者外周血单核细胞的表达与患者病情密切相关；
图3显示，在脓毒症小鼠模型中，敲除TRME-2可有效提高小鼠生存率；
图4显示，TREM-2敲除的脓毒症小鼠肺部肺泡壁增厚减少，肺泡结构完整性增加，炎性浸润减轻；
图5显示，敲除TRME-2可抑制脓毒症小鼠血清及脏器研磨液中炎性因子的产生；
图6显示，TREM-2敲除的脓毒症小鼠血清和肝脏甘油三酯累积减少，脂肪酸氧化相关分子表达增加，巨噬细胞脂肪酸氧化率增加。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1 TREM-2在脓毒症患者外周血单核细胞及T淋巴细胞中表达上调
收集46个健康志愿者以及54个脓毒症患者外周血各5ml，采用密度梯度离心法分离PBMC，流式检测TREM-2在CD11b+单核细胞和CD3+T淋巴细胞上的表达水平。
采集健康人及脓毒症患者外周血各5mL，裂解红细胞制备单细胞悬液，调整细胞总量至5x106细胞，在100μL体系中加入TREM-2抗体(R&D公司，货号FAB1278P)以及CD11b和CD3抗体(均购自Biolegend公司)，混匀后避光30分钟，流式检测，FCS/SSC设门分析TREM-2阳性细胞分别占CD11b和CD3阳性细胞的比例。
如图1所示，为TREM-2在健康人及脓毒症患者外周血CD11b+和CD3+T细胞表面的表达水平图。设门为CD11b+和CD3+细胞，可以看出，与健康人相比，脓毒症患者中TREM-2在CD11b+和CD3+细胞中的表达显著上调。
上述结果说明：脓毒症患者外周血TREM-2表达升高，提示可通过检测受试者外周血TREM-2的表达来辅助判断受试者是否罹患脓毒症，即TREM-2可作为脓毒症的辅助诊断指标。
实施例2 TREM-2在脓毒症患者外周血单核细胞的表达与患者病情的相关性分析
收集脓毒症患者入院当天(Day 0)以及经治疗1天后(Day 1)，3天后(Day 3)，5天后(Day 5)，7天后(Day 7)的样本，流式检测CD11b+细胞TREM-2的表达情况，分析TREM-2+CD11b+细胞的比例。同时，收集患者的临床资料，分析TREM-2表达与脓毒症病情监测指标及器官功能损伤指标之间的相关性。
图2A结果表明，患者入院接受治疗且症状得到控制后，血清急性C反应蛋白(CRP)水平持续下降(CRP是临床上脓毒症诊断的重要指标，反映了机体的炎症状况，同时可作为病情严重程度的评估指标)，同时CD11b+细胞TREM-2表达也呈现下降趋势，提示TREM-2的表达可能与患者的病情相关。
图2B结果显示，脓毒症患者TREM-2表达与炎症指标CRP呈现正相关性。
图2C结果显示，脓毒症患者TREM-2表达与器官损伤指标丙氨酸氨基转(ALT)呈现正相关性。
图2D结果显示，脓毒症患者TREM-2表达与肾脏损伤指标尿素氮(BUN)呈现正相关性。
图2E结果显示，脓毒症患者TREM-2表达与肝脏损伤指标总胆红素(Totalbilirubin)呈现正相关性。
这些结果表明，CD11b+细胞TREM-2表达与脓毒症患者的病情密切相关，TREM-2表达越高，患者病情越严重，预后越差。也说明了TREM-2表达与脓毒症患者疾病进展密切相关，提示TREM-2可以作为脓毒症的预后评估指标，并有望通过干预TREM-2表达影响脓毒症发生发展。
实施例3敲除TREM-2对小鼠生存率的影响
使用4-6周SPF级雌性C57BL/6背景的野生型(WT)小鼠和TREM-2基因敲除(TREM-2-/-)小鼠，分别构建盲肠结扎穿孔(CLP)脓毒症模型、脂多糖LPS诱导的脓毒症小鼠模型、铜绿假单胞杆菌(PA)感染的脓毒症模型，观察并记录小鼠生存率，以确定TREM-2对于脓毒症整体转归的影响。
图3A显示，敲除TREM-2可显著提高CLP模型中脓毒症小鼠的生存率。
图3B结果表明，在LPS脓毒症小鼠模型中，与WT小鼠相比，TREM-2-/-小鼠的生存率显著提高。
图3C结果表明，在细菌(PA菌)感染的脓毒症小鼠模型中，敲除TREM-2可显著提高小鼠生存率。
综上可见：脓毒症小鼠中敲除TREM-2，可有效提高小鼠生存率，提示有望通过阻断TREM-2降低脓毒症患者的死亡率。
实施例4敲除TREM-2对脓毒症小鼠肺部炎症浸润和损伤的影响
使用4-6周SPF级雌性C57BL/6小鼠构建LPS诱导的脓毒症模型。构模12小时后处死小鼠，取肺小叶用4％多聚甲醛固定，石蜡包埋切片后进行H&E染色，显微镜下观察小鼠肺部炎性浸润及损伤，结果如图4所示。
结果表明，WT脓毒症小鼠肺泡结构完整性被破坏，肺泡壁增厚，且浸润了大量炎性细胞。而TREM-2-/-小鼠泡壁增厚减少，肺泡结构完整性增加，肺部炎性浸润减轻。
由此得出结论：TREM-2敲除可减轻脓毒症小鼠的肺部炎性浸润和病理损伤，使肺泡壁增厚减少，肺泡结构完整性增加，且炎性浸润减轻。结果提示可通过阻断TREM-2达到缓解脓毒症导致的器官损伤的效果。
实施例5敲除TREM-2对脓毒症小鼠炎性因子产生的影响
使用4-6周SPF级雌性C57BL/6小鼠构建LPS诱导的脓毒症模型。构模12h后，使用眼球采血法取小鼠外周血，1800rpm离心10min收取血浆。同时取小鼠肺脏(lung)及肝脏(liver)组织进行研磨，取上清。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血浆及组织研磨液中的IL-1β、IL-6及TNF-α的水平，结果如图5所示。
图5A结果表明，TREM-2敲除可显著降低血浆及肝、肺研磨液中炎性因子IL-1β的水平。
图5B结果表明，TREM-2-/-小鼠血浆及肝、肺研磨液中炎性因子IL-6的水平显著降低。
图5C结果表明，TREM-2敲除可显著降低血浆及肝、肺研磨液中炎性因子TNF-α的水平。
由此得出结论：敲除TREM-2可减少脓毒症小鼠炎性因子产生，提示阻断TREM-2可达到抑制脓毒症炎性因子风暴的效果。
实施例6敲除TREM-2对脓毒症小鼠脂肪酸氧化代谢的影响
使用4-6周SPF级雌性C57BL/6小鼠构建LPS诱导的脓毒症模型。构模12h后，使用眼球采血法取小鼠外周血，1800rpm离心10min收取血浆。同时，取小鼠肺肝脏组织100mg，用预冷的PBS清洗一遍，加入1ml的5％NP-40/ddH2O，使用组织匀浆机将其充分匀浆，然后放入水浴锅中，使样品缓慢升温至80-100℃，加热2-5min，直到溶液变得浑浊，然后冷却至室温。如此反复，直到溶解并抽提出所有甘油三酯。测量血浆及肝脏中的甘油三酯含量，结果如图6A所示。图6A结果表明，WT小鼠血清及肝脏中甘油三酯水平升高，提示脂肪酸氧化分解减少，而TREM-2-/-小鼠血清及肝脏中甘油三酯水平降低，提示敲除TREM-2后脂肪酸氧化增加。
构模12h后，取一叶肝脏组织进行冰冻切片，进行油红O染色，评估肝脏的脂质累积情况，结果如图6B所示。图6B显示，TREM-2-/-小鼠肝脏脂质累积减少，同样提示敲除TREM-2可提高脂肪酸氧化分解。
取剩余肝组织(liver)及部分肺组织(lung)，加入蛋白裂解液充分裂解，抽提蛋白并定量，通过蛋白质免疫印记技术检测脂肪酸氧化相关分子的表达水平，结果如图6C所示。图6C结果表明，相对于WT小鼠，TREM-2-/-小鼠肺和肝组织中脂肪酸氧化限速酶CPT1，以及参与脂肪酸氧化的关键分子PPAR、PGC-1的表达升高，提示TREM2-/-小鼠体内脂肪酸氧化增加。
构模12h后，取小鼠腹腔巨噬细胞，使用海马细胞能量代谢分析仪检测巨噬细胞的脂肪酸氧化水平，结果如图6D所示。图6D结果表明，相对于WT小鼠，TREM2-/-小鼠腹腔巨噬细胞脂肪酸氧化率显著增加，直接证实阻断TREM2可提高小鼠体内脂肪酸氧化代谢。
综上所述：敲除TREM-2可提高脓毒症小鼠的脂肪酸氧化代谢，提示阻断TREM-2可调节脓毒症所导致的脂肪酸氧化代谢紊乱。
由于TREM-2的体内干预手段不同、构建脓毒症模型的方法不同、检测指标的时相不同、所选用的细胞系差异等原因，本发明得出的结论与现有TREM-2在脓毒症中的部分研究存在相反的结论。但本发明分别从临床样本、动物实验、体外细胞等不同方面对TREM-2在脓毒症中的作用进行了相互验证，且采用了目前国际上公认的三种脓毒症模型，均得到了一致的结论，即阻断TREM-2能提高脓毒症小鼠生存率，并缓解脓毒症所致的器官损伤及脂肪酸氧化代谢紊乱，这些结论在本发明中均得到有力体现。故本发明认为，阻断TREM-2能达到治疗脓毒症的效果。