一种光敏剂/粘土复合材料及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 一种光敏剂/粘土复合材料及其制备方法和应用 (Photosensitizer/clay composite material and preparation method and application thereof ) 是由 高玉婷 张家鑫 严春杰 潘玉凤 于 2021-08-20 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种光敏剂/粘土复合材料及其制备方法和应用。该复合材料是将光敏剂插层在粘土中,即将带正电荷的聚集诱导发光小分子有机物插层到粘土的层间制备光敏剂/粘土复合材料。该复合材料具有光动力和化学动力协同抗菌的优点,在光照下,可以快速产生羟基自由基和单线态氧,快速杀死细菌,并且对正常细胞损伤小,具有较好的生物相容性；而且本发明提供的制备方法具有工艺简单、操作方便和成本低廉等特点。该复合材料还具有抗菌止血的功效,生物安全性好,在医用敷料领域有着巨大的应用前景。(The invention provides a photosensitizer/clay composite material and a preparation method and application thereof. The composite material is prepared by intercalating a photosensitizer in clay, namely intercalating positively charged aggregation-induced emission micromolecule organic matters into the interlayer of the clay. The composite material has the advantages of photodynamic and chemical power synergistic antibacterial, can rapidly generate hydroxyl free radicals and singlet oxygen under illumination, rapidly kill bacteria, has small damage to normal cells, and has better biocompatibility; the preparation method provided by the invention has the characteristics of simple process, convenience in operation, low cost and the like. The composite material also has the effects of antibiosis and hemostasis, has good biological safety and has huge application prospect in the field of medical dressings.)
技术领域
本发明涉及无机/有机复合杀菌材料领域，尤其涉及一种光敏剂/粘土复合材料及其制备方法和应用。
背景技术
随着人民生活条件的改善，医疗卫生与健康事业的发展也受到广泛的关注。细菌感染不仅是创伤急救早期需要注意的问题，也是创伤愈合后期的一大挑战。细菌感染会导致严重的组织损伤，因为微生物可以与宿主的免疫系统竞争，进而入侵活组织，尤其是金黄色葡萄球菌，不仅会减缓伤口愈合的进程，甚至导致组织坏死。抗生素在治疗细菌感染等问题上应用十分广泛，但长期服用抗生素不仅加速了具有抗生素耐药细菌的进化和形成，还会通过食物，水和牲畜等多种途径威胁着人们的健康。因此，急需研究出一种高效、低毒副作用的抗菌材料去解决细菌感染的难题。
光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)由于其疗效快、广谱性、非侵害性等成为治疗细菌感染的一种新兴方法。光动力疗法的杀菌机理是基于羟基自由基、超氧阴离子、单线态氧、过氧化氢等活性氧分子对细菌产生的超强氧化反应。活性氧分子通过破坏细胞膜结构的完整性，增加细胞膜的离子通透性或者通过直接破坏细胞中的不饱和脂类、多肽和酶等成分的方式来有效杀死细菌。但是，活性氧的产生与光敏剂的光学性质和光的的能量有密切关系，而且光敏剂产生的单线态氧分子的寿命和释放距离都很短，导致了较大的局限性。此外，光敏剂具有一定的细胞毒性，需要对光敏剂进行改性，减弱其毒性。粘土是一种含水铝硅酸盐产物，是由地壳中含长石类岩石经过长期风化和地质的作用而生成的，在自然界中分成广泛，种类繁多，藏量丰富，是一种宝贵的天然资源。层状硅铝酸盐矿物是粘土矿物的一种，作为药物使用已有悠久的历史。层状硅铝酸盐矿物具有优良吸附性、阳离子交换性、分散悬浮性等。由于层状硅铝酸盐矿物具有较好的阳离子交换性，可以将具有芬顿反应的Fe2+或Fe3+引入层间，在过氧化氢的作用下可产生大量的·OH，同时也可将小分子光敏剂引入层间，在光照的作用下也可产生大量的1O2，·OH和1O2具有较强的杀菌作用，经插层后的复合材料具有化学动力和光动力协同杀菌的效果。
因此，开发出一种无机/有机复合杀菌材料，并同时具有光动力和化学动力协同杀菌疗效是十分有意义的。
发明内容
本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，提出一种光敏剂/粘土复合材料及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
本发明提供的一种光敏剂/粘土复合材料，包括光敏剂和层状粘土，所述光敏剂插层在所述粘土中。
进一步的，所述光敏剂为带正电的聚集诱导发光小分子有机物，所述带正电的聚集诱导发光小分子有机物。
进一步的，所述带正电的聚集诱导发光小分子有机物包括BPCI、TPCI和TPCB中的一种或多种。
进一步的，所述粘土包括高岭石、蒙脱石、伊利石和绿泥石中的一种或多种。
本发明还提供上述光敏剂/粘土复合材料的制备方法，将粘土与缓冲溶液混合制得均匀的浆液，向该浆液中滴加光敏剂避光反应后得光敏剂/粘土复合材料。
进一步的，本发明的制备方法包括以下步骤：
步骤S1，将一定质量的粘土加入到缓冲溶液中，制得w/v为0.2％～0.5％的悬浮液；
步骤S2，将步骤S1的悬浮液超声破碎制得均匀的浆液；
步骤S3，向步骤S2的浆液中滴加的光敏剂0.015mg/mL～0.6mg/mL并搅拌，温度范围为20～60℃，避光反应6h-48h；
步骤S4，将步骤S3反应后的溶液经冷冻干燥后获得光敏剂/粘土复合材料。
进一步的，步骤S1中的所述缓冲溶液为磷酸缓冲溶液，所述磷酸缓冲溶液的pH值范围为6.5～7.4。
进一步的，步骤S3中的所述光敏剂为TPCI，所述TPCI的浓度为0.15mg/mL～6.0mg/mL。
进一步的，所述粘土为蒙脱石，所述蒙脱石和所述TPCI的质量浓度比范围为：13.0～6.5
本发明还提供上述光敏剂/粘土复合材料在抗菌止血敷料中的应用。
进一步的，所述应用的条件包括光照条件和过氧化氢条件，所述光照条件包括光照的波长为400nm～600nm和光照的光源功率为1mW/cm2～50mW/cm2；所述过氧化氢条件中的过氧化氢浓度为10μmol/L～200μmol/L。
本发明提供的技术方案带来的有益效果是：
(1)本发明提供的一种光敏剂/粘土复合材料，将带正电荷的聚集诱导发光小分子有机物插层到粘土的层间制备光敏剂/粘土复合材料。该复合材料具有光动力和化学动力协同抗菌的优点，在光照下，可以快速产生羟基自由基和单线态氧，快速杀死细菌，而且相比于单独的光敏剂或粘土使用，对正常细胞损伤小，具有较好的生物相容性，在动物实验中，还表现出较好的促进伤口愈合的能力；
(2)本发明提供的一种光敏剂/粘土复合材料的制备方法，该方法具有工艺简单、操作方便和成本低廉等特点；
(3)本发明的光敏剂/粘土复合材料具有抗菌止血的功效，生物安全性好，在医用敷料领域中有着巨大的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中的MMT和TPCI/MMT的XRD叠加图；
图2为实施例1中的MMT、TPCI和TPCI/MMT的FTIR叠加图；
图3a为实施例1中的MMT的SEM图；
图3b为实施例1中的TPCI/MMT的SEM图；
图4a为实施例1中的MMT的BET图；
图4b为实施例1中的TPCI/MMT的BET图；
图5a为实施例1中的TPCI/MMT的·OH产生速率图；
图5b为实施例1中的TPCI/MMT的ESR检测·OH产生量图；
图6a为实施例1中的TPCI/MMT的1O2产生速率图；
图6b为实施例1中的TPCI/MMT的ESR检测1O2产生量图；
图7为实施例1中TPCI/MMT、TPCI和MMT的光毒性对比图；
图8a为实施例1中TPCI/MMT和MMT的抗E.coli效果对比图；
图8b为实施例1中TPCI/MMT和MMT的抗S.aμreμs效果对比图
图9为实施例6中TPCI/MMT、TPCI和MMT的溶血实验对比图；
图10实施例1的TPCI/MMT复合材料抗菌效率图；
图11实施例2的TPCI/MMT复合材料抗菌效率图；
图12实施例3的TPCI/MMT复合材料抗菌效率图；
图13实施例4的TPCI/MMT复合材料抗菌效率图；
图14a为实施例1中的TPCI/MMT和MMT的动物实验中小鼠伤口愈合过程中不同时间的照片；
图14b为实施例1中的TPCI/MMT和MMT的动物实验中小鼠伤口愈合过程中不同时间的伤口面积评估。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图和实施例对本发明实施方式作进一步地描述。
研究中使用的所有化学药品都是分析级试剂，实验所用的细菌为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。其中光敏剂TPCI为本申请人自制合成，其结构式如式(I)所示：
实施例1：
量取8mL的PBS(pH 6.5)于离心管中，称取16mg的蒙脱石(MMT)加入到离心管中，在超声波细胞破碎仪中破碎60min得到均匀的浆液，此时，MMT的浓度(w/v)为0.2％。称取15.42mg的TPCI于离心管中，加入1mL的二甲基亚砜(DMSO)，超声溶解，此时，TPCI的浓度为10mmol/L。量取100μL、10mmol/L的TPCI稀释至1mL的水溶液中，此时TPCI的浓度为1mmol/L。量取2.7mL、2mg/mL的MMT溶液于离心管中，在20℃搅拌下，缓慢滴加MMT:TPCI体积比为9:1的1mmol/L的TPCI溶液，避光反应6h，得到TPCI/MMT复合材料溶液，即为光敏剂/粘土复合材料1。
实施例2：
量取4mL的PBS(pH 6.5)于离心管中，称取8mg的蒙脱石(MMT)加入到离心管中，在超声波细胞破碎仪中破碎15min得到均匀的浆液，此时，MMT的浓度(w/v)为0.2％。称取15.42mg的TPCI于离心管中，加入1mL的二甲基亚砜(DMSO)，超声溶解，此时，TPCI的浓度为10mmol/L。量取100μL、10mmol/L的TPCI稀释至1mL的水溶液中，此时TPCI的浓度为1mmol/L。量取2.1mL、2mg/mL的MMT溶液于离心管中，在30℃搅拌下，缓慢滴加MMT:TPCI体积比为9:1的1mmol/L的TPCI溶液，避光反应12h，得到TPCI/MMT复合材料溶液，即为光敏剂/粘土复合材料2。
实施例3：
量取10mL的PBS(pH 6.5)于离心管中，称取20mg的蒙脱石(MMT)加入到离心管中，在超声波细胞破碎仪中破碎120min得到均匀的浆液，此时，MMT的浓度(w/v)为0.2％。称取15.42mg的TPCI于离心管中，加入1mL的二甲基亚砜(DMSO)，超声溶解，此时，TPCI的浓度为10mmol/L。量取100μL、10mmol/L的TPCI稀释至1mL的水溶液中，此时TPCI的浓度为1mmol/L。量取2.1mL、2mg/mL的MMT溶液于离心管中，在60℃搅拌下，缓慢滴加MMT:TPCI体积比为9:1的1mmol/L的TPCI溶液，避光反应48h，得到TPCI/MMT复合材料溶液，即为光敏剂/粘土复合材料3。
实施例4：
量取6mL的PBS(pH 6.5)于离心管中，称取12mg的蒙脱石(MMT)加入到离心管中，在超声波细胞破碎仪中破碎30min得到均匀的浆液，此时，MMT的浓度(w/v)为0.2％。称取15.42mg的TPCI于离心管中，加入1mL的二甲基亚砜(DMSO)，超声溶解，此时，TPCI的浓度为10mmol/L。量取100μL、10mmol/L的TPCI稀释至1mL的水溶液中，此时TPCI的浓度为1mmol/L。量取2.1mL、2mg/mL的MMT溶液于离心管中，在40℃搅拌下，缓慢滴加MMT:TPCI体积比为9:1的1mmol/L的TPCI溶液，避光反应18h，得到TPCI/MMT复合材料溶液，即为光敏剂/粘土复合材料4。
实施例5：
量取6mL的PBS(pH 7.4)于离心管中，称取12mg的蒙脱石(MMT)加入到离心管中，在超声波细胞破碎仪中破碎30min得到均匀的浆液，此时，MMT的浓度(w/v)为0.2％。称取15.42mg的TPCI于离心管中，加入1mL的二甲基亚砜(DMSO)，超声溶解，此时，TPCI的浓度为10mmol/L。量取100μL、10mmol/L的TPCI稀释至1mL的水溶液中，此时TPCI的浓度为1mmol/L。量取880μL的PBS(pH 7.4)于离心管中，在20℃搅拌下，滴加100μL、2mg/mL的MMT溶液，然后再缓慢滴加20μL、1mmol/L的TPCI溶液，避光反应48h，得到TPCI/MMT复合材料溶液，即为光敏剂/粘土复合材料5。
实施例6：
量取6mL的PBS(pH 7.4)于离心管中，称取12mg的蒙脱石(MMT)加入到离心管中，在超声波细胞破碎仪中破碎30min得到均匀的浆液，此时，MMT的浓度为2mg/mL。称取15.42mg的TPCI于离心管中，加入1mL的二甲基亚砜(DMSO)，超声溶解，此时，TPCI的浓度为10mmol/L。量取100μL、10mmol/L的TPCI稀释至1mL的水溶液中，此时TPCI的浓度为1mmol/L。量取860μL的PBS(pH 7.4)于离心管中，在20℃搅拌下，滴加100μL、2mg/mL的MMT溶液，然后再缓慢滴加40μL、1mmol/L的TPCI溶液，避光反应48h，得到TPCI/MMT复合材料溶液，即为光敏剂/粘土复合材料6。
为了更好的说明本发明的光敏剂/粘土复合材料带来的有益效果，下面将通过结构表征、光毒性试验、抗菌试验和止血试验进行阐述。
1、将实施例1制备得到的光敏剂/粘土复合材料1进行结构表征
为了能准确判断光敏剂插层在粘土中的可行性，对本实施例1得到的光敏剂/粘土复合材料1样品采用X射线衍射仪、红外光谱仪、扫描电镜、BET孔径分析和ESR测试，结果如图1、2、3、4、5所示：
图1为MMT和TPCI/MMT的XRD图，通过XRD分析可得，将TPCI引入MMT层间后，TPCI/MMT的层间距扩大到了
图2为MMT、TPCI和TPCI/MMT的FTIR图，通过FTIR分析可得，TPCI/MMT上具有明显的MMT和TPCI的特征峰，特征峰位置基本相同，推测MMT和TPCI是通过静电作用力结合；
图3a MMT的SEM图像和图3b TPCI/MMT的SEM图像表明，MMT是致密的结构，TPCI插层后，层间距变大，结构疏松；
图4a MMT的BET图的和图4b TPCI/MMT的BET图，通过BET分析可得，属于类型Ⅲ吸附等温线，属于多分子层吸附，TPCI/MMT的比表面积为28.13m2/g，远大于MMT的比表面积5.22m2/g，有利于吸附；
图5a TPCI/MMT的·OH产生速率图和图5b TPCI/MMT的ESR检测·OH产生量图，通过分析可得，TPCI/MMT在光照下产生大量的·OH，且比黑暗下的速度更快，同时ESR也检测到了强的·OH特征峰；
图6a TPCI/MMT的1O2产生速率图和图6b TPCI/MMT的ESR检测1O2产生量图，通过分析可得，TPCI/MMT在光照下可以产生大量的1O2，同时ESR也检测到了强的1O2特征峰；
由上可知，光敏剂成功地插层在粘土，并表现出潜在的生物活性。
2、将实施例1制备得到的光敏剂/粘土复合材料1进行光毒性试验
试验具体内容如下：
首先在96孔板中以每孔5000个细胞的密度孵育细胞24小时，然后吸出培养基，随后加入含有不同浓度的材料MMT(0.01mg/mL，0.1mg/mL,0.5mg/mL)，TPCI(0.5μmol/L,5μmol/L,25μmol/L)，TPCI/MMT(0.01+0.5,0.1+5,0.5+25)的DMEM培养基，继续培养4小时，然后光照组在白光灯下光照1小时，黑暗组避光1小时，继续培养12小时，然后每个孔中加入100μL MTT溶液(0.5mg/mL)孵育4小时，吸出培养基，每孔加入100μL的二甲基亚砜溶液以溶解结晶紫。充分震荡后用酶标仪读取在570nm处的吸光值。
结果如图7所示，MMT在高浓度时，毒性较大；TPCI在光照下也有较大的细胞毒性；TPCI/MMT光照和黑暗下的细胞毒性都较小，说明TPCI/MMT在相同浓度下，无论在光照或者黑暗条件下对正常细胞的损害较小，生物安全性较好
3、将实施例1制备得到的光敏剂/粘土复合材料1与粘土进行抗菌对比试验试验具体内容如下：
挑取3-5个独立的菌落至新鲜的LB液体培养基中37℃下培养12h生长到稳定期，标定菌液浓度。将菌液用PBS稀释至OD＝0.0001(大约1mL有2×105个细菌)将TPCI/MMT和MMT用PBS进行稀释，1mL稀释药液和1mL菌液加入到玻璃瓶中作为实验组，1mLPBS和1mL菌液加入到玻璃瓶中作为空白组，用白光灯光照1h，避光处理为对照实验组。未处理的菌液空白组作为100％的细菌生长对照，每个抑菌实验进行一式三份。
结果如图8a和8b所示，MMT在光照的条件E.coli和S.aμreμs的抗菌率分别为62％和60％，而TPCI/MMT在光照的条件下的抗菌率均为100％，说明TPCI/MMT比MMT的杀菌效果更好，可能有助于伤口感染处细菌的消除和伤口的恢复。
4、将实施例6制备得到的光敏剂/粘土复合材料1与粘土进行止血对比试验
采取抗凝小鼠血1mL，离心洗涤后用PBS稀释，将150μL稀释后的血液和药液混合，以加30μL的TRITON为阳性对照组，以加150μL的PBS为阴性对照组，各组设置3个平行，3h后3000r离心10min，各取样品150μL至96孔板测定540nm吸光度。
结果如图9所示，MMT溶血现象十分明显，溶血率达到了80％左右，TPCI/MMT具有较好的血液相容性，溶血率仅为2％左右，说明TPCI引入MMT层间后，解决了MMT的溶血问题，TPCI/MMT的生物安全性较好。
5、将实施例1～实施例5制备得到的系列光敏剂/粘土复合材料进行抗菌效果试验
试验具体内容如下：
样品1：量取实施例1制备得到的光敏剂/粘土复合材料1溶液2mL，稀释至4mL的PBS(pH 6.5)溶液中，得到稀释1倍的光敏剂/粘土复合材料1。取同体积的菌液、过氧化氢溶液和稀释1倍的光敏剂/粘土复合材料1溶液均匀混合后在恒温摇床中避光作用1h，然后吸取等体积的混合溶液分别进行光照1h和暗处理1h。
样品2：量取实施例2制备得到的光敏剂/粘土复合材料2溶液400μL，稀释至4mL的PBS(pH 6.5)溶液，得到稀释10倍的光敏剂/粘土复合材料2溶液。取同体积的菌液、过氧化氢溶液和稀释10倍的光敏剂/粘土复合材料2均匀混合后在恒温摇床中避光作用1h，然后吸取等体积的混合溶液分别进行光照1h和暗处理1h。
样品3：量取实施例3制备得到的光敏剂/粘土复合材料3溶液40μL反应后的溶液，稀释至4mL的PBS(pH 6.5)溶液，得到稀释100倍的光敏剂/粘土复合材料3溶液。取同体积的菌液、过氧化氢溶液和稀释100倍的光敏剂/粘土复合材料3溶液均匀混合后在恒温摇床中避光作用1h，然后吸取等体积的混合溶液分别进行光照1h和暗处理1h。
样品4：量取实施例4制备得到的光敏剂/粘土复合材料4溶液80μL反应后的溶液，稀释至4mL的PBS(pH 6.5)溶液，得到稀释20倍的光敏剂/粘土复合材料4溶液。取同体积的菌液、过氧化氢溶液和稀释20倍的光敏剂/粘土复合材料4溶液均匀混合后在恒温摇床中避光作用1h，然后吸取等体积的混合溶液分别进行光照1h和暗处理1h。
光照的条件为光照的波长为400nm～600nm和光照的光源功率为1mW/cm2～50mW/cm2。
结果如图10、11、12、13所示。
采用实施例1制备的样品1在光照下抗大肠杆菌100％；黑暗下抗大肠杆菌54.4％，光照下抗金黄色葡萄球菌100％，黑暗下抗金黄色葡萄球菌57.4％。
采用实施例2制备的样品2在光照下抗大肠杆菌79.9％；黑暗下抗大肠杆菌48.7％，光照下抗金黄色葡萄球菌62％，黑暗下抗金黄色葡萄球菌55.7％。
采用实施例3制备的样品3在光照下抗大肠杆菌45.7％；黑暗下抗大肠杆菌37.9％，光照下抗金黄色葡萄球菌48.8％，黑暗下抗金黄色葡萄球菌45.3％。
采用实施例4制备的样品4在光照下抗大肠杆菌57.5％；黑暗下抗大肠杆菌46.6％，光照下抗金黄色葡萄球菌51.4％，黑暗下抗金黄色葡萄球菌49.1％。
显然，TPCI/MMT的抑菌效果明显，主要是因为光敏剂TPCI在光照作用下产生了大量的活性氧分子，活性氧分子通过破坏细胞膜结构的完整性，增加细胞膜的离子通透性或者通过直接破坏细胞中的不饱和脂类、多肽和酶等成分的方式来有效杀死细菌。而且，加入10μmol/L～200μmol/L过氧化氢后，蒙脱石中的Fe离子与其反应产生羟基自由基，提供了部分杀菌效果，引入TPCI后，杀菌效果提高到100％。
5、将实施例5～实施例6制备得到的系列光敏剂/粘土复合材料进行止血效果试验
试验具体内容如下：
样品5：取同体积的鼠红细胞和采用实施例5制备的光敏剂/粘土复合材料5溶液均匀混合3h。
样品6：取同体积的鼠红细胞和采用实施例6制备的光敏剂/粘土复合材料6溶液均匀混合3h。
结果显示，样品5的溶血率为3.84％；样品6的溶血率为2.53％，说明在MMT浓度相同的条件下，在一定程度上提高TPCI的负载量，TPCI/MMT的溶血率减小，生物安全性好。
6、将实施例1制备得到的光敏剂/粘土复合材料1与粘土进行动物试验
试验具体内容如下：
对BALB/c小鼠进行麻醉、脱毛，在小鼠背部皮肤上产生直径为10mm的切除伤口。然后将铜绿假单胞菌(108CFU/mL，20μL)接种在伤口部位，并静置10分钟以刺激感染，然后将小鼠分为4组，PBS(light)、MMT(dark)、TPCI/MMT(dark)和TPCI/MMT(light)，分别滴加20μL药液到小鼠伤口部位，将光照组小鼠置于白光灯下照射30min，黑暗组避光处理30min，连续治疗3天，观测伤口面积及感染情况，并用ImageJ软件对伤口面积进行分析。
如图14a和图14b所示，结果表明，14天后，伤口明显愈合，特别是TPCI/MMT(light)组的伤口基本完全愈合；通过对伤口面积进行定量评估，TPCI/MMT(light)组的伤口愈合速度最快。
综上所述，在浓度相同的条件下，TPCI/MMT复合材料的生物安全性比MMT和TPCI的好。MMT中含有Fe2+和Fe3+，在H2O2的作用下，会产生·OH，同时TPCI在光照条件下会产生大量的1O2，这些ROS(·OH和1O2)对细胞成分(如不饱和脂类、多肽和酶等)造成氧化损伤，从而杀死细菌，有利于伤口处细菌的消灭；MMT还具有强吸水性，可吸附大量的水，激活凝血因子，刺激纤维蛋白原转变为纤维蛋白，促进血液凝固，堵塞血管破损处，达到迅速止血的效果。
在不冲突的情况下，本文中上述实施例及实施例中的特征可以相互结合。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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