具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，本发明中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。本发明中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

本发明采用了多光谱不同参数的光刺激待测细胞，通过对待测细胞的膜电位(电流)的测量来判定其能否被光调控活动，以及细胞光调控参数的特异性、激活阈值进行准确的检测；具体的，光刺激与细胞膜光电流相互结合的方式来进行光调控特性的测量。根据细胞膜电流是否发生剧烈变化作为某一光参数是否能够诱发光电流，细胞是否能够被光调控的依据。

图1为本发明的原理图；其中待测光A为使用多参数(波长、功率密度、重复率、脉宽)可调节的光刺激装置发出的待检测的光信号。玻璃管中的微电极用于测量细胞膜电流。细胞膜电流变换通过生物电信号放大器进行微小电流信号的采集，并使用实验数据记录系统对采集信号进行记录和分析。

本发明所提出的检测系统通过多波长、多参量(能量密度、脉冲宽度、重复率等)可调节的光刺激装置，进行光刺激下细胞内光电流、细胞膜电流的测量。若检测到某种参数的光信号诱发了待测细胞的膜电流变化或者产生了光电流，即说明待测细胞其活动能被该参量光信号干预和调控。进行膜电位(电流)的测量时，一个测量周期内只使用某种单一特定参数的刺激光A，避免多种波长光信号相互干扰。整体测量过程中，通过渐进式策略逐步调节刺激光A的参量，来测量待测细胞的光调控响应参量阈值和调控范围。

图2中检测系统由多参数可编程光刺激器、光纤固定器、显微镜、玻璃管、测量电极、玻璃管微电极操作器、细胞膜电流(电位)信号采集放大器、测量结果记录装置、操作台等部件组成；在操作台上放置有培养皿，培养皿内有细胞浴液和待测细胞，培养皿的上方是显微镜，培养皿的一侧是测量电极，另一侧是多参数可编程光刺激器；测量电极与细胞膜电流(电位)信号采集放大器相连，细胞膜电流(电位)信号采集放大器与测量结果记录装置相连，且测量电极与细胞膜之间形成高阻封接(如为GΩ)。多参数可编程光刺激器与光纤耦合器相连，光纤通过光纤固定仪固定，多参数可编程光刺激器发出的光源通过光纤耦合输出后，使用光纤固定仪将其固定至可以辐照到待测细胞的位置。

上述的测量电极采用玻璃管微电极，其包括玻璃管和测量电极，所述玻璃管为锥形，其尖端直径要小于单个待测细胞体尺寸(如为1-2μm)，且敞口；所述的测量电极从玻璃管的尾部插入到玻璃管内，在玻璃管内灌装有电极内液。

作为进一步的技术方案，还包括参考电极，所述的参考电极浸于细胞浴液内，参考电极与信号采集放大器的信号接地端相连接。

图3为本发明中使用的多参数可调节光刺激装置，它有三个部分组成：可编程调节光参数控制模块、多个单波长刺激光发生模块、光纤耦合器。其中可编程调节光参数控制模块可通过用户的配置，定时发生不同参数的刺激光，控制对应波长的刺激光发生模块生成对应参数的刺激光，经过光纤耦合器输出。

本发明提出的基于多光谱多参量光刺激的细胞膜电位检测方法，所述方法采用细胞膜电位(电流)变化作为光调控细胞活动的表征，使用多参数渐进式调节的方式进行光参数扫描式测量。其中刺激光的参数包含：光波长、脉冲宽度、重复率、功率密度等参数。待测细胞为离体单个细胞，可以是离体培养的或手术剥离处理的。具体步骤如下：

选取离体培养适当时长(如24-48小时)的待测细胞，或手术分离并进行急性分离处理的待测细胞。配置细胞膜电流测量所需的电极内液、细胞外液等溶液，制作玻璃微管电极并灌注电极内液。将盛有待测细胞的培养皿放置在倒置显微镜的观测台，通过电极操作台使得玻璃微管电极与细胞膜之间形成高阻封接(如为GΩ)。

将本发明中采用的多参数光刺激系统光源通过光纤耦合输出后，使用光纤固定仪将其固定至可以辐照到待测细胞的位置。输入刺激光调节参量变化范围，在一定的时间内分别从小到大渐进方式对能量密度、脉冲宽度、频率等参数进行调节，在短时间内完成一系列相同波长下不同光参数的光刺激。然后通过膜电流信号放大器采集电极端微小膜电流(如pA级)信号，在后端连接的实验记录系统上，记录在不同参数光刺激下，能否诱发细胞光电流的产生。随后切换不同波长的刺激光，通过上述光参数递进式扫描检测细胞膜电位(电流)的变化，以探测不同波段的刺激光能否诱发待测细胞的光电流，以及待测细胞的光调控是否具有波长特异性。如图3所示，为本发明所使用的光刺激装置结构示意图。

有别于其他方法，配合本发明中提到的多波长、多参量可调节的光刺激装置，所述方法检测系统采用光参数渐进式扫描检测细胞膜电位(电流)的方法，可以较快速的检测某一波段刺激光某参数下能否诱发待测细胞的光电流产生的特异性效应，并根据渐进式扫描方式找到光电流激发的光参数阈值。

所述方法中光参数在一定范围内从小到大渐进式扫描检测的策略如下：使用波长为A刺激光，每间隔一定时段，渐进改变光功率密度，测量细胞光电流响应。在其它参量保持不变条件下，每个刺激时段为E秒，每段光刺激功率密度变化值为b。假设功率密度检测范围为W，则光功率密度参数需变动次数n＝W/b，这组测量时间为t＝E·W/b，即对指定功率密度变化范围内整体测量时间为n·E秒。对于其他光参量(如：重复率、脉宽等)的渐进式调节测量，可以此类推。例如：在某实际测量中，采用450nm波长的脉冲激光，在200us的脉冲宽度下，重复率为11Hz，平均功率密度范围：0-12mJ/mm²，每次改变功率密度0.5mJ/mm²，每段光刺激持续时间为1s。此时细胞单波长这组多参数扫描式测量时间为：1×12/0.5＝1X24＝24秒。

实施例

在具体的实施方案中，以小鼠听觉神经细胞为待测细胞实施了本发明，所述方法包括以下步骤：

1.细胞培养和标本制备

选取C57/BL新生小鼠，解剖取出耳蜗中的螺旋神经节细胞，消化分离后置于放有细胞爬片的培养皿中进行离体培养，温度控制在37℃，气体环境为95％空气和5％CO₂，培养24小时以后备用。测试实验前，需配置细胞浴液、电极内液等测试过程中需要的溶液。测量时，将细胞爬片放入含有细胞浴液(人工脑髓液)的培养皿中，然后培养皿放置到显微镜载物台上。

2.光刺激装置参量设置

根据所需测量的光参数配置多参数可调节光刺激装置，使其能够在一定时间内按照光参数渐进调节方式进行刺激光的输出。如：激光波长选用450nm、515nm、808nm、980nm、1065nm等波段，重复率为1Hz，参考电脉冲刺激的典型脉冲宽度200μs，功率密度由0-30mJ/mm²以0.5mJ的步长渐进递增。

3.玻璃管微电极制作安装

玻璃管微电极，包括一个锥状的玻璃管和一个测量电极；具体制作，拉制玻璃管，使玻璃管的尖端直径约1-2μm，且尖端敞口，将测量电极的一端从尾部插入到玻璃管内，另一端与信号采集放大器相连，以电极内液充灌玻璃管微电极，将其装于微操作器上并旋紧；玻璃管微电极灌入电极内液后阻抗为5-10MΩ。将浸于细胞浴液的参考电极与信号采集放大器的信号接地端相连接；微电极中的电极内液通过测量电极和探头的信号端相连接。

其中此处的参考电极、测量电极均采用Ag/AgC l。

4.相界电位补偿和电极电阻的测量：

对电极施以小幅值(5mV)的方波电压脉冲，此时只看到零位电流基线上叠加有小的电容电流尖波；通过和微电极夹持器内部相通的塑料管对微电极内轻施正压，在微操纵器控制下使微电极进入浴液，电流基线将马上漂离零位，但由于负反馈调节作用又会逐渐漂回，基线上叠加有响应电流方波。调节相界电位补偿，令输出电流为零并根据脉冲电压方波引起的电流响应幅值测量微电极电阻。

5.细胞封接

选择表面光滑且透光度好的、状态良好的神经元进行实验，调节微操纵器使微电极尖端接近细胞表面并压紧细胞，将玻璃管微电极内正压释放，再施以负压，使封接电阻达GΩ级，此时方波电流缩至基线。

6.快电容补偿：

将电流放大倍数调高，调节设备参数进行快速电容电流补偿，使输出电流信号中的快电容电流成分消失。

7.光刺激下的细胞膜电流测量

正式进入细胞膜电流测量之前，将光刺激装置上输出光纤通过光纤固定仪固定，并微调其位置使其输出光辐照待测的细胞，随后启动光刺激设备，按照设置好的顺序开始输出刺激光，并同时开启细胞膜电流的测量。测量过程中，根据细胞活性及时更换待测细胞样品，分时段完成细胞膜电流的测量。

8.数据分析

检查分析测得膜电流数据，对比时间关系分析哪些光参数刺激条件下，膜电流有剧烈的变化。根据刺激光参数变化的时间序列关系找到相应的光刺激阈值和动态响应特性。多次重复并更换刺激光波长，以检测分析光调控细胞活动是否是特异性的。本实验在波长450nm光脉冲刺激时，测得上述细胞膜电位变化结果如图4所示。

上述检测方法可对天然细胞未知的光敏效应进行检测，也可用于验证转基因细胞在特定光敏蛋白对应波长光刺激下的细胞膜电位的测量。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。