一种对革兰氏阳性细菌具有广谱杀菌活性的多肽复合物
阅读说明：本技术 一种对革兰氏阳性细菌具有广谱杀菌活性的多肽复合物 (Polypeptide compound with broad-spectrum bactericidal activity on gram-positive bacteria ) 是由 刘丕龙 李龙 王利红 赵丽丽 严顺华 于 2021-10-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种对革兰氏阳性细菌具有广谱杀菌活性的多肽复合物,其由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示序列的多肽组合构成。一种对革兰氏阳性细菌具有广谱杀菌活性的多肽复合物来源于标准敏感型金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)。本发明所述的多肽复合物对革兰氏阳性细菌具有广谱杀菌活性,并对抗生素难以杀灭的耐甲氧西林细菌和耐万古霉素细菌具有杀灭作用。(The invention discloses a polypeptide compound with broad-spectrum bactericidal activity on gram-positive bacteria, which is composed of polypeptide combinations of sequences shown in SEQ ID No.1 and SEQ ID No. 2. A polypeptide complex having broad-spectrum bactericidal activity against gram-positive bacteria is derived from Staphylococcus aureus (ATCC 29213) which is a standard susceptible species. The polypeptide compound has broad-spectrum bactericidal activity on gram-positive bacteria and has a killing effect on methicillin-resistant bacteria and vancomycin-resistant bacteria which are difficult to kill by antibiotics.)
技术领域
本发明属于生物医学领域，一种对革兰氏阳性细菌具有广谱杀菌活性的多肽复合物。
背景技术
抗生素的大量使用导致临床病原菌进化出抗生素耐药性，耐药病原菌的出现极大降低了抗生素的杀菌效果和临床预期。近年来，国内外相关研究发现，不仅从生物体内提取的某些多肽具有生物活性，蛋白质经酶解处理后也会产生具有特殊功能的活性肽。
抗菌肽(Antimicrobial peptide，AMP)是一类具有抗菌活性的小分子蛋白质物质，广泛地分布在各类生物体内，是无脊椎动物、脊椎动物和植物等生物非特异性免疫的关键因子。抗菌肽因具有抗菌谱广泛、快速查杀靶细胞、热稳定性好，特别是对靶菌株不易产生耐药性等优势，被认为是未来取代抗生素的上佳选择。
本发明人研究一种对革兰氏阳性细菌具有广谱杀菌活性的多肽复合物属于抗菌肽，其能够杀灭包括耐药病原菌在内的多种细菌，且该多肽复合物未出现在已知的文献中，本领域普通技术人员难以通过现有文献知晓该多肽复合物用于杀灭细菌的有益效果。
发明内容
本发明目的在于提供一种对革兰氏阳性细菌具有广谱杀菌活性的多肽复合物，该多肽复合物能够有效杀灭包括耐药病原菌在内的多种细菌。
基于上述目的，本发明提供了一种对革兰氏阳性细菌具有广谱杀菌活性的多肽复合物，所述多肽复合物包含SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
进一步地，本发明提供的多肽复合物，所述SEQ ID No.1为：Lys-Lys-Leu-Lys-Ile-Glu-Glu-Leu-Lys-Lys-Phe-Asn-Gly-Gly-Asn-Lys-Trp-Gly-Ser-Ser-Ala-Ile-Gly-Ala-Met-Gly-Gly-Ala-Ala-Thr-Gly-Ile-Lys-Leu-Cys-Ser-Ala-Gly-Gly-Pro-Trp-Ala-Met-Ala-Gly-Cys-Gly-Val-Val-Gly-Gly-Ala-Ile-Gly-Gly-Phe-Thr-Gly-Tyr-His-Gly-Tyr。
进一步地，本发明提供的多肽复合物，所述SEQ ID No.2为：Met-Lys-Lys-Leu-Glu-Thr-Lys-Glu-Leu-Val-Ser-Ile-Asn-Gly-Gly-Lys-Lys-Asn-Thr-Trp-Gln-Gln-Asn-Val-Ser-Gly-Ala-Ile-Gly-Ser-Thr-Val-Ala-Gly-Ala-Gly-Leu-Gly-Gly-Ala-Ile-Cys-Gly-Pro-Ala-Cys-Ala-Val-Val-Gly-Ala-His-Tyr-Gly-Pro-Ile-Ile-Trp-Ala-Gly-Val-Ser-Gly-Ala-Thr-Gly-Ala-Phe。
进一步地，本发明提供的多肽复合物，来源于标准敏感型金黄色葡萄球菌(ATCC29213)。
另外，本发明还提供了对革兰氏阳性细菌具有广谱杀菌活性的多肽复合物在杀灭细菌方面的应用，主要用于杀灭细菌，所述细菌包括革兰氏阳性细菌，所述细菌进一步包括耐甲氧西林的细菌和耐万古霉素的细菌。
与现有技术相比，本发明所述一种对革兰氏阳性细菌具有广谱杀菌活性的多肽复合物的有益效果或优点：
(1)与现有技术相比，本发明的主要贡献在于提供了革兰氏阳性细菌具有广谱杀菌活性的多肽复合物；
(2)本专利发明人对该多肽复合物进行了抗菌性试验，该多肽复合物能广谱杀灭革兰氏阳性菌；
(3)本专利所述多肽复合物能对目前广泛使用的抗生素产生耐药的革兰氏阳性细菌产生灭杀作用，特别是耐甲氧西林的细菌和耐万古霉素的细菌。
附图说明
图1为本发明所述多肽复合物的SephadexLH-20凝胶柱层析结果图；
图2为一种对革兰氏阳性细菌具有广谱杀菌活性的多肽复合物的杀菌效果图，其中MRSA(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；MRSH(Methicillin-resistant staphylococcus haemolyticus)为耐甲氧西林溶血葡萄球菌；GISA(Glycopeptide-intermediate Staphylococcus Aureus)为耐糖肽类抗生素金黄色葡萄球菌；
图3为洗脱峰4的Western blot结果图。
具体实施方式
下面，结合实施例对本发明的技术方案进行说明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例提供一种对革兰氏阳性细菌具有广谱杀菌活性的多肽复合物的提取、分离和鉴定试验。
(1)多肽复合物的提取
将标准敏感型金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)发酵液以4800r/min离心20min，取上清50mL置于100mL的烧杯中，并依次少量缓慢地向其中加入硫酸铵，至硫酸铵饱和度为80％，置于4℃冰箱过夜，用高速离心机以12000r/min，4℃离心20min，沉淀用20mmol/LTris-HCl缓冲液(pH7.5)溶解后转入处理过的透析袋，并置于20mmol/LTris-HCl缓冲液透析，用BaCl2检测不产生沉淀后，将液体取出冷冻干燥，测其活性。
(2)多肽复合物的分离和纯化
收集上述液体，以1秒/滴的流速，用20mmol/LTris-HCl缓冲液洗脱2～3个柱体积，待柱子平衡好后，以3％～4％的柱体积样品量上样，控制流速为15s/滴，2mL/管，并在波长为280nm紫外光下对每管物质进行检测，对各吸收峰进行收集，同时以S.aureus 3521为指示菌，对各峰活性进行检测，发现洗脱峰4(具体洗脱曲线如图1所示)具有显著抑菌活性。收集峰4经超滤浓缩后，进行反相C18柱层析。经活性检测后，洗脱组分中以体积分数为15％的乙腈(含质量分数为0.5％的TFA)洗脱的组分为目的肽所在组分。
(3)多肽复合物的鉴定
收集洗脱峰4对应的洗脱液，利用Western blot鉴定发酵液中的总蛋白、粗制品(与亲和层析柱不结合的蛋白)和对革兰氏阳性细菌具有广谱杀菌活性的多肽复合物(洗脱峰4对应的洗脱液)，得到图3。由图3可知，纯化所获得第4波峰的蛋白确系目的蛋白，即对革兰氏阳性细菌具有广谱杀菌活性的多肽复合物，目的蛋白样品的含量为97μg/g。
实施例2
本实施例提供一种对革兰氏阳性细菌具有广谱杀菌活性的多肽复合物的杀菌试验。
试验使用菌种为标准敏感型金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)，其培养液中产生所述一种对革兰氏阳性细菌具有广谱杀菌活性的多肽复合物，受试菌种包括S.aureus 3521、S.aureus 1611、S.aureus Mu50、S.aureus Mu50 ΔrecA、S.heamolyticus NW19、S.heamolyticus 5211、S.aureus 1511、S.aureus 3821、S.aureus E48、S.agnetis 1932、S.epidermidis 2311、S.warneri 3511、Bacilus licheniformis CK1、Bacillus subtilis1A747、E.coli K88、E.coli DH5a。试验将标准敏感型金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)菌种和待受试菌种挑取菌落接种于灭菌试管中的MH肉汤，37℃，250r/min过夜培养。将培养后的菌液取30L转接至3mL新鲜MH肉汤液体培养基中，37℃，250r/min恒温震荡培养2～5h至对数生长期。取含所述一种对革兰氏阳性细菌具有广谱杀菌活性的多肽复合物的ATCC 29213培养液100μL滴于固体(琼脂)培养皿中央，将各待受试菌种分别涂于培养皿周围，于37℃培养过夜后观察杀菌效果，并测量并记录菌液的抑菌圈直径大小，具体如图2和表1所述。
图2说明了一种对革兰氏阳性细菌具有广谱杀菌活性的多肽复合物对各受试菌种的杀菌效果，表1为一种对革兰氏阳性细菌具有广谱杀菌活性的多肽复合物在试验过程中对各受试菌种抑菌带的宽度。
表1，一种对革兰氏阳性细菌具有广谱杀菌活性的多肽复合物抑菌带宽度
受试菌种
抑菌带宽度(mm)
S.aureus 3521
5
S.aureus 1611
8
S.aureus Mu50
2.4
S.aureus Mu50 ΔrecA
7.2
S.heamolyticus NW19
4.8
S.heamolyticus 5211
11
S.aureus 1511
14
S.aureus 3821
12
S.aureus E48
4.5
S.agnetis 1932
9
S.epidermidis 2311
8
S.warneri 3511
10
Bacilus licheniformis CK1
4
Bacillus subtilis 1A747
15
E.coli K88
5
E.coli DH5a
4
从表1和图2结果可以看出，所述一种对革兰氏阳性细菌具有广谱杀菌活性的多肽复合物对革兰氏阳性细菌具有广谱杀菌活性，特别对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林溶血葡萄球菌和耐糖肽类抗生素金黄色葡萄球菌此类抗生素难以发挥作用的细菌也有较好的灭杀效果。
实施例3
本实施例提供一种对革兰氏阳性细菌具有广谱杀菌活性的多肽复合物的稳定性试验。
(1)浓度对多肽复合物的杀菌活性影响
分别取浓度为250、125、62.5、31.25mg/mL的多肽复合物1.0mL，分装到4个离心管中，以大肠杆菌为指示菌。将指示菌接种于LB液体培养基中，37℃恒温培养24h。取过滤除菌后的样液100μL，加LB培养基30μLL和菌悬液70μL(菌悬液浓度为103～104CFU/mL)，混匀，37℃、150r/min摇床孵育1h，取100μL倾注于固体培养基平板，37℃培养过夜，计算菌落数。以去离子水为对照组，计算抑菌率。试验重复3次，结果取平均值，试验结果见表2。
抑菌率(％)计算方式如下：
表2，浓度对多肽复合物的杀菌活性影响
由表2可知，经超滤后的多肽复合物对大肠杆菌的抑菌活性随着浓度的增加而增强，在浓度为31.25mg/mL时仍具有明显的抑菌作用。
(2)pH对多肽复合物的杀菌活性影响
取浓度为125mg/mL的多肽复合物1.0mL，分装到6个离心管中，用调配好的pH值为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0的溶液1.0mL加入到离心管中，混匀，另取1试管则加入去离子水做对照，室温放置1h后，以大肠杆菌为指示菌，按照浓度对多肽复合物的杀菌活性影响中的方法进行抑菌试验，试验结果见表3。
表3，pH对多肽复合物的杀菌活性影响
pH
抑菌率(％)
2
40.63±1.76
4
54.50±1.15
6
64.29±3.46
8
63.17±1.32
10
54.83±3.38
12
40.47±1.16
对照
68.82±1.84
从表3可以看出，多肽复合物在pH为2.0～12.0的条件下均具有较高的抑菌活性，表明该多肽复合物具有很强的耐酸碱性。
(3)温度对多肽复合物的杀菌活性影响
取浓度为125mg/mL的多肽复合物1.0mL，分装到5个离心管中，分别在0、20、40、60、80℃的条件下水浴10min，另取1个离心管装未处理的样品做对照，以大肠杆菌为指示菌，按照浓度对多肽复合物的杀菌活性影响中的方法进行抑菌试验，试验结果见表4。
表4，温度对多肽复合物的杀菌活性影响
温度(℃)
抑菌率(％)
0
58.83±1.93
20
56.03±1.31
40
60.52±3.04
60
60.60±4.03
80
58.52±2.23
对照
60.25±1.88
从表4中可以看出，多肽复合物在0～80℃范围内处理10min后，对大肠杆菌的抑菌率随温度的升高呈先降低后升高再降低的趋势，抑菌率基本保持在54％～64％之间。不过方差分析表明，不同温度处理后的多肽复合物的抑菌活性差异性不显著(p>0.05)；LSD表明，处理组与对照相比没有显著性差异，说明起作用的多肽复合物无论在低温还是高温条件下都具有极好的稳定性。
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。
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