一种猪干扰素-α8突变体及其制备方法
阅读说明：本技术 一种猪干扰素-α8突变体及其制备方法 (Porcine interferon-alpha 8 mutant and preparation method thereof ) 是由 付伟 高小平 代燕平 李晟 罗弟祥 于 2020-05-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种猪干扰素-α8(PoIFN-α8)突变体及其制备方法。该突变体具有(1)在第18位上将丙氨酸由脯氨酸取代和第21位上将丝氨酸由缬氨酸取代；(2)在101位点上将Asp置换为Asn,形成N-连接型糖蛋白的Asn-X-Ser糖基化修饰；(2)本发明还涉及PoIFN-α8突变体的应用,注射给药后,可显著增加PoIFN-α8突变体的血药浓度-时间曲线下面积。(The invention discloses a porcine interferon-alpha 8 (PoIFN-alpha 8) mutant and a preparation method thereof. The mutant has (1) an alanine substituted with proline at position 18 and a serine substituted with valine at position 21; (2) the Asp is replaced by Asn at the 101 site to form Asn-X-Ser glycosylation modification of the N-linked glycoprotein; (2) the invention also relates to application of the PoIFN-alpha 8 mutant, and after injection administration, the area under a blood concentration-time curve of the PoIFN-alpha 8 mutant can be obviously increased.)
说明书
技术领域
本发明涉及生物兽医药技术领域，具体涉及一种PoIFN-α8突变体及其制备方法。
发明背景
干扰素(interferon，IFN)与其受体结合，诱导细胞产生具有酶活性的抗病毒蛋白，进而发挥抗病毒和免疫调节等作用。IFN诱导的抗病毒活性存在种属差异性和亚型差异性，猪干扰素(pocrine interferon,PoIFN)主要分为I型、II型和III型，I型包括IFN-α、β、δ、ω和τ，IFN-γ为II型，而IFN-λ属于III型，猪干扰素I型抗病毒活性最强，其中IFN-α的抗病毒作用最广、效果最显著。重组PoIFN-α1具有良好的生物活性，已被广泛用于抗病毒制剂，另有报道PoIFN-α8也具有高抗病毒活性，且抗水泡性口炎等部分病毒作用明显强于IFN-α1，因此PoIFN-α8也具有极为重要的临床应用价值。
重组制备的IFN-α及分离获得的天然IFN-α均具有半衰期短、清除快的局限，且重组IFN-α(recombinant IFN-α,rIFN-α)的抗病毒活性仍不理想。中国专利(CN104818283B)公开了一种优化的PoIFN-α8基因及其表达方法，虽然使PoIFN-α8在原核中以可溶性表达，但原核表达的PoIFN-α8不能进行糖基化修饰。无糖基化修饰干扰素因其半衰期短，需要长时间的频繁给药，因此其临床应用受到限制。因此，提高干扰素的半衰期是治疗领域的发展方向。目前，能延长半衰期的干扰素主要为PEG化形式，例如和已在临床用于乙型肝炎和丙型肝炎的治疗。此外，在干扰素分子中引入或置换N-糖基化修饰位点也是延长重组干扰素血浆半衰期的有效手段。如对人干扰素-a(huIFN-a)引入4-5个N-糖基化修饰(Ceaglio,N等；2008)，通过皮下注射并与非N-糖基化修饰的huIFN-a比较，可使血浆半衰期明显延长。
为了延长PoIFN-α8的血浆半衰期，本发明针对PoIFN-α8分子的Asp-X-Ser序列，将Asp(第101位)置换为Asn，形成N-连接型的Asn-X-Ser糖基化修饰。此外，本专利发明人应用CHO细胞表达体系发现，携带自身信号肽的PoIFN-α8能在CHO细胞中成功表达和分泌，但因自身信号肽的酶切割特异性差，使PoIFN-α8的表达产量不能达到产业化要求。因此，进一步将PoIFN-α8的信号肽实施突变，使PoIFN-α8在CHO细胞中实现高效表达和分泌。
发明内容
本发明提供一种PoIFN-α8突变体，所述的PoIFN-α8突变体是在第18位的丙氨酸(Ala)由脯氨酸(Pro)替换、第21位的丝氨酸(Ser)由缬氨酸(Val)替换和第101位的天冬氨酸(Asp)由天冬酰胺(Asn)替换，和在羧基末端增加6×组氨酸(His)。
本发明提供了一种PoIFN-α8突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
为获得本发明提供的一种PoIFN-α8突变体，本发明提供了一种PoIFN-α8突变体的制备方法，包括以下步骤：
(1)人工合成PoIFN-α8突变体核苷酸序列，在其两端分别引入内切酶位点Avr II和Pac I，并在ATG之前引入GCCACC序列，末端添加6×His序列，如SEQ ID NO:2所示。将人工合成的PoIFN-α8突变体核苷酸序列与改造优化的UCOE表达载体(pUCOE-M)连接，转化大肠杆菌，经表达、筛选和双酶切鉴定，构建pUCOE-M/rPoIFN-α8m表达质粒。
(2)将pUCOE-M/rPoIFN-α8m表达质粒线性化并分别电转至CHO细胞，优选CHO DG44细胞，采用无血清培养48h后，加入氨甲喋呤(MTX)至终浓度10nM，随后逐步增加至100-500nM；
(3)将MTX增加至500nM的细胞以相同密度接种至摇瓶，用商业化培养基连续培养并适当补加葡萄糖等营养添加物。于连续培养第12天收集上清，ELISA定量检测上清中的干扰素分泌量。
本发明的有益效果：
提供了一种PoIFN-α8突变体及其制备方法，与现有技术相比，一方面，本发明将101位点Asp置换为Asn，形成了Asn-X-Ser序列，使本发明在哺乳动物细胞中实现了糖基化修饰，延长了PoIFN-α8在血浆中的半衰期。另一方面，本发明将第18位Ala由Pro取代和第21位Ser由Val取代，第21位信号肽切割特异性消失，第23位信号肽切割的特异性提高，实现了PoIFN-α8突变体在哺乳动物细胞高效表达和分泌。
附图说明
附图用于进一步理解和解释本发明，但不构成对本发明的限制。
图1显示了rPoIFN-α8m质粒目的基因酶切产物鉴定
图2显示了rPoIFN-α8m蛋白表达水平
图3显示了纯化的rPoIFN-α8M的分子量
具体实施方式
实施例1 rPoIFN-α8突变体表达质粒构建和鉴定
从GenBank获得PoIFN-α8序列(登录号：GQ415062.1)，其氨基酸序列如SEQ ID NO3所示。将编码第18位丙氨酸的密码子突变为CCG，编码第21位丝氨酸的密码子突变为GTG，编码第101位天冬氨酸的密码子突变为AAT，并进行密码子偏好优化。在其5′端和3′端分别引入内切酶位点Avr II和Pac I，并在Avr II酶切位点之后、ATG之前引入GCCACC序列，末端添加6×His序列；人工合成PoIFN-α8突变体(PoIFN-α8M)基因，将其与改造优化的UCOE表达载体(pUCOE-M)连接，转化Top10感受态细胞，获得rPoIFN-α8M表达质粒；用Avr II和Pac I限制性内切酶对表达质粒进行双酶切，质粒酶切产物经1％琼脂糖凝胶鉴定(图1)显示，rPoIFN-α8M表达质粒构建成功，同时构建rPoIFN-α8表达质粒。
实施例2质粒转染和蛋白表达
采用Axygen Plasmid Max Kit试剂盒提取rPoIFN-α8M和rPoIFN-α8表达质粒，经Pvu I内切酶线性化后，参照Amaxa Cell Line NucleofectorTM Kit V试剂盒说明方法，分别将线性化的rPoIFN-α8m和rPoIFN-α8质粒稳定转染至CHO DG44细胞。转染后的细胞经无血清培养48h后，各加入含10nM MTX的选择培养基继续培养，随后逐步增加MTX浓度从100nM至500nM。
将MTX增加至500nM的细胞以相同密度接种至摇瓶，用商业化培养基Acti Pro连续培养12天(细胞密度均为5×105cells/ml，体积50ml)，在培养第3、6、8、10天分别补加5％Cell Boost 7a/7b，适量补加1％葡萄糖和1％的L-Glutamine。于培养第12天终止培养并分别收集各培养细胞上清，用ELISA方法定量rPoIFN-α。结果显示，信号肽突变引导的rPoIFN-α8m的表达产量明显升高，且随时间增加而升高，而带自身信号肽的rPoIFN-α8，其产量也随时间增加而提升，但明显低于rPoIFN-α8m的表达(图2)。
实施例3重组PoIFN-α8m的纯化
收集培养第12天的细胞上清，过滤后采用Ni柱亲和层析法进行蛋白纯化，获得rPoIFN-α8m样品，纯化的rPoIFN-α8m经非还原和还原SDS-PAGE电泳。根据电泳结果显示，重组细胞表达的rPoIFN-α8m分子量与理论预期一致，大约为20kDa(图3)，表明rPoIFN-α8m表达正确。
实施例4本发明的rPoIFN-α8m在大鼠体内的半衰期
取16只体重为220～250g的SD大鼠，分为两组，每组8只，分别静脉注射纯化的rPoIFN-α8m和rPoIFN-α8样品，注射剂量5mg/kg。分别在注射后0min、5min、10min、15min、30min、1h、2h、4h、8h、16h、24h、48h和96h眼眶静脉采血，室温放置30min，3500rpm低温离心10min分离血清，采用ELISA检测血液中rPoIFN-α8m含量。用DAS药动学软件进行曲线拟合并计算参数，结果显示：与rPoIFN-α8相比，本发明提供的rPoIFN-α8m半衰期明显增长，血药含量明显增加(表1)。
表1 rPoIFN-α8m静脉注射后血清中主要动力学参数
序列表
<110> 成都彤琦恩生物科技有限公司
<120> 一种猪干扰素-α8突变体及其制备方法
<130> 0
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 4
<211> 195
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Ala Pro Thr Ser Ala Phe Leu Thr Ala Leu Val Leu Leu Ser Cys
1 5 10 15
Asn Pro Ile Cys Val Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu
20 25 30
Ala His Thr Arg Ala Leu Arg Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser
35 40 45
Pro Phe Ser Cys Leu Asp His Arg Arg Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu
50 55 60
Ala Leu Gly Gly Asn Gln Val Gln Lys Ala Gln Ala Met Ala Leu Val
65 70 75 80
His Glu Met Leu Gln Gln Thr Phe Gln Leu Phe Ser Thr Glu Gly Ser
85 90 95
Ala Ala Ala Trp Asn Glu Ser Leu Leu His Gln Phe Cys Thr Gly Leu
100 105 110
Asp Gln Gln Leu Arg Asp Leu Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Ala Gly
115 120 125
Leu Glu Gly Thr Pro Leu Leu Glu Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg
130 135 140
Lys Tyr Phe His Arg Leu Thr Leu Tyr Leu Gln Glu Lys Ser Tyr Ser
145 150 155 160
Pro Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Ala Glu Val Met Arg Ala Phe Ser
165 170 175
Ser Ser Thr Asn Leu Gln Asp Arg Leu Arg Arg Lys Glu His His His
180 185 190
His His His
195
<210> 5
<211> 588
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atggccccaa cctcagcctt cctcacggcc ctggtgctgc tcagctgcaa tccgatctgc 60
gtgctgggct gcgacctgcc tcagacccac agcctggctc acaccagggc cctgaggctc 120
ctggcacaaa tgaggagaat ctcccccttc tcctgcctgg accacagaag ggactttgga 180
ttcccccaag aggccttggg gggcaaccag gtccagaagg ctcaagccat ggctctggtg 240
catgagatgc tccagcagac cttccagctc ttcagcacag agggctcggc tgctgcctgg 300
aatgagagcc tcctgcacca gttctgcact ggactggatc agcagctcag ggacctggaa 360
gcctgtgtca tgcaggaggc cgggctggaa gggacccccc tgctggagga ggactccatc 420
ctggctgtga ggaaatactt ccacagactc accctctatc tgcaagagaa gagctacagc 480
ccctgtgcct gggagatcgt cagggcagaa gtcatgagag ccttctcttc ctccacaaac 540
ctgcaagaca gactcaggag gaaggagcac caccaccatc accactga 588
<210> 6
<211> 195
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Ala Pro Thr Ser Ala Phe Leu Thr Ala Leu Val Leu Leu Ser Cys
1 5 10 15
Asn Ala Ile Cys Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu
20 25 30
Ala His Thr Arg Ala Leu Arg Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser
35 40 45
Pro Phe Ser Cys Leu Asp His Arg Arg Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu
50 55 60
Ala Leu Gly Gly Asn Gln Val Gln Lys Ala Gln Ala Met Ala Leu Val
65 70 75 80
His Glu Met Leu Gln Gln Thr Phe Gln Leu Phe Ser Thr Glu Gly Ser
85 90 95
Ala Ala Ala Trp Asp Glu Ser Leu Leu His Gln Phe Cys Thr Gly Leu
100 105 110
Asp Gln Gln Leu Arg Asp Leu Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Ala Gly
115 120 125
Leu Glu Gly Thr Pro Leu Leu Glu Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg
130 135 140
Lys Tyr Phe His Arg Leu Thr Leu Tyr Leu Gln Glu Lys Ser Tyr Ser
145 150 155 160
Pro Cys Ala Trp Glu Ile Val Arg Ala Glu Val Met Arg Ala Phe Ser
165 170 175
Ser Ser Thr Asn Leu Gln Asp Arg Leu Arg Arg Lys Glu His His His
180 185 190
His His His
195
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：新的多肽及其医疗用途