一种制备抗人源TNF-α单克隆抗体的方法及其用途
阅读说明：本技术 一种制备抗人源TNF-α单克隆抗体的方法及其用途 (Method for preparing anti-human TNF-alpha monoclonal antibody and application thereof ) 是由 李治寰 林立龙 卢佳豪 于 2019-10-21 设计创作，主要内容包括：本发明属生命科学技术领域,具体为一种单克隆抗体的制备,该抗体可用于ELISA和免疫印迹等生物学研究实验。本发明还公开了上述单克隆抗体制备的过程以及在ELISA实验与Westerp blot实验中的检测效果。表明该抗体可用于ELISA和免疫印迹等生物学研究实验。(The invention belongs to the technical field of life science, and particularly relates to preparation of a monoclonal antibody, which can be used for biological research experiments such as ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) and immunoblotting. The invention also discloses the preparation process of the monoclonal antibody and the detection effect in an ELISA experiment and a Westernblot experiment. The antibody can be used for biological research experiments such as ELISA, immunoblotting and the like.)
技术领域
本发明属生命科学技术领域，具体为一种单克隆抗体的制备，该抗体可用于ELISA和免疫印迹等生物学研究实验。本发明还公开了上述单克隆抗体制备的过程以及在ELISA实验与Western blot实验中的检测效果。表明该抗体可用于ELISA和免疫印迹等生物学研究实验。
背景技术
肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)是一类可通过刺激细胞分泌白细胞介素-1诱导某些肿瘤细胞死亡的细胞因子。TNF既是促炎细胞因子又是抗炎细胞因子，对于自身免疫疾病、癌症和感染性病原体的相关研究和治疗具有重要意义。
作为TNF家族中的一员，TNF-α是一个主要由巨噬细胞分泌并主要与TNFRSF1A/TNFR1和TNFRSF1B/TNFBR 结合的细胞因子。编码TNF-α蛋白的基因位于染色体的6p21.3位置上。最初TNF-α蛋白被鉴定为动物经脂多糖诱导后，血清中产生的引起肿瘤死亡的介质。研究发现，TNF-α异常表达与类风湿性关节炎、银屑病关节炎和炎性肠病的发展相关，也与乳腺癌、肝癌和皮肤癌的发生有密切联系。抑制TNF-α活性在这些疾病的治疗上取得一定的效果，因此，对于TNF-α的结构、生物学功能的研究及其抑制剂的开发成为炎症和肿瘤研究的重大课题。
在生物学研究中，抗体被广泛应用于抗原定性定量分析。其中单克隆抗体可被用于分析抗原的细微结构及检验抗原抗体未知的结构关系。新的、高效价比的抗TNF-α单克隆抗体可为TNF-α相关研究提供有效的工具。杂交瘤技术制备鼠源性单克隆抗体是一种非常成熟的抗体制备技术，但也存在制备周期长、成本较高、抗体效价低导致抗体效果不稳定等问题。基于上述局限，本发明使用一种新的TNF-α抗原，采用独特的杂交瘤技术制备一种高效价的抗TNF-α单克隆抗体。
发明内容
本发明的目的是提供一种单克隆抗体。该抗体为抗人源性TNF-α蛋白的单克隆抗体。
本发明的另一目的是提供制备高效价抗人源性TNF-α蛋白的抗体的制备流程以及方法。
本发明的另一目的是表明用该方法制备的抗TNF-α蛋白的抗体可用于ELISA和免疫印迹等生物学研究实验。该抗体在ELISA和免疫印迹实验中有良好的效果。
附图说明
图1 TNF-α蛋白与其他蛋白相互作用的信号网络。
图2 TNF-α单克隆抗体制备路线图。
图3 TNF-α单克隆抗体用于Western blot检测应用(免疫血清Serum是稀释10万倍的上述3次免疫后血清，Isotype是2C11的同型对照抗体)。
图4 TNF-α单克隆抗体能用于ELISA实验(免疫血清Serum是稀释10万倍的上述3次免疫后血清，Isotype 是2C11的同型对照抗体)。
具体实施方式
1 TNF-α单克隆抗体的制备
生产TNF-α蛋白抗原(发明专利CN201210572674.X)，免疫雌性BALB/c小鼠(6周龄)。首次免疫使用弗氏完全佐剂进行抗原乳化，皮下6点注射，每只小鼠注射的抗原量为100μg。14天后，进行第二次免疫，使用弗氏不完全佐剂乳化抗原，皮下6点注射，每只小鼠注射的抗原量为100μg。14天后，进行第 3次免疫，方法同二次免疫。14天后，对小鼠剪尾采集少量血液进行血清效价ELISA检测，选择抗体滴度最高(1∶500000)的小鼠进行加强免疫，无需乳化，通过腹腔注射抗原蛋白，每只小鼠注射100μg。
第4次免疫后3～5天，处死小鼠取其脾细胞与SP2/0细胞融合，通过HAT培养基(HATSupplement(50X)， Gibco)培养获得稳定的杂交瘤细胞。通过ELISA法筛选得到能分泌TNF-α抗体的杂交瘤细胞，通过有限稀释的方法进行亚克隆，ELISA法筛选得到能分泌TNF-α抗体的单克隆杂交瘤细胞株2C11，通过逐级扩大培养，液氮冻存保种。
制备和纯化腹水抗体：雌性BALB/c小鼠(8周龄)腹腔注射弗氏不完全佐剂，每只小鼠注射0.5ml， 3～5天后腹腔注射处于对数生长期的杂交瘤细胞2C11，每只小鼠注射5×105个细胞(0.5ml)。10天后处死小鼠，获得腹水。5000rpm，4℃离心10min，去除沉淀，用10倍体积1×PB溶液稀释腹水，混匀后过 0.45μm滤膜。通过Protein G(Protein G Sepharose 4Fast Flow，GE Healthcare)亲和纯化腹水，得到纯化的TNF-α抗体。
2 TNF-α单克隆抗体的Western blot检测应用
TNF-α蛋白加5×loading buffer混合后，煮沸变性6min，跑SDS-PAGE，每孔上样20μl，10ng蛋白/孔，400mA转膜1h，5％脱脂奶粉室温封闭1h，加入2C11抗体(1μg/ml)37℃孵育1小时，PBST洗3 遍后加入1∶5000稀释羊抗鼠IgG二抗(A0413，上海碧云天生物技术有限公司)，室温孵育30min，PBST 洗3遍后加入Western HRP底物(WBLUR0500，Millipore)显影。
3 TNF-α单克隆抗体的ELISA应用
TNF-α蛋白按照每孔100ng加样到96孔酶标版，37℃孵育3小时，PBST洗3遍后加5％脱脂奶粉室温封闭1h，加入2C11抗体(1μg/ml)37℃孵育1小时，PBST洗3遍后加入1∶5000稀释羊抗鼠IgG二抗(A0413，上海碧云天生物技术有限公司)，室温孵育30min，PBST洗3遍后加入加入TMB显色液显色5分钟，加入 2M硫酸终止反应，在全波长分光光度计(Thermo)分析450nm的OD值。
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