具体实施方式

以下将详细说明本发明的各种示例性实施例、特征和方面。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

另外，为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

如无特殊声明，本说明书中所使用的单位均为国际标准单位，并且本发明中出现的数值，数值范围，均应当理解为包含了工业生产中所不可避免的系统性误差。

本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。

本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。

本说明书中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。

本说明书中，使用“v/v”表示体积百分比含量，使用“wt％”为质量百分比含量。

另外，本说明书中，所述“水”包含去离子水、蒸馏水、离子交换水、双蒸水、高纯水、纯净水等能够使用的任何可行的水。

本说明书中，使用“常温”、“室温”时，其温度可以是10-40℃。

天然胶原材料

本公开的第一方面提供了一种天然胶原材料，所述天然胶原材料包括I型胶原蛋白和III型胶原蛋白；以所述天然胶原材料的总质量计，所述I型胶原蛋白的含量为30-35％，所述III型胶原蛋白的含量为65-70％；

所述天然胶原材料来源于小肠粘膜下层，优选为猪小肠粘膜下层。

本公开的天然胶原材料以小肠粘膜下层(Small Intestinal Submucosa，SIS)为原料获得，提取的胶原中III型胶原含量较高，为补充胶原蛋白流失提供了一种天然、安全、免疫原性低的胶原蛋白来源，适合作为皮肤胶原蛋白的补充材料。天然胶原材料在施用于受损或衰老皮肤后，能够发挥紧致皮肤、恢复皮肤弹性的功效，使皮肤细致、有光泽，有效改善受损皮肤状态、延缓皮肤衰老。

在一些优选实施方式中，天然胶原材料来源于猪小肠粘膜下层，该组织中含有较高含量的III型胶原蛋白，适合作为修复皮肤弹性的皮下填充材料。

在一些实施方式中，本公开提供的天然胶原材料，免疫源物质的含量低，其中DNA残留量低于4ng/mg，采用酶联免疫竞争法方法检测α-半乳糖苷酶(α-Gal)，其残留量低于α-半乳糖苷酶检测试剂盒检测限1.0U/L。天然胶原材料免疫源物质的含量低，生物安全性高，适合向皮下组织植入，作为填充材料修复受损、衰老皮肤，恢复皮肤弹性。

天然胶原材料的制备方法

本公开的第二方面提供了天然胶原材料的制备方法，包括如下步骤：

取小肠粘膜下层材料，依次进行病毒灭活处理、脱脂处理、脱细胞处理和酶解处理，得到胶原粗提溶液；

将胶原粗提溶液提纯、干燥，得到天然胶原材料。

本公开的制备方法通过对小肠粘膜下层材料的脱脂、脱细胞处理，能够有效去除核酸片段、细胞膜、细胞核碎片等细胞内成分，减少免疫源物质的残留。与传统的组织胶原提取方法相比，本公开的制备方法可有效简化对胶原的纯化处理步骤，能够制得III型胶原含量高、生物安全性高的天然胶原材料。与基因工程制备III型胶原的方法相比，本公开的制备方法具有成本低、步骤简单、易于操作等优势。

在一些实施方式中，应用本公开的制备方法，能够制得以总质量计，I型胶原蛋白的含量为30-35％，III型胶原蛋白的含量为65-70％的天然胶原材料，为皮肤修复、抗衰老提供了一种III型胶原蛋白与I型胶原蛋白合理配比的天然胶原材料。

在一些实施方式中，对于小肠粘膜下层材料，是去除了小肠的粘膜层和筋膜层后，留取的中间的小肠粘膜下层材料。小肠粘膜下层材料用清水洗净后用于后续处理。

当计量小肠粘膜下层材料体积时，为将清洗后的材料在不锈钢网上静置1-5min后放入量筒计量。

在一些实施方式中，所述病毒灭活处理的步骤包括：将小肠粘膜下层材料清洗后浸泡于病毒灭活溶液中，在振荡条件下进行病毒灭活处理。

对于病毒灭活溶液，是包含(0.5-5)％(v/v)过氧乙酸和(20-25)％(v/v)乙醇的水溶液。示例性的，病毒灭活溶液中过氧乙酸的含量为0.8％(v/v)、1％(v/v)、1.5％(v/v)、2％(v/v)、2.5％(v/v)、3％(v/v)、3.5％(v/v)、4％(v/v)、4.5％(v/v)等等；病毒灭活溶液中乙醇的含量为21％(v/v)、22％(v/v)、23％(v/v)、24％(v/v)等等。在一些优选的实施方式中，病毒灭活溶液是包含1％(v/v)过氧乙酸和24％(v/v)乙醇的水溶液。

按照小肠粘膜下层材料与病毒灭活溶液为(0.5-5):30的体积比，例如，0.8:30、1:30、2:30、3:30、4:30等等。在一些优选的实施方式中，小肠粘膜下层材料与病毒灭活溶液的体积比为1:30。将小肠粘膜下层材料浸泡于病毒灭活溶液，振荡条件下浸泡。小肠粘膜下层材料在病毒灭活溶液中浸泡的时间为1-5h，优选浸泡2h，振荡的速率为40r/min。浸泡后的小肠粘膜下层材料用水进行清洗。振荡可以通过摇床、磁搅拌子等方式实现。

通过上述的病毒灭活处理，可有效灭活小肠粘膜下层材料中的病毒成分，并能进一步降低细菌内毒素含量，保证天然胶原材料的生物安全性。

在一些实施方式中，脱脂处理的步骤包括：将病毒灭活处理后的小肠粘膜下层材料浸泡于脱脂溶液中，在超声条件下进行脱脂处理。

进一步的，脱脂溶液为1-2wt％的碱性脂肪酶溶液。示例性的，碱性脂肪酶溶液的浓度为1wt％、1.2wt％、1.4wt％、1.5wt％、1.7wt％、2wt％等。在一些优选的实施方式中，脱脂溶液的pH为7-10，例如，pH为7、8、9、10等。按照小肠粘膜下层材料与脱脂溶液为(0.1-1):2的体积比，示例性的，小肠粘膜下层材料与脱脂溶液的体积比为0.1:2、0.2:2、0.5:2、0.8:2、1:2等等。优选地，小肠粘膜下层材料与脱脂溶液的体积比1:10，将小肠粘膜下层材料浸泡于脱脂溶液中，在超声条件下脱脂处理30-60min后更换脱脂液；重复操作3次以上，然后用水清洗小肠粘膜下层材料。

通过脱脂处理，可有效减少胶原粗提液中混入的非胶原杂质成分，从而简化后续的纯化处理工艺，避免胶原的损失。与现有将组织至于水中超声清洗的处理方式相比，本公开中选择2wt％的碱性脂肪酶溶液，能够更加有效地去除脂质等不需要的杂质成分，减少提取过程中胶原成分的损耗。

在一些实施方式中，脱细胞处理的步骤包括：将脱脂处理后的小肠粘膜下层材料浸泡于脱细胞溶液中，在超声条件下进行脱细胞处理。

对于脱细胞溶液，是包含0.02-0.05wt％胰蛋白酶和0.1-0.4wt％EDTA的磷酸盐缓冲液。示例性的，磷酸盐缓冲液中胰蛋白酶的含量为0.02wt％、0.03wt％、0.04wt％、0.05wt％等等，EDTA的含量为0.1wt％、0.2wt％、0.3wt％、0.4wt％等等。在一些优选的实施方式中，磷酸盐缓冲液中胰蛋白酶的含量为0.02wt％，EDTA的含量为0.1wt％。按照小肠粘膜下层材料与脱细胞溶液为(0.5-5):30的体积比，将小肠粘膜下层材料浸泡于脱细胞溶液，超声条件下浸泡30min。进一步的，是将小肠粘膜下层材料与脱细胞溶液按照1:30的体积比，在超声清洗机中浸泡30min。

超声后，将小肠粘膜下层材料清洗、干燥。在一些更为具体的实施方式中，干燥的处理条件是将小肠粘膜下层材料在37℃的温度条件下烘干24h。

本公开中脱细胞处理的条件温和，可以充分去除核酸、细胞膜、细胞核碎片等免疫源成分，降低天然胶原材料的免疫原性，使其适合植入皮下组织，并且避免胶原成分的损失。

现有的胶原提取工艺中，在得到胶原粗提液后，需要反复进行盐析-溶解的纯化操作，去除胶原中混有的核酸等杂质成分。这个过程会导致胶原蛋白的损失，并且由于使用了大量的中性盐，后期还需要进行清洗或透析，耗时长且操作过程复杂。而本公开通过结合脱脂、脱细胞处理，可将脂肪、核酸、α-Gal等免疫源物质降到最低，因此对胶原粗提溶液的纯化过程仅需要一次盐析和微孔滤膜过滤即可完成。

在一些实施方式中，酶解处理的步骤包括：取脱细胞的小肠粘膜下层材料，破碎后，浸泡于酸性溶液中；将浸泡后的小肠粘膜下层材料采用粉碎设备进行粉碎搅拌，加入胃蛋白酶，酶解处理后离心，去除沉淀，得到胶原粗提溶液。

进一步地，酸性溶液为0.1-1mol/L的醋酸溶液，示例性的，醋酸溶液的浓度为0.2mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.7mol/L、0.8mol/L等。作为优选，醋酸溶液的浓度为0.5mol/L。将烘干的小肠粘膜下层材料剪碎后，按照小肠粘膜下层材料与酸性溶液的体积比为(0.5-5):30，例如，0.8:30、1:30、2:30、3:30、4:30等等。在一些优选的实施方式中，按照1:30的体积比将小肠粘膜下层材料浸泡于酸性溶液中。在一些优选地实施方式中，小肠粘膜下层材料在4-10℃的低温下浸泡于酸性溶液中12h，以促进胶原蛋白的溶解。

对于酶解处理，是将浸泡后的小肠粘膜下层材料用粉碎机低温粉碎搅拌5min，然后按照胃蛋白酶与小肠粘膜下层材料的质量比为1:(8-12)的比例，向酸性溶液中加入胃蛋白酶，低温(4-10℃)机械搅拌48-96h，使小肠粘膜下层材料中的胶原蛋白充分溶解，以提高对III型胶原蛋白及I型胶原蛋白的提取效率。在一些优选的实施方式中，胃蛋白酶与小肠粘膜下层材料的质量比为1:10；向酸性溶液中加入胃蛋白酶后，低温机械搅拌的时间为72h。

酶解处理后，对混合溶液进行离心，所得上清液即为溶解有胶原蛋白的胶原粗提溶液。

在一些实施方式中，提纯的步骤包括：将胶原粗提溶液一次过滤后进行盐析处理，得到沉淀颗粒；将沉淀颗粒溶解于酸性溶液中，二次清洗、溶解，并通过膜分离过滤、浓缩，得到包含天然胶原材料的胶原浓缩液。

进一步地，酸性溶液为0.5mol/L的醋酸溶液，以充分溶解沉淀颗粒中的天然胶原材料。

对于过滤，是采用微滤膜过滤溶液，以过滤掉溶液中的颗粒。其中，一次过滤的微滤膜孔径为0.2-0.4μm，通过一次过滤可以去除胶原粗提溶液中的不溶性的颗粒。二次清洗后过滤的滤膜孔径为0.05-0.1μm，通过二次清洗后过滤可以去除多余的小分子杂质，提高胶原浓缩液的纯度。本公开中的提纯步骤，只需去除胃蛋白酶和材料中残余的非胶原成分，因此，仅需一次盐析和微孔滤膜过滤即可完成对胶原粗提溶液的提纯，具有步骤简单、对胶原损耗少的优势。

在一些实施方式中，通过对胶原浓缩液进行冷冻干燥处理，得到天然胶原材料。

本公开提供的制备方法，通过各步骤的相互作用，以及对各步骤的处理条件进行优化，可简化纯化工艺，实现对小肠粘膜下层材料中胶原蛋白的高效提取，得到包含65％-70％的III型胶原蛋白以及30％-35％的I型胶原蛋白的天然胶原材料。天然胶原材料中III型胶原蛋白的比例高，免疫源物质的含量低、生物安全心高，并呈疏松、多孔结构，适合细胞的黏附、生长；天然胶原材料保持胶原蛋白的三螺旋构象，具有高的胶原蛋白活性，适合作为皮下填充材料，用于修复受损、衰老的皮肤。

皮下填充剂

本公开的第三方面提供了一种皮下填充剂，包括根据第一方面所述的天然胶原材料，或根据第二方面的方法制备的天然胶原材料。

天然胶原材料的用途

本公开的第四方面提供了天然胶原材料的用途，在一些实施方式中，天然胶原材料作为或制备医疗美容材料。在一些具体的实施方式，医疗美容材料为皮下填充剂。天然胶原材料可以与一种或多种辅料混合，被制作成任何可施用的剂型。示例性的，辅料包括溶剂、增稠剂、助溶剂、乳化剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、pH调节剂、稳定剂、表面活性剂等等。在一些优选的实施方式中，皮下填充剂为注射剂。

在另外一些实施方式中，天然胶原材料用于制备护肤品。护肤品可以是贴片型、水剂型、凝胶型、乳液型或霜剂型等。

本公开中的天然胶原材料，其III型胶原蛋白和I型胶原蛋白的配比接近婴儿期皮肤，具有高含量的III型胶原蛋白，适用于皮下填充，能够有效恢复皮肤弹性，紧致肌肤，增加皮肤水润、光泽度。

实施例

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

本实施例提供天然胶原材料的制备方法，包括如下步骤：

(1)清洗预处理：在室温下，刮除小肠的粘膜层和筋膜层，留取中间小肠粘膜下层，将材料使用纯化水清洗备用。

(2)病毒灭活：配制病毒灭活水溶液(1％(v/v)过氧乙酸+24％(v/v)乙醇)，将清洗后的小肠粘膜下层材料浸泡在病毒灭活溶液中，小肠粘膜下层材料与溶液比例为1:30，放置在摇床上，室温下浸泡2h，摇床速率为40r/min。浸泡完后采用纯化水清洗。

(3)脱脂：配置浓度为2wt％的碱性脂肪酶溶液，将病毒灭后的小肠粘膜下层材料浸泡在脱脂溶液中，小肠粘膜下层材料与脱脂液的比例为1:10(v:v)，在超声清洗机中超声浸泡30min，置换脱脂溶液，反复操作3次。纯化水清洗小肠粘膜下层材料。

(4)脱细胞：配制脱细胞磷酸盐缓冲液(0.025wt％胰蛋白酶+0.19wt％EDTA)，将小肠粘膜下层材料转移至脱细胞溶液中，小肠粘膜下层材料与脱细胞溶液比例为1:30(v:v)，在超声清洗机中超声浸泡30min，超声后采用纯化水清洗，将小肠粘膜下层材料放置在37℃烘箱中干燥24h。

(5)酸浸泡：将烘干后的小肠粘膜下层材料裁剪成大约1cm²的碎片，采用0.5mol/L的醋酸溶液4℃浸泡脱细胞后的小肠粘膜下层材料12h，小肠粘膜下层材料与脱细胞溶液比例为1:30(v:v)。

(6)酶解：将浸泡后的小肠粘膜下层材料用粉碎机低温粉碎搅拌5min，在溶液中加入胃蛋白酶(胃蛋白酶与小肠粘膜下层材料质量比为1:10)，低温机械搅拌72h。酶解后将混合液离心处理，8000r/min，离心10min，取上清液即为粗提胶原溶液。

(7)纯化：将粗提胶原溶液采用微滤膜处理，先用孔径为0.2-0.4微米的滤膜过滤掉不溶颗粒。采用中性盐氯化钠或者硫酸铵进行盐析，盐析后离心取沉淀颗粒，蒸馏水清洗后采用0.5mol/L的醋酸进行溶解，再采用孔径为0.05-0.1微米的超滤膜进行浓缩处理，去除多余的小分子杂质，得到高纯度的胶原浓缩液。

(8)干燥：将高纯胶原浓缩液冷冻干燥，得到天然胶原材料。将胶原浓缩液放入冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司，FD-1A-50)冷阱中进行预冷60-120min，预冷后开启真空泵，进行真空干燥，冷阱温度设定为-35℃至-45℃，例如-37℃、-38℃、-40℃、-42℃、-44℃等等。优选地，冷冻干燥的温度为-40℃。通过冻干步骤得到天然胶原材料。

天然胶原材料中DNA残留量低于4ng/mg，采用酶联免疫竞争法方法检测α-半乳糖苷酶(α-Gal)，其残留量低于α-半乳糖苷酶检测试剂盒检测限1.0U/L。

性能测试

对实施例1制备的天然胶原材料进行如下测试：

1、SEM分析

剪取适量大小合适的天然胶原材料，粘贴于样品台上，使用扫描电镜观察胶原海绵表面形貌，加速电压设定为10kV。

用SEM研究了冻干的天然胶原材料的微观结构和形态。如图1所示，SEM显示高度互连的多孔结构，天然胶原材料总体呈现疏松、多孔的结构,还可见部分纤维化结构的存在孔径范围为150-500μm，适合细胞的黏附、生长。

2、傅里叶变换红外光谱检测

称取约2mg天然胶原材料，液氮冷冻研磨粉碎，与200mg溴化钾混合均匀，研磨完全后在15MPa下压片制样，使用红外光谱仪在4000～400cm^-1进行红外光谱扫描，扫描64次，分辨率为4cm^-1。

图2示出了天然胶原材料的傅里叶变换红外光谱图。胶原蛋白红外谱图中在3293.53cm^-1附近是N-H的伸缩振动吸收峰，1634.48cm^-1附近是酰胺Ⅰ带的C＝O伸缩振动吸收峰，1545.88cm^-1附近是酰胺Ⅱ带的N-H弯曲振动吸收峰。1450和1230cm^-1附近吸收峰比值大于0.5，表示胶原蛋白三螺旋结构的完整性。胶原蛋白在1455.99和1236.05cm^-1处峰强度的比值为1.02，是胶原蛋白的特征值。

3、紫外-可见吸收光谱法

冻干胶原溶解于0.5mol/L醋酸溶液中，使胶原溶液浓度达到0.5mg/mL，以0.5mol/L HAC溶液作对比，使用紫外分光光度计扫描胶原溶液在200～400nm波长区间内的紫外吸收光谱。

图3示出了天然胶原材料的紫外-可见吸收光谱图。在波长235nm附近产生较大的光吸收。胶原蛋白的紫外光谱图实际上是蛋白质分子的各种紫外生色基团加和的结果，由于Ⅰ型胶原蛋白中具有含苯环结构的羟脯氨酸和脯氨酸，使其最大紫外吸收峰在235nm处，这与文献报道的Ⅰ型胶原蛋白的紫外吸收特征峰相符。该吸收峰的出现主要是由于肽链中羰基的n→π*跃迁产生的。

4、圆二色谱分析(CD)

配制浓度为20μg/mL的胶原溶液，使用圆二色谱仪在180～260nm范围内进行扫描。设置参数：液池厚度1mm，扫描速度10nm/min，扫描温度19℃，狭缝宽度1.5nm。

在远紫外区域，胶原蛋白的CD光谱中，在222nm处具有最大正峰值，在197nm处具有最大负峰值，并且交叉点在约213nm处。正峰与负峰的比率(Rpn)是三螺旋结构构象所独有的，可用于鉴定三螺旋构象。

具有三螺旋结构的胶原蛋白的Rpn范围为0.09～0.15。图4示出了天然胶原材料的圆二色谱图，色谱图符合胶原蛋白的特征，其Rpn值为0.112，表明胶原蛋白三螺旋结构的完整性。结果显示，纯化过程不会损害胶原蛋白的三螺旋构象。

5、胶原成分分析

本实验采用高效液相色谱-质谱联用技术，将样品中胶原用胰蛋白酶特异性降解，再通过高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用技术检索和识别I、III型胶原的特征多肽，对其进行定量分析，可识别材料中不同类型胶原并准确定量。将标准品和样品分别变性并酶解，采用HPLC-MS检测酶解物。其中，取冻干后的天然胶原材料，粉碎后称取10mg，加入NH₄HCO₃缓冲液(50mM，pH 8.0)配置成1mg/mL的溶液。在100℃下变性10min，冷却至室温后按照胶原与胰蛋白酶为50:1的质量比例加入胰蛋白酶，37℃酶解16h，酶解产物直接通过HPLC-MS检测其中胶原成分。通过针对检测结果的分析，天然胶原材料包含质量百分含量65％-70％的III型胶原蛋白以及质量百分含量30％-35％的I型胶原蛋白。

本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的举例，而并非是对本公开的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本公开的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本公开权利要求的保护范围之内。