一种多重耐受性酿酒酵母菌株及其构建方法和应用
阅读说明：本技术 一种多重耐受性酿酒酵母菌株及其构建方法和应用 (Multiple-tolerance saccharomyces cerevisiae strain and construction method and application thereof ) 是由 汤岳琴 王莉 谢采芸 苟敏 孙照勇 夏子渊 于 2021-09-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种多重耐受性酿酒酵母菌株及其构建方法和应用,所述酿酒酵母菌株保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心,保藏名称为SEB17,其保藏号为：CGMCC NO.22587,构建方法为：以菌株SEB14为出发菌株,将菌株SEB14的功能基因ENA5的启动子替换为TEF1的启动子,构建菌株SEB17。本发明所述菌株SEB17具有多重耐受性,同时具有耐受高乙醇、高温、高糖、高盐等多种环境胁迫的优点,能够适用于多种环境胁迫下物料发酵。(The invention discloses a multi-tolerance saccharomyces cerevisiae strain and a construction method and application thereof, wherein the saccharomyces cerevisiae strain is preserved in the China General Microbiological Culture Center (CGMCC), is preserved under the name of SEB17 and has the preservation number as follows: CGMCC NO.22587, the construction method comprises the following steps: the strain SEB14 is used as an original strain, a promoter of a functional gene ENA5 of the strain SEB14 is replaced by a promoter of TEF1, and the strain SEB17 is constructed. The strain SEB17 has multiple tolerance, has the advantages of tolerance to various environmental stresses such as high ethanol, high temperature, high sugar and high salt, and can be suitable for material fermentation under various environmental stresses.)
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种多重耐受性酿酒酵母菌株及其构建方法和应用。
背景技术
面对能源日益紧缺，环境污染问题日益严重的形势，迫切需要开发绿色、可再生的新型能源。对秸秆、废糖蜜等储量和产生量大的有机废弃物进行资源化利用生产清洁能源燃料乙醇，将可同时缓解能源和环境危机。燃料乙醇工业生产中若能实现超高浓度(VHG)发酵及高温发酵，可显著降低生产成本，减少废水排放量，降低环境污染负荷。因此，选育可耐受高乙醇、高温、高糖、高盐等多种环境胁迫的多重耐受性工业酿酒酵母菌株，具有重要的经济和环境意义。目前，对于酿酒酵母抗逆性的研究主要集中在单一耐受性的提高，育种的主要方法主要为诱变、驯化、基因组重排和基因工程等，而如何同时提高酿酒酵母的多重耐受性的研究非常有限。然而，多重耐受性酿酒酵母相比单耐受性酵母可以适用于多种实际物料的发酵从而具有更广泛的工业应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多重耐受性酿酒酵母菌株，该菌株具有多重耐受性，同时具有耐受高乙醇、高温、高糖、高盐等多种环境胁迫的优点，能够适用于多种环境胁迫下物料发酵。
此外，本发明还提供一种多重耐受性酿酒酵母菌株的构建方法和应用。
本发明通过下述技术方案实现：
一种多重耐受性酿酒酵母菌株，所述酿酒酵母菌株保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏名称为SEB17，其保藏号为：CGMCC NO.22587，分类命名为Saccharomyces cerevisiae,保藏日期为2021年5月24日，保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。
本发明所述菌株SEB17具有多重耐受性，同时具有耐受高乙醇、高温、高糖、高盐等多种环境胁迫的优点，能够适用于多种环境胁迫下物料发酵。
一种多重耐受性酿酒酵母菌株的构建方法，以具有良好耐受性的工业菌株SEB14为出发菌株，将功能基因ENA5的启动子替换为在各胁迫下表达量较高且稳定的TEF1的启动子，获得高表达基因ENA5的菌株SEB17。
研究表明，通过基因工程手段敲除或者高表达一些转录因子或功能基因可以有效提高酿酒酵母的乙酸和糠醛等耐受性，因此，基因工程定向改造酿酒酵母对于其耐受表型的提升十分重要。本发明前期基于转录组学的研究发现在高乙醇、高温、高糖和高盐等多种胁迫条件下，工业酿酒酵母菌株SEB14中基因ENA5(编码P型ATP酶)均显著上调，且该基因与各基因之间关系最紧密。目前，仅有研究表明ENA5与真菌的耐盐性密切相关，在本发明中，首次发现ENA5与酿酒酵母的多重胁迫耐受性相关。
具体地：
出发菌株：
出发菌株SEB14保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.19587。
培养基：
所用培养基如表1所示。若培养基为固体培养基，则在灭菌前加入2.0％的琼脂粉。灭菌条件为121℃，15min。所有的抗生素均在培养基灭菌后，待冷却至50～60℃后添加。
表1培养基组成
质粒、菌株及引物：
以良好耐受性的工业菌株SEB14(菌株保藏号：CGMCCNo.19587)为出发菌株，通过启动子替换的方法，将基因ENA5过表达获得菌株SEB17，其中所用质粒和菌株如表2所示；菌株转化所用引物及片段如表3所示；用于构建gRNA质粒的所需的同源壁序列和PAM位点(NGG)上游的20bp目标序列如表4所示。
表2构建菌株SEB17过程中所用质粒及菌株信息
表3菌株转化所需引物及片段
注：TG:gRNA加同源臂引物,RF：修复片段，Vp：验证引物；F：上游引物；R：下游引物
TEF1 F的序列号为SEQ ID No.1，TEF1 R的序列号为SEQ ID No.2，ENA5 TG F的序列号为SEQ ID No.3，ENA5 TG R的序列号为SEQ ID No.4，ENA5 RF F的序列号为SEQ IDNo.5，ENA5 RF R的序列号为SEQ ID No.6，ENA5 VP F的序列号为SEQ ID No.7，ENA5 VP R的序列号为SEQ ID No.8，Cas9-dg-F的序列号为SEQ ID No.9，Cas9-dg-R的序列号为SEQ IDNo.10，6006-F的序列号为SEQ ID No.11，6005-R序列号为SEQ ID No.12。
表4构建gRNA所需的同源臂序列和PAM位点(NGG)上游的20bp目标序列
注：N20：gRNA所含的PAM位点(NGG)上游的20bp的目标序列；下划线：PAM位点(NGG)
tgR F的序列号为SEQ ID No.13，tgR R的序列号为SEQ ID No.14，ENA5的序列号为SEQ ID No.15。
菌株SEB17的构建：
1)、TEF1启动子(修复片段)的扩增
以菌株SEB14的基因组DNA为模板，通过PCR扩增TEF1启动子(修复片段)(表5)。PCR反应体系和反应条件如表6所示。RF F/RF R为包含同源臂的TEF1的引物，序列如表3所示。利用1.5％的琼脂糖凝胶对PCR产物电泳(100V，32min)，于EB染液中染色40min，紫外灯下观察目标条带。将所得PCR产物保存于-20℃冰箱，备用。
表5 TEF1启动子基因序列表
注：PTEF1的序列号为SEQ ID No.16。
表6 PCR扩增TEF1启动子(修复片段)
2)、构建双链gRNA片段：
在Saccharomyces Genome Database网站上查询目标基因启动子区域的碱基序列。再将该序列输入到Yeastriction，查找目标片段上PAM位点(NGG)上游的20bp目标序列。将包含上下游50bp同源臂和20bp目标序列(共120bp)的gRNA片段进行合成(片段序列见表3。待合成之后，用灭菌水稀释至10μM，后将两条互补链溶液按1：1混合(体积比)，于水浴锅中95℃热击5min，获得双链gRNA片段。
3)、扩增gRNA线性骨架
以pMEL13质粒为模板，扩增gRNA的线性骨架，PCR反应体系和反应条件如表7所示。利用1.5％的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳(100V，32min)，于EB染液中染色40min，紫外灯下观察是否有目标条带。将所得PCR产物保存于-20℃冰箱，备用。
表7 PCR扩增gRNA线性骨架
4)、纯化修复片段(TEF1启动子)和gRNA线性骨架
由于PCR扩增产物中含有模板、DNA聚合酶和buffer，需要利用PCRPurification Kit纯化试剂盒进行纯化。具体步骤如下：
(1)取50-70μL PCR产物，加入5倍体积的溶液BB混匀，加入离心柱中，10000×g离心1min，弃流出液；
(2)加入650μL溶液WB，10000×g离心1min，弃流出液；
(3)10000×g离心2min，彻底去除残留的WB；
(4)将离心柱放置于1.5mL离心管中，向柱中央加入30-50μL灭菌水，室温静置1-2min，10000×g离心1min，洗脱DNA。将所得DNA于-20℃保存。
5)、gRNA线性骨架模板消化
酶切消化体系和反应条件如表8所示。反应体系中所加的Quick cut Dpn1依据扩增gRNA线性骨架时所加的pMEL13模板量确定。经纯化获得gRNA线性骨架。
表8 gRNA线性骨架模板消化体系
6)、Gibson连接gRNA片段和gRNA线性骨架
将所得的gRNA片段和gRNA线性骨架通过Gibson Assembly试剂盒描述的方法进行Gibson连接，反应体系如表9所示。gRNA(120bp)和pMEL13-bachbone按质量比5：1加入连接体系中。将反应体系液于PCR仪上，50℃连接15min。取全部反应液转化至大肠杆菌中。然后，将菌液涂布于LB-Amp抗生素平板上。待菌株长出后，将其划线在LB-Kana抗生素平板上，37℃培养24h。将克隆子转接于含5mL LB+Kana液体培养基的试管中培养12-16h(160rpm，37℃)。收集菌体，利用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒，从大肠杆菌中提取gRNA质粒。利用1.5％的琼脂糖凝胶，对gRNA质粒进行电泳(100V，32min)，于EB中染色40min，紫外灯下观察是否有目标条带。将所得的gRNA质粒进行测序确认，获得序列正确的gRNA质粒。
表9 Gibson连接的反应体系
7)、Cas9质粒
从-80℃冰箱取出含Cas9质粒(Case9-NAT)的大肠杆菌菌保，将其划线于LB+NAT固体平板上，于37℃恒温培养箱中培养1d。用牙签挑取菌体于含5mL LB+NAT液体培养基中培养12-16h(160rpm，37℃)。收集菌体，利用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒，从大肠杆菌中提取Cas9质粒。在1.5％的琼脂糖凝胶对Cas9质粒进行电泳(100V，32min)，于EB染液中染色40min，紫外灯下观察条带。
8)、Cas9质粒转入目标酿酒酵母菌株
(1)将目标菌株于2％YPD固体平板上活化24h，取适量菌体接种于含5mL 2％YPD液体培养基中培养16h(160rpm，30℃)；
(2)取2-3mL菌液至300mL 2％YPD液体培养基中，29℃，180rpm培养2-3h。期间每隔1h取样，8,000×g离心2min，去培养液，将菌体用0.05mmol/L的EDTA-2Na溶液分散后，测定其在600nm下的吸光度；
(3)当OD600达到0.2～0.3时，8,000×g离心2min收集菌体，用灭菌水将菌体洗涤2-3次，离心弃上清。然后用0.6mL灭菌水分散菌体，置于冰上备用；
(4)取配制好的鲑鱼精DNA(来源于鲑鱼睾丸)，于沸水浴中加热5min，立即置于冰上，备用；
(5)取1.5mL离心管，分别向其中加入60％PEG4000(110μL)、4M的醋酸锂溶液(5μL)和鲑鱼精DNA(12μL)。实验组中加入100ng Cas9质粒，对照组中加等量的无菌水，振荡混匀；
(6)向上述离心管中加入50μL步骤(3)准备的宿主细胞，振荡混匀；
(7)42℃金属浴热击40-60min，期间每20min取出离心管并上下颠倒；
(8)8,000×g离心2min，弃转化液。用灭菌水将细胞洗涤2-3次，然后向离心管中加入1mL 2％YPD液体培养基，30℃、160rpm摇床培养4h；
(9)8,000×g离心2min，弃培养液，用灭菌水洗涤2-3次。加1mL灭菌水分散菌体，取100μL菌悬液，涂布于含0.005％NAT的2％YPD平板上，置于恒温培养箱中30℃培养1～2天。
9)、Cas9质粒转化菌落PCR验证：
挑取2％YPD+NAT平板上的单个转化子，划线于2％YPD+NAT固体平板上，30℃培养24h，进行菌落PCR验证。具体步骤如下：
(1)从2％YPD+NAT平板上，挑取适量菌体于含95μL1％SDS和5μL 4mol/L的醋酸锂溶液的1.5mL离心管中，涡旋振荡；
(2)75℃热击10min；
(3)向离心管中添加300μL的无水乙醇，涡旋振荡；
(4)室温13000rpm离心3min，弃上清液，于37℃条件下干燥10min；
(5)加入100μL灭菌水，涡旋振荡，室温13000rpm离心1min；
(6)取1μL以上清液作为模板进行PCR验证，PCR反应体系和反应条件如表10所示；
(7)利用1.5％的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳(100V，32min)，于EB染液中染色40min，紫外灯下观察是否有目标条带。
表10 Cas9质粒验证PCR体系
10)、酵母转化
酵母转化的具体方法同8)、Cas9质粒转入目标酿酒酵母菌株，只是将步骤(5)改为：取若干个1.5mL离心管，分别向其中加入60％PEG4000(240μL)、4M的醋酸锂(9μL)和鲑鱼精DNA(25μL)。实验组中加入gRNA质粒(300-600ng)和修复片段(600-1400ng)，对照组中加入等量的灭菌水，振荡混匀。
11)、目标菌株转化菌落PCR验证
从2％YPD+NAT+G418平板上随机挑取转化子，划线于2％YPD+NAT+G418固体平板上，30℃培养24h，参见Cas9质粒转化菌落PCR验证中方法进行菌落PCR验证。利用目标基因的验证引物(表3)，扩增目标片段。其中，PCR反应体系和反应条件见表10，退火温度和片段延伸时间由具体的验证引物决定。
12)、质粒去除
经过菌落PCR验证，选取正确的转化子，将其中的Cas9质粒和gRNA质粒全部去除。具体步骤如下：
(1)挑取正确的转化子划线于2％YPD固体平板上，30℃培养24h；
(2)将菌体接种于含5mL2％YPD液体培养基中，30℃，160rpm培养16h；
(3)吸取1mL菌液，8000×g离心2min，弃上清；
(4)用灭菌水梯度稀释105倍，取100μL菌液涂布于2％YPD固体平板上，于30℃恒温培养箱中培养1d；
(5)挑取单菌落依次在2％YPD、2％YPD+NAT和2％YPD+G418的平板上点板，于30℃恒温培养箱中培养1-2d。若该菌落只可以在2％YPD上生长，说明该菌落中质粒已脱除。
采用菌株SEB17制备的菌剂。
一种多重耐受性酿酒酵母菌株在制备菌剂中的应用。
一种多重耐受性酿酒酵母菌株在胁迫条件下物料发酵中的应用。
进一步地，胁迫条件包括至少包括高乙醇、高温、高糖和高盐中的一种。
本方面的高乙醇为：15％YPD+7％-10％初始乙醇；高温为：42-44℃；高糖为：250-300g/L；高盐为：1-1.5mol/L。
一种多重耐受性酿酒酵母菌株在有机物料发酵中的应用。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1、本发明的菌株SEB17具有多重耐受性，同时具有耐受高乙醇、高温、高糖、高盐等多种环境胁迫的优点，能够适用于多种环境胁迫下物料发酵，相比菌株SEB14，各方面耐受性均有所提高。
2、本发明首次发现高表达基因ENA5可以显著提高工业酿酒酵母菌株SEB14的耐乙醇、耐高温和耐渗透等多重耐受性，菌株SEB17在多种胁迫条件下的YPD合成培养基中以及在预处理秸秆、废糖蜜和木薯等典型实际物料中进行发酵均具有较高的乙醇产量，展示了较好的工业应用潜力。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1为菌株SEB17和SEB14乙醇葡萄糖共发酵结果对比图；
图2为菌株SEB17和SEB14高温发酵结果对比图；
图3为菌株SEB17和SEB14高温乙醇共发酵结果对比图；
图4为菌株SEB17和SEB14 VHG发酵结果对比图；
图5为菌株SEB17和SEB14高盐发酵结果对比图；
图6为菌株SEB17和SEB14利用预处理秸秆同步糖化发酵结果对比图；
图7为菌株SEB17和SEB14利用废糖蜜进行VHG发酵结果对比图；
图8为菌株SEB17和SEB14利用木薯物料同步糖化发酵结果对比图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1：
乙醇葡萄糖共发酵：
以工业酿酒酵母菌株SEB14为宿主，高表达基因ENA5，获得一株优秀的多耐受性菌株SEB17。在9％(v/v)初始乙醇和141.95g/L葡萄糖条件下共发酵96h后，其产生乙醇32.39±1.02g/L，较菌株SEB14提高了13.09％(28.64±1.66g/L)。同时，在发酵24h后，SEB17的发酵速率显著高于SEB14。该结果表明，高表达基因ENA5可以显著提高SEB14的乙醇耐受性，如表11和图1所示。
表11 9％(v/v)乙醇和141g/L葡萄糖混合条件下菌株发酵96h结果比较
注：同一列中相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著，P<0.05(t-test)。9％(v/v)乙醇:初始培养基含64.17g/L。SEB17：菌株SEB14高表达基因ENA5。
实施例2：
高温发酵：
本实施例探究菌株SEB17的高温耐受性，在44℃、100.65g/L葡萄糖发酵条件下，菌株SEB17的乙醇浓度显著(P<0.05)高于SEB14(图2)。发酵72h后，SEB17的乙醇浓度和葡萄糖浓度分别为43.52±1.17g/L和7.21±2.03g/L。与SEB14相比增加了14.17％，减少了59.74％(表12)。该结果表明，高表达ENA5可以显著提高菌株SEB14的高温耐受性。
表12 44℃条件下菌株发酵72h结果比较
注：同一列中相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著，P<0.05(t-test)。SEB17：
菌株SEB14高表达基因ENA5。
实施例3：
高温乙醇共发酵：
在SSF发酵后期，酵母细胞既要耐受高温，同时需要耐受逐渐增加的乙醇浓度。在本实施例中，发现SEB17在初始添加3％乙醇和43℃高温共同发酵条件下也表现出比出发菌株SEB14更好的发酵性能。发酵结束时，其产乙醇浓度(23.43±0.95g/L)相比出发菌株SEB14(18.66±1.62g/L)提高了20.36％，表明菌株SEB17能够很好地耐受高温和乙醇的双重胁迫，高表达基因ENA5对于提高菌株SEB14的高温乙醇双重胁迫耐受性的提升至关重要(图3，表13)。
表13初始添加3％乙醇、43℃条件下菌株发酵72h结果比较
注：同一列中相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著，P<0.05(t-test)。43℃+3％乙醇:初始培养基为21.28g/L乙醇。SEB17：菌株SEB14高表达基因ENA5。
实施例4：
VHG发酵：
为了进一步探究菌株SEB17的高糖耐受性，本实施例对其进行了高糖条件下的发酵研究。在270.91g/L葡萄糖发酵条件下(初始OD660为1.5)菌株SEB14和菌株SEB17均能够在72h内将葡萄糖消耗完。当葡萄糖浓度提高至280.19g/L时，发酵前24h，菌株SEB17乙醇浓度与出发菌株SEB14无明显差异。发酵48h后有一定差异，发酵至96h，SEB17乙醇浓度较出发菌株SEB14提高3.50％(图4)。其中两株菌株的乙醇收率均达到0.50，说明其代谢乙醇的能力较强(表14)。以上结果表明，高表达基因ENA5可以在一定程度上提高菌株的高糖耐受性。
表14 280.19g/L葡萄糖条件下菌株发酵96h结果比较
注：同一列中相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著，P<0.05(t-test)。SEB17：菌株SEB14高表达基因ENA5。
实施例5：
高盐发酵：
本实施例发现除了高糖条件下，在含1.25mol/L(7.31％)NaCl的YPD发酵培养基中，菌株SEB17可以在72h时消耗完所有的葡萄糖，比SEB14提前了24h。当NaCl浓度提高至1.5mol/L(8.77％)时，发酵前24h，SEB17与SEB14乙醇浓度差异不大，发酵48h后，SEB17葡萄消耗速率和乙醇产量均显著高于SEB14(图5)。发酵至96h，SEB17的终点乙醇浓度达56.73±1.05g/L，相比SEB14(28.13±1.58g/L)提高了101.67％(表15)。
表15 1.5M NaCl条件下菌株发酵96h结果比较
注：同一列中相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著，P<0.05(t-test)。SEB17：菌株SEB14高表达基因ENA5。
实施例6：
预处理秸秆发酵：
我国每年可产生数十亿吨农作物废弃秸秆，以秸秆为原料生产燃料乙醇是我国可再生清洁液体燃料发展的重要方向。如图6所示，秸秆预处理物料经过8h糖化后，在42℃高温同步糖化发酵过程中，伴随酶解过程的进行，发酵前24h，发酵液中的葡萄糖快速被酵母利用，发酵48h后，菌株SEB17乙醇浓度高于SEB14，终点乙醇浓度达68.40±1.59g/L。
实施例7：
废糖蜜原料发酵：
废糖蜜是甘蔗压榨制糖过程中产生的主要副产物，其含糖量高，成本低廉，已是巴西、印度等国生产燃料乙醇的主要原料之一。在270.91g/L总糖条件下，发酵前48h，菌株SEB17和SEB14乙醇浓度差异较小，达94-96g/kg。发酵96h后，菌株SEB17乙醇浓度为98.28±2.47g/L，高于菌株SEB14(95.71±3.91g/L)(图7)。
实施例8：
木薯以其适应性强、产量高且淀粉含量高，被称为“淀粉之王”，是一种极具潜力的淀粉类生物质能源作物。从图8中可以看出，在固含量35％条件下，发酵前24h，菌株SEB17和SEB14产乙醇速率较快，发酵至48h，菌株产乙醇浓度趋于稳定，发酵96h，菌株SEB17终点乙醇产量(138.43±2.06g/L)高于出发菌株SEB14(134.70±1.87g/L)。
综上所述，本发明首次发现高表达基因ENA5可以显著提高工业酿酒酵母菌株SEB14的耐乙醇、耐高温和耐渗透等多重耐受性，菌株SEB17在多种胁迫条件下的YPD合成培养基中以及在预处理秸秆、废糖蜜和木薯等典型实际物料中进行发酵均具有较高的乙醇产量，展示了较好的工业应用潜力。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 四川大学
<120> 一种多重耐受性酿酒酵母菌株及其构建方法和应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列1(人工序列)
<400> 1
cacacaccat agcttcaaaa tg 22
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列2(人工序列)
<400> 2
tttgtaatta aaact 15
<210> 3
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列3(人工序列)
<400> 3
tgcgcatgtt tcggcgttcg aaacttctcc gcagtgaaag ataaatgatc gataacgtat 60
gtactcactg gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac 120
<210> 4
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列4(人工序列)
<400> 4
gttgataacg gactagcctt attttaactt gctatttcta gctctaaaac cagtgagtac 60
atacgttatc gatcatttat ctttcactgc ggagaagttt cgaacgccga aacatgcgca 120
<210> 5
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列5(人工序列)
<400> 5
ccttcatcct ttacatcgag aatacgttaa ccaaatcaac cacacaccat agcttcaaaa 60
tg 62
<210> 6
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列6(人工序列)
<400> 6
attcttcatt attgttttct ttgacagttc cctcgctcat tttgtaatta aaact 55
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列7(人工序列)
<400> 7
ttgtgaggct gatgttttct tc 22
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列8(人工序列)
<400> 8
gcttcttctg tagtcaatgt gtgat 25
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列9(人工序列)
<400> 9
tcacccttac gttgtttgaa 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列10(人工序列)
<400> 10
aggggacgtt atcactcttc 20
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列11(人工序列)
<400> 11
gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 40
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列12(人工序列)
<400> 12
gatcatttat ctttcactgc ggagaag 27
<210> 13
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列13(人工序列)
<400> 13
tgcgcatgtt tcggcgttcg aaacttctcc gcagtgaaag ataaatgatc ngttttagag 60
ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt ccgttatcaa c 101
<210> 14
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列14(人工序列)
<400> 14
gttgataacg gactagcctt attttaactt gctatttcta gctctaaaac ngatcattta 60
tctttcactg cggagaagtt tcgaacgccg aaacatgcgc a 101
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列15(人工序列)
<400> 15
gataacgtat gtactcactg agg 23