【

具体实施方式

】

以下实施例用于非限制性地解释本发明的技术方案。

在本发明中，如无特殊说明，用于说明浓度的“％”均为质量百分比，用于说明用量比例的“：”均为质量比。

本发明涉及以下培养基：

SD-LEU培养基：葡萄糖2％，(NH₄)₂SO₄ 0.5％，YNB 0.17％，Drop-out mixsynthetic minus leucil w/o yeast nitrogen base 0.2％，固体培养基另加入2.5％的琼脂粉，于121℃高压蒸汽灭菌20min。

YPD液体培养基：葡萄糖2％，酵母粉1％，蛋白胨2％，酪氨酸0.1％，于121℃高压蒸汽灭菌20min。

本发明涉及以下基因：

表1 2-甲基-6-香叶基香叶基苯醌甲基转移酶基因及其来源

表2生育酚环化酶基因及其来源

表3γ-生育酚甲基转移酶及其来源

本发明涉及以下引物：

本发明涉及的菌落PCR验证的反应体系如下：

反应体系：

PCR程序：

实施例1构建含有2-甲基-6-香叶基香叶基苯醌甲基转移酶(MPBQMT)基因的重组质粒

从NCBI上获取来源于油菜的HPPD基因(BrHPPD)(Gene ID：103843547)和来源于蓝藻的HPT基因(GaHPT)序列(GenBank:MBR8827918.1)，送生工优化合成后与载体ploxpura3loxp经酶切连接获得重组质粒ploxpura3loxp-BrHPPD-GaHPT，将重组质粒酶切线性化后，采用酵母转化试剂盒方法转入解脂亚罗酵母工程菌polf中，获得重组菌株polf-BHGH，验证方法采用菌落PCR的方式。

根据表1的记载，从NCBI上获取来源于核桃(JrMPBQMT)、花生(AhMPBQMT)、山嵛菜(EsMPBQMT)、木豆(CcMPBQMT)和卷柏(SmMPBQMT)的MPBQMT基因序列，送生工优化合成。

分别以NdeⅠ/SpeⅠ为酶切位点双酶切载体ploxpura3loxp和基因MPBQMT并连接获得重组质粒ploxpura3loxp-JrMPBQMT、ploxpura3loxp-AhMPBQMT、ploxpura3loxp-EsMPBQMT和ploxpura3loxp-CcMPBQMT和ploxpura3loxp-SmMPBQMT。将以上重组质粒用限制性酶SmaI酶切线性化，采用酵母转化试剂盒方法转入解脂亚罗酵母工程菌polf-BHGH中，获得重组菌株1、2、3、4、5，通过菌落PCR的方式验证正确。

重组菌株1-5基因型为：

实施例2构建含有生育酚环化酶(TC)基因的重组质粒

根据表2的记载，从NCBI上获取来源于荠菜(CrTC)、山嵛菜(EsTC)、甘蓝(BoTC)、油菜(BnTC)、柑橘(CcTC)和石斛(DcTC)的TC基因序列，送生工优化合成。分别以NdeⅠ/SpeⅠ为酶切位点双酶切载体ploxpura3loxp和基因TC并连接获得重组质粒ploxpura3loxp-CrTC、ploxpura3loxp-EsTC、ploxpura3loxp-BoTC、ploxpura3loxp-BnTC、ploxpura3loxp-CcTC和ploxpura3loxp-DcTC，将以上重组质粒用限制性酶SmaI酶切线性化，采用酵母转化试剂盒方法分别转入上述重组菌株中，获得重组菌株6、7、8…34、35，通过菌落PCR的方式验证正确。

重组菌株6-35基因型为：

通过检测发酵液中γ-生育三烯酚的含量，筛选出高产γ-生育三烯酚的重组菌株。检测方法如下：

检测样品的制备:取1mlSD发酵液于1.5ml离心管中，12000rpm离心5min，取上清于新的离心管，并加入40ml冰醋酸，再用0.22um水系针孔式滤头过滤。

HPLC检测条件:流动相:0.01M KH₂PO₄溶液(A)和甲醇(B)；比例:90％A/10％B；流速:0.8ml/min；检测波长:290nm；色谱柱:YMC-Pack ODS-AQ(4.6×250mm)。

标准曲线制备方法如下：

γ-生育三烯酚标准曲线的制作：用万分之一天平称取10mgγ-生育三烯酚，溶于10ml纯甲醇溶液中，浓度定为1g/L的母液，依次用纯甲醇溶液梯度稀释，稀释得到浓度分别为250mg/L，100mg/L,50mg/L，20mg/L,5mg/L的γ-生育三烯酚溶液，并用相同的方法再稀释出两批同浓度的γ-生育三烯酚溶液，对所有样品经0.22um有机系针孔式滤头过滤，再进行HPLC分析。

结果如图2所示，比较各重组菌株的生育三烯酚含量，发现重组菌株35的γ-生育三烯酚含量最高，为2014.5μg/g DCW，因此选择来源于卷柏的MPBQMT基因和石斛的TC基因构建的重组菌株35(polf-BHGH-SmMPBQMT-DcTC)进行后续研究。

实施例3构建表达含有γ-生育酚甲基转移酶的重组菌株

根据表3的记载从NCBI上获取来源于荠菜(Crγ-TMT)、山嵛菜(Esγ-TMT)、甘蓝(Boγ-TMT)和油菜(Bnγ-TMT)的γ-TMT基因序列，送生工优化合成。分别以NdeⅠ/SpeⅠ为酶切位点双酶切载体ploxpura3loxp和基因TC并连接获得重组质粒ploxpura3loxp-Crγ-TMT、ploxpura3loxp-Esγ-TMT、ploxpura3loxp-Boγ-TMT和ploxpura3loxp-Bnγ-TMT，将以上重组质粒用限制性酶SmaI酶切线性化，采用酵母转化试剂盒方法分别转入重组菌株35(polf-BHGH-SmMPBQMT-DcTC)中，获得重组菌株36、37、38、39，所得菌株经PCR验证正确。

重组菌株36-39的基因型为：

通过检测发酵液中α-生育三烯酚的含量，来筛选生育三烯酚含量最高的重组菌株，HPLC检测方法同γ-生育三烯酚方法，标准曲线制备方法同γ-生育三烯酚标准曲线的制作。

α-生育三烯酚的含量检测方法如下：

将各重组菌株在添加0.1％(w/v)酪氨酸的50ml YPD液体培养基中，220rpm 30℃恒温摇床里培养96h，然后取5ml发酵液离心并收集菌体，研磨破胞后，用2ml丙酮分两次萃取，离心取上清，过滤后，进HPLC分析。以丙酮为提取溶剂，从发酵液中萃取生育三烯酚。

表4各重组菌株发酵液中各种生育三烯酚含量

结果如图3、表4所示，重组菌株38(polf-BHGH-SmMPBQMT-DcTC-Boγ_TMT)的α-生育三烯酚含量最高，达到453.6μg/g DCW，γ-生育三烯酚含量为1260.9μg/g DCW。由此可见，来源于卷柏的MPBQMT基因(序列如SEQ ID NO.1所示)、石斛的TC基因(序列如SEQ IDNO.2所示)和来源于甘蓝的γ-TMT基因(序列如SEQ ID NO.3所示)构建的重组菌株所得生育三烯酚产量最高，总量达到1714.5μg/g DCW，显著优于现有技术的记载。

实施例4过表达关键基因

根据NCBI数据库中HMG1和CrtE基因序列(GeneID:854900，GeneID:37543877)设计引物从Y.lipolytica po1f菌株的基因组DNA扩增目的片段。将目的片段连接到载体pJN44的多酶切位点上，分别得到质粒pJN44-HMG1和pJN44-CrtE。验证好的表达质粒pJN44-HMG1和pJN44-CrtE分别转入菌株38中，获得重组菌株40，通过菌落PCR的方式验证正确。

将前述获得的目的基因BrHPPD，GaHPT，SmMPBQMT，DcTC和Boγ_TMT连接到载体pJN44的多酶切位点上，分别得到质粒pJN44-BrHPPD，pJN44-GaHPT，pJN44-SmMPBQMT，pJN44-DcTC，和pJN44-Boγ_TMT。将获得的重组表达质粒通过酶切验证后转入菌株40中，得到高产生育三烯酚的重组菌株41，命名为重组解脂亚罗酵母polf-(MTT)⁺HC-ura3，通过菌落PCR的方式验证正确。

高产生育三烯酚的重组菌株40、41的基因型为：

将重组菌株41在SD-LEU培养基上培养以去除ura3标记，SD-LEU培养基上生长的单菌落即为高产生育三烯酚的重组解脂亚罗酵母，命名为polf-(MTT)⁺HC。

对所得高产生育三烯酚的重组菌株polf-(MTT)⁺HC进行了4次发酵，对4次发酵结果进行检测α-生育三烯酚和γ-生育酚的含量，结果如表5显示重组菌株polf-(MTT)⁺HC的α-生育三烯酚含量最高达到748.5ug/g DCW，γ-生育三烯酚含量为1675.2μg/g DCW，总生育三烯酚含量为2423.7μg/g DCW。其平均总生育三烯酚产量达到2286.8μg/g DCW，相对于现有技术有显著提高。由此可见，在基因挖掘的基础上过表达生育三烯酚合成途径中的关键基因对生育三烯酚产量的提高有明显作用。

表5重组菌株polf-(MTT)⁺HC发酵液中各种生育三烯酚含量

序列表

<110> 西安海斯夫生物科技有限公司

<120> 高产生育三烯酚的重组解脂亚罗酵母、其构建方法及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1047

<212> DNA

<213> 2-甲基-6-香叶基香叶基苯醌甲基转移酶基因(Selaginella sp.)

<400> 1

atggccatgg ccatggctgc cgccgccccc cgaaccgtcc aggccctcga gtgcggcgcc 60

tccggctccg agctgccccg aatcgcccga atttctgccc gacttccctc ccgaaagggc 120

ttccgaggcc tggccgtcgc cgcccgaatg cgacgaaact ccccgctggt gcgatgcgcc 180

gccgcccagt ccgcctccgc ctccccccga cccgccatgc agccccgatt catccagcac 240

aagcaggagg ccttctggtt ctaccgattc ctgtctatca tctacgacca catcatcaac 300

cccggtcact ggactgagga catgcgtgac gatgccctgg agcccgccga cctgtctgac 360

cgaaacctgg tcgtcgtcga cgtcggcggc ggcaccggct tcaccaccct gggcatcgtg 420

aagcacgtcg acgcccgaaa cgtgaccatt ctggaccagt ccccccacca gctggccaag 480

gccaaggaga aggagcccct gaaggagtgc aagatcatcg agggtgacgc tgaggacctg 540

ccctttgaga ctgattacgc tgacagatac gtttctgctg gttccatcga gtactggcct 600

gatccccagc gaggaattaa ggaggcttac agagtgctga agaagggcgg caaggcctgc 660

ctgatcggcc ccgtgcaccc caccttctgg ctgtcccgat tcttcgccga catgtggatg 720

ctgttcccca aggaggagga gtacattgac tggttcacca aggccggctt ccaggacgtc 780

cagctgaagc gaatcggtcc aaagtggtac cgaggtgtgc gtagacatgg tcttattatg 840

ggttgtagtg tgactggtgt taagcctgag gccggcgact ctcccctgga cctgggcccc 900

aaggccgagg acgtccaggc cccctctaac cccctgacct tcttcttccg attcctggtc 960

ggcggcatcg cctccctgta cttcgtcctg gtccccatct acatgtggct gaaggacctg 1020

atcaccccca agggccagcc catctaa 1047

<210> 2

<211> 1458

<212> DNA

<213> 生育酚环化酶基因(Dendrobium sp.)

<400> 2

atggatcgat ctggttcctc tgccctgctg cgacagcccc tgaccgccgt ctgccccctg 60

cccccccgat tcctgatctt ccgaaaggtc cctattgcca acgtcgagtt tcgacgacga 120

ccccccaagc ccaaggccgc cacctcttcc tctgaggccg aaaagaccgg cgccgtgtcc 180

tcttcccccg tgtacatccc cacccctcga gaccgagagc tgcgaacccc ccactccggc 240

taccacttcg acggcaccgc tcgagttttc ttcgagggtt ggtacttcaa ggtctctatc 300

ccccactgtc gacagtcctt ctgcttcatg tactccgttg agaaccccgc cttttccgac 360

ggtatgggtg tactggaccg agccatgtac ggtcaccgat tcaccggcgt cggcgcccag 420

atcctgggcg ctgacgacaa gtacatctgc cagttctctg agaagtctaa gaacttctgg 480

ggttctcgac acgagctgat gctgggcaac actttcatcg ctggcaacaa ctccgccccc 540

cctaacggcg agctgccccc ccaggagttc cgaaagcgag tgctggaggg tttccaggtt 600

tctcccttct ggcaccaggg cttcattcgt gacgacggcc gatctaccta cgtccagacc 660

gtcaagaccg cccgatggga gtactccacc cgacctgtct acggttgggg cgacttcaag 720

tctaaacaga agtccaccgc cggttggctg gccgccttcc ccgtctttga gccccactgg 780

cagatttgca tggccggcgg cctgtccacc ggctggattg agtgggacgg cgagcgattc 840

gagttcgaga acgccccctc gtactccgag aagaactggg gcggcggctt cccccgaaag 900

tggttctggg tccagtgtaa cgtgttcaag ggtgcttccg gcgaggtggc tctcaccgcc 960

gccggtggtc tccgaaagct ggccggcctc gccgacaact acgagaacgc cgccctggtg 1020

ggcgtccatt acggcggcaa gttctacgag ttcgtcccct ggaacggttc tgtgtcctgg 1080

gagatctccc agtggggcta ctggcacatc tccgccgaga acaaccagaa catggtcgag 1140

ctggtcgcta ccgtcgagga gcccggtacc cccctgagag ctcctacaca ggaagcagga 1200

cttgttactg cttgtaagga tacttgttac ggtgacctta ccctgcaact atgggagaaa 1260

acttccgacg gtaaaaaggg aaagcttatc ctggaggcca cctctaacat ggccgccgtt 1320

gaagtcggag gtggcccctg gttttcgact tggaagggaa ctacctctat gcccgagctg 1380

gtctcctccg cccttcaggt tcctattgac gttgagtcct tcttccccgt cccactgttt 1440

aagccccctg gactgtaa 1458

<210> 3

<211> 1044

<212> DNA

<213> γ-生育酚甲基转移酶基因(Brassica oleracea)

<400> 3

atgaaggcca ccctggcccc cccctcctcc ctgatctccc tgccccgaca caaggtctcc 60

tccctgcgat ccccctccct gctgctccag tcccagcgac cctcctccgc cctgatgaca 120

accaccgcca cccgaggctc cgtcgccgtc accgccgccg ccacctcctc tgccgaggcc 180

ctgcgagagg gcatcgccga gttctacaac gagacctccg gcctgtggga ggagatctgg 240

ggcgaccaca tgcaccacgg tttctacgac cccgactcct ctgtccagct gtctgactcc 300

ggacaccgag aggcccagat ccgaatgatc gaggagtccc tgcgattcgc cggcgtgacc 360

gaggaggaga agaagatcaa gcgagttgtt gacgtcggct gtggtatcgg tggatcttct 420

cgatacattg cttctaagtt cggagctgag tgtattggca tcaccctgtc ccccgtgcag 480

gccaagcgag ctaacgacct ggccgctgcc cagtccctgt ctcacaaggt gtccttccag 540

gtcgccgacg ccctggacca gcccttcgag gacggaatct tcgacctcgt ctggtccatg 600

gagtctggtg agcacatgcc cgacaaggcc aagttcgtga aggagctggt ccgagtgacc 660

gcccccggcg gtcgaatcat catcgtgacc tggtgccacc gaaacctgtc tcagggtgag 720

gagtctctgc agccctggga gcagaacctg ctggaccgaa tctgtaagac cttctacctg 780

cccgcctggt gctccacctc cgactacgtc gagctgctgc agtctctctc cctccaggac 840

attaagtgcg ccgactggtc tgagaacgtc gcccccttct ggcccgccgt gatccgaacc 900

gccctgacct ggaagggact ggtctccctg ctgcgatccg gtatgaagtc cattaagggc 960

gccctgacca tgcccctgat gatcgagggc tacaagaagg gcgtcatcaa gttcggcatc 1020

atcgcctgcc agaagcccct gtaa 1044