一种高精度离子通道评估心脏安全风险的优化方法
阅读说明：本技术 一种高精度离子通道评估心脏安全风险的优化方法 (Optimization method for evaluating heart safety risk through high-precision ion channel ) 是由 张之颢 于 2020-12-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种高精度离子通道评估心脏安全风险的优化方法,本发明的实验方法及流程接近人体心脏活动规律,简单及与临床相关系好,便于在实际应用中的推广和使用,既可以便于对临床使用前的药物进行TdP风险的确认,同时也可避免由于假阳性检测结果的出现而致使药品研发厂商的巨大损失,同时可以减轻国家和医疗机构的不必要医疗开支。(The invention discloses an optimization method for evaluating heart safety risk by a high-precision ion channel, the experimental method and the process of the invention are close to the heart activity rule of a human body, are simple and have good clinical correlation, are convenient to popularize and use in practical application, can not only facilitate the confirmation of TdP risk of the medicine before clinical use, but also avoid the huge loss of medicine research and development manufacturers caused by the occurrence of false positive detection results, and can also reduce the unnecessary medical expenses of the country and medical institutions.)
技术领域
本发明涉及新药研发中药物对心脏的安全性评估技术领域，特别涉及一种高精度离子通道评估心脏安全风险的优化方法。
背景技术
由药物引起的QTc延长进而导致的心律失常叫室心扭转性心律失常（Torsade dePoint TdP）。临床数据显示由于QT延长而导致的TdP是药物从市场上禁止销售及限制销售的最主要原因。由于它在临床中的风险罕见性及危险性，所以欧洲、美国、日本等国政府出台了相应的临床前指导原则。由于TdP的产生几率非常低且在大多数临床实验中是检测不到的，所以目前心脏安评的指导原则S7B及中国CFDA都将用临床前的间接指标来预测临床上的TdP的发生风险。这些指标主要是hERG，QTc及心脏上其他主要离子通道包括Na通道、Ca，K通道等8-10 离子通道，还有动作电位、离体心脏QTc等， 其中目前hERG及犬体内Qtc是新药临床申请所必须提供的数据之一。
对于新药临床前心脏的安全性评估是涉及到患者安全具有十分重要的意义，2005年起，G7各发达国家开始执行由欧盟、日本和美国的药品法规机构和大型制药企业联合制定的关于心脏安全评估的S7B法规，收益巨大。药物的临床前心脏安全评估大大降低了新药对心脏的副作用，使欧美制药公司每年节约150多亿美元的研发费用。随着时间的推移，S7B法规将会逐渐被各国的药物管理局和制药公司所接受。
我国是一个正在崛起的发展中国家，在这十多年来生物制药工业已取得了突飞猛进的成绩并将逐步与西方国家缩短差距，从现在即开始执行S7B法规将为我国的药品走向世界打开方便之门，特别是对我国传统中药的利用开发及临床应用将起到非常关键的作用。服用和注射中药是我国用药的最大特点，但中药注射剂常有严重不良反应的报道，其中很多是由于心律失常导致的并发症。
但是10多年大量的数据及经验证明早期临床前心脏安评设计的缺陷或直接忽略心脏评估将会产生非常严重的后果，这会直接导致经济上的十倍或者百倍的损失，很多情况下损失是无法挽回的。化合物有心脏风险的隐患，lead化合物将会大大提高研发资源需求包括大量的时间、成本等等。同时心脏安评的风险将会直接导致药物利益的模糊使其风险大于利益。风险会直接导致新药的使用警示。这些都会相应的降低新药上市后的竞争能力。对中小企业新药研发来说将会直接导致化合物价值下降，增加融资、寻找合作伙伴的困难度。最常见的结果是药物的心脏风险会直接导致研发的终止，这个结果对公司来说损失是巨大的。反过来说如果实验设计不严谨会增加假阳性而使一个具有很好潜力的化合物被放弃，这个结果对公司来说损失也是无法估量的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高精度离子通道评估心脏安全风险的优化方法。
本发明采用的技术方案是：
一种高精度离子通道评估心脏安全风险的优化方法，其特征在于：包括以下步骤：
心脏钾离子通道：
步骤1：使玻璃电极与细胞膜的密封电阻应≥1GΩ，用电压方法激活心脏的hERG离子通道，+40mV去极化电压的持续时间约为500 ms，每5 s重复一次，电压复极阶段持续时间为100 ms，从+40 mV到-80 mV，形成Ramp，电压变化为-1.2 V / s，前期电压-80至-90 mV的超极化小脉冲用于根据欧姆定律计算输入电阻，在Ramp期间记录到的最大正电流即为所要记录的hERG通道电流幅度；
步骤2：药物评估作用时，连续记录直到获得稳定的加药前后的hERG电流为止，并且细胞保持稳定，由保持在-80 mV的电流和输入电阻确定，每个细胞建议灌流两个浓度的药物，对每种药物测试至少4种浓度，并且与这些浓度相关的电流抑制百分比范围为20％-80％抑制，以便更好地估计与50％电流抑制相关的浓度，IC50；
心脏钙离子通道：
步骤1：使玻璃电极与细胞膜的密封电阻应≥1GΩ，用电压方法激活心脏的Cav1.2钙离子通道， +30 mV去极化电压的持续时间约为200 ms，每5 s重复一次，电压复极阶段持续时间为100 ms，从+30 mV到-80 mV，形成Ramp，电压变化为-1.1 V / s，前期电压-80至-90 mV的超极化小脉冲用于根据欧姆定律计算输入电阻，在Ramp期间记录到的最大负电流即为所要记录的钙通道电流幅度；
步骤2：药物评估作用时，陆续记录直到获得稳定的加药前后的Cav1.2电流为止，并且细胞保持稳定，由保持在-80 mV的电流和输入电阻确定，每个细胞就可以灌流两个浓度的药物，对每种药物测试至少4种浓度，并且与这些浓度相关的电流抑制百分比范围为20％-80％抑制，以便更好地估计与50％电流抑制相关的浓度，IC50；
心脏晚钠离子通道：
步骤1：使玻璃电极与细胞膜的密封电阻应≥1GΩ，用电压方法激活心脏的晚钠离子通道，+40 mV去极化电压的持续时间约为200 ms，每5 s重复一次，电压复极阶段持续时间为100 ms，从+40 mV到-95 mV，形成Ramp，电压变化为-1.35 V / s，前期电压-95至-120mV的超极化小脉冲用于根据欧姆定律计算输入电阻，在Ramp期间记录到的最大负向电流即为所要记录的晚钠离子通道电流幅度；
步骤2：药物评估作用时，陆续记录直到获得稳定的加药前后的晚钠电流为止，并且细胞保持稳定，由保持在-80 mV的电流和输入电阻确定，每个细胞就可以灌流两个浓度的药物，对每种药物测试至少4种浓度，并且与这些浓度相关的电流抑制百分比范围为20％-80％抑制，以便更好地估计与50％电流抑制相关的浓度，IC50。
本发明的优点：实验方法及流程接近人体心脏活动规律，简单及与临床相关系好，便于在实际应用中的推广和使用，既可以便于对临床使用前的药物进行TdP风险的确认，同时也可避免由于假阳性检测结果的出现而致使药品研发厂商的巨大损失，同时可以减轻国家和医疗机构的不必要医疗开支。
附图说明
下面结合附图和
具体实施方式
对本发明作进一步详细叙述。
图1为本发明心脏钾离子通道的步骤1中的电压方法示意图；
图2为本发明心脏钾离子通道的步骤2中的药物测试试验过程记录曲线图；
图3本发明心脏钾离子通道的步骤2中的药物测试分析结果图；
图4为本发明心脏钙离子通道的步骤1中的电压方法示意图；
图5为本发明心脏钙离子通道的步骤2中的药物测试试验过程记录曲线图；
图6为本发明心脏钙离子通道的步骤2中的药物测试分析结果图；
图7为本发明心脏晚钠离子通道的步骤1中的电压方法示意图；
图8为本发明心脏晚钠离子通道的步骤2中的药物测试试验过程记录曲线图；
图9本发明心脏钙离子通道的步骤2中的药物测试分析结果图。
具体实施方式
本发明提出的这种评估药物对心脏离子通道作用而引起的心律失常的试验方法，它是对目前国际上普遍使用方法的一种更全面和更精确的创新方案，该试验方法包括人体hERG通道，Cav1.2及晚钠Nav1.5稳转至HEK293细胞，记录化合物对离子通道的动力学影响，大数据分析评价三个流程，实验及分析采取以下步骤进行：
细胞培养：细胞株来源于HEK-293细胞，在37℃ 5% CO2培养箱中培养。当细胞密度达80%时，先用磷酸盐缓冲液预清洗，然后用胰蛋白酶/EDTA消化细胞，进行传代培养，细胞密度为2×106个/皿。培养基组成：DMEM、15%胎牛血清和1%青霉素。
实验质量保证：采用全细胞记录模式记录通道电流，实验温度采用36±1 C°。首先灌流细胞外液，待电流稳定即5 min内电流衰减（Run-Down）小于5%，且尾电流不低于300pA时，灌流含待测药物的细胞外液，浓度由低到高，每个浓度灌流4min。
实验数据：用PATCHMASTER（HEKA Instruments IncD-67466 Lambrecht/PfalzGermany）采集，并采用Origin（OriginLab CorpoRn，Northampton，MA）软件分析，数据表示为mean ± SE。
本发明申请人运用上述方法进行了3个标准化合物分别在心脏的钾，钙，钠离子通道上，用符合人体心脏波动的的实验方案进行测试研究，测试剂量为5个浓度，常规的测试筛选程序如下：
如图1-9所示，一种高精度离子通道评估心脏安全风险的优化方法，包括以下步骤：
心脏钾离子通道：
步骤1：使玻璃电极与细胞膜的密封电阻应≥1GΩ，如图1 所示，用模拟人体心脏波动的电压方法激活心脏的hERG离子通道，+40mV去极化电压的持续时间约为500 ms，每5s重复一次，电压复极阶段持续时间为100 ms，从+40 mV到-80 mV，形成Ramp，电压变化为-1.2 V / s，前期电压-80至-90 mV的超极化小脉冲用于根据欧姆定律计算输入电阻，在Ramp期间记录到的最大正电流即为所要记录的hERG通道电流幅度；
步骤2：药物评估作用时，持续记录直到获得稳定的对照（control）及加dofetilide后的hERG电流为止，测定在Ramp期间记录到的最大正电流即为所要记录的hERG通道电流幅度，同时细胞保持稳定，由保持在-80 mV的电流和输入电阻确定，每个细胞灌流两个浓度的药物，如图2、3所示，对每种药物测试至少5种浓度，并且与这些浓度相关的电流抑制百分比范围为20％-80％抑制，以便更好地估计与50％电流抑制相关的浓度，IC50；
心脏钙离子通道：
步骤1：使玻璃电极与细胞膜的密封电阻应≥1GΩ，如图4所示，用新型符合人体心脏波动的组合电压方法激活心脏的Cav1.2钙离子通道， +30 mV去极化电压的持续时间约为200 ms，每5 s重复一次，电压复极阶段持续时间为100 ms，从+30 mV到-80 mV，形成Ramp，电压变化为-1.1 V / s，前期电压-80至-90 mV的超极化小脉冲用于根据欧姆定律计算输入电阻，在Ramp期间记录到的最大负电流即为所要记录的钙通道电流幅度；
步骤2：药物评估作用时，陆续记录直到获得稳定的加药前后的Cav1.2电流为止，并且细胞保持稳定，由保持在-80 mV的电流和输入电阻确定，每个细胞就可以灌流两个浓度的药物，如图5、6所示，对每种药物测试至少4种浓度，并且与这些浓度相关的电流抑制百分比范围为20％-80％抑制，以便更好地估计与50％电流抑制相关的浓度，IC50；
心脏晚钠离子通道：
步骤1：使玻璃电极与细胞膜的密封电阻应≥1GΩ，如图7所示，用新型符合人体心脏波动的组合电压方法的电压方法激活心脏的晚钠离子通道，+40 mV去极化电压的持续时间约为200 ms，每5 s重复一次，电压复极阶段持续时间为100 ms，从+40 mV到-95 mV，形成Ramp，电压变化为-1.35 V / s，前期电压-95至-120 mV的超极化小脉冲用于根据欧姆定律计算输入电阻，在Ramp期间记录到的最大负向电流即为所要记录的晚钠离子通道电流幅度；
步骤2：药物评估作用时，陆续记录直到获得稳定的加药前后的晚钠电流为止，并且细胞保持稳定，由保持在-80 mV的电流和输入电阻确定，每个细胞就可以灌流两个浓度的药物，如图8、9所示，对每种药物测试至少4种浓度，并且与这些浓度相关的电流抑制百分比范围为20％-80％抑制，以便更好地估计与50％电流抑制相关的浓度，IC50。
在对上述3个已知结构的hERG， Cav和晚Nav1.5离子通道阻断剂的验证中：hERG阻断剂多菲利特（Dofetilide）显示IC150为0.15 uM，其斜率k为1.5。多菲利特对ramp测试中hERG电流达到峰值的时间没有影响。 Cav1.2钙通道阻断剂verapamil显示IC150为9.05uM，其斜率k为0.83。Verapamil对ramp测试中内向钙电流达到峰值的时间没有影响。 晚钠电流Nav1.5通道阻断剂Ranolazine显示IC150为0.04 uM，其斜率k为1。Ranolazine对ramp测试中内向钙电流达到峰值的时间没有影响。
本项目申请人用了3个符合人体心脏波动的体外细胞测试电位刺激方法测试了3个已用于临床的药物，其结果与临床发现结果一致，因此由本实验方法来判断化合物心脏安全评估的可靠性及与临床相关系比传统方法更优异。
本发明的实验方法及流程接近人体心脏活动规律，简单及与临床相关系好，便于在实际应用中的推广和使用，既可以便于对临床使用前的药物进行TdP风险的确认，同时也可避免由于假阳性检测结果的出现而致使药品研发厂商的巨大损失，同时可以减轻国家和医疗机构的不必要医疗开支。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应纳入本发明权利要求书确定的保护范围内。
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