阅读说明：本技术 一种利用超声波破碎微藻的处理方法 (Treatment method for crushing microalgae by using ultrasonic waves ) 是由 张彬 邓潜 朱昔恩 熊建华 谢达祥 赵永贞 陈田聪 陈晓汉 韦嫔媛 于 2019-09-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种利用超声波破碎微藻的处理方法,将富集有微藻的浓缩藻液与PBS缓冲液混合后,置于超声发生仪中处理20-40min,得到长度为2-30μm的微藻；所述微藻的形态为聚合群体、丝状体、长条带状中的任意一种。本发明克服了传统物理机械破碎方法因产生切力不匀和过大会导致微藻细胞体完整性受损的技术缺陷,本方法不破坏藻体的细胞壁,只是将形态为聚合群体、丝状体、长条带状的微藻联生体进行细胞之间的破碎分离,使成列、成群或成簇的细胞群破碎成长度更短的细胞列或细胞群,甚至是破碎成单个藻体细胞,而藻细胞内营养成分得以有效保留,本方法获得的微藻破碎液,满足水产动物育苗早期的摄食口径和育苗早期的营养需求。(The invention discloses a processing method for crushing microalgae by using ultrasonic waves, which comprises the steps of mixing concentrated microalgae solution enriched with microalgae with PBS buffer solution, and then placing the mixture in an ultrasonic generator for processing for 20-40min to obtain microalgae with the length of 2-30 mu m; the form of the microalgae is any one of polymeric group, filament and strip. The invention overcomes the technical defect that the integrity of the microalgae cell body is damaged due to uneven and overlarge shearing force generated by the traditional physical mechanical crushing method, the method does not damage the cell wall of the microalgae, but only carries out crushing separation on the cells of the microalgae symbiont in the shapes of polymeric groups, filaments and strip bands, so that the cell groups in rows, groups or clusters are crushed into cell rows or cell groups with shorter growth degree, even into single algae cells, and the nutrient components in the algae cells are effectively reserved.)

一种利用超声波破碎微藻的处理方法

技术领域

本发明涉及一种利用超声波破碎微藻的处理方法。

背景技术

藻类是植物界最低等的一个门类，因为它们的细胞内含有叶绿素或其他色素，能进行光合作用，自我合成所需营养，营独立生活并主要以细胞***的方式进行繁殖生长，所以藻类属于自养型真核生物，其中微藻由于它们的个体微小，肉眼难以看到，一般需要借助显微镜观察。微藻有2万多种，且是水体生态系统中主要的初级生产者，占比达40％，为海洋生物提供了最初级的生产力。特殊的生长环境使其含有多种生物活性物质，如活性蛋白、维生素、矿物质、类胡萝卜素、微藻多糖和多不饱和脂肪酸等。

随着对淡海水环境中各类经济微藻生物学特性和规模化培育方面研究的突破，微藻在水产动物，包括海水鱼类、贝类、虾蟹类等水产养殖品种的规模化育苗和养殖中均获得广泛的应用，已经成为各类水产养殖动物育苗成败的关键性生物饵料。目前国际上在水产育苗中得到广泛使用的各类微藻有20多种。我国在水产育苗行业中常用的微藻主要包括：硅藻类的纤细角毛藻(Chaetoceros gracilis)，牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri)，威氏海链藻(Conticribra weissflogii)，假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)，三角褐指藻(Phaeodactylum trecornutum)、中肋骨条藻(Skeletonema costatum)、底栖舟形藻(Navicula sp.)、底栖卵形藻(Cocconeis sp.)；金藻类的湛江等鞭金藻(Isochrysiszhangjiangensis)，球等鞭金藻(Isochrysis galbana)；绿藻类的亚心形扁藻(Platymonassubcordiformis)，小球藻(Chlorella vulgaris)，波吉卵囊藻(Oocystis borgei)，微绿球藻(Nannochloris oculata)和蓝藻类的钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)等。

海洋微藻对海水鱼贝虾蟹幼体早期发育，特别是在对虾类育苗从无节幼体***为蚤状幼体时具有重要作用。扁藻、金藻等可维持对虾、蟹类的发育和蜕皮***；杂色蛤仔浮游幼虫阶段的面盘幼虫阶段优先摄食小球藻；鲍浮游幼体发育生长至稚鲍过程中，通过利用易消化的硅藻细胞内含物可进入快速生长阶段；中肋骨条藻在培育对虾幼体时广泛使用，效果显著。此外，微藻所含有或产生的生物活性物质如抗生素，可杀死水中的致病菌，提高养殖动物的抗病力；同时，微藻对养殖水体的水质改善、调控水体微生态环境平衡方面也具有重要作用，在育苗水体中投放饵料微藻，不但可以直接吸收利用氨氮、亚盐等物质，同时光合作用放出的氧气还可促进微生物对氨氮、亚盐的硝化作用。在对虾养殖水环境中，人工引入波吉卵囊藻和微绿球藻，能改善养殖水体的水质，使对虾的血细胞数目、血清蛋白含量以及酚氧化酶、超氧化物歧化酶、溶菌酶、抗菌酶的活性都较对照组显著提高。

但是，为了适应对虾幼体各***期的最佳摄食口径，需要将长度较大的微藻破碎之后再进行投喂。如何破碎至合适长度，且破碎后保持微藻的细胞完整性，保留生物活性，是本领域技术人员亟需解决的一个技术问题。

目前有关微藻的破碎，均是利用物理机械的方法针对微藻的细胞进行破碎，将微藻的细胞壁破坏之后，使细胞内的生物活性物质释放出来加以利用。目前对于微藻细胞的破碎方法存在操作繁琐、破碎效果差、细胞内生物活性成分损失严重的问题。

目前尚未发现将形态为聚合群体、丝状体、长条带状的微藻在细胞与细胞之间进行破碎，而不破坏细胞壁和影响细胞内生物活性成分的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种利用超声波破碎微藻的处理方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的利用超声波破碎微藻的处理方法，包括如下步骤：将富集有微藻的浓缩藻液与PBS缓冲液混合后，将该混合物料置于超声发生仪中处理20-40min，超声功率为40-80W，处理过程中保持该混合物料的温度为24-35℃，经过处理后的微藻的长度为2-30μm；所述微藻的形态为聚合群体、丝状体、长条带状中的任意一种。

优选地，所述浓缩藻液中微藻的细胞密度不少于1.0×10⁷个/mL。

优选地，所述浓缩藻液中微藻的细胞密度为1.0-6.0×10⁷个/mL。

优选地，所述浓缩藻液与PBS缓冲液混合时，每克浓缩藻液中加入300-400mLPBS缓冲液。

优选地，所述浓缩藻液是将经过无菌培养的微藻培养液经过离心等浓缩处理后收集的藻体细胞。

优选地，所述微藻培养液离心处理时，转速为5000-6000rpm，离心时间为5-10min。

优选地，所述形态为长条带状的微藻为骨条藻属中的任意一种。

优选地，所述形态为聚合群体或丝状体的微藻为螺旋藻属中的任意一种。

本发明由于采用了上述技术方案，具有以下有益效果：

1、本发明克服了微藻破碎会破坏微藻细胞的技术缺陷，实现了形态为聚合群体、丝状体、长条带状的微藻在细胞与细胞之间的破碎，使细胞内的生物活性成分保留在细胞内，避免了生物活性成分的损失，尽可能保留微藻的营养成分。

2、本发明在破碎微藻的过程中，添加了保护剂均匀分布在微藻颗粒周围，形成一层隔离屏障，降低了氧气同微藻细胞体的接触，保护了微藻活性成分不被氧化分解，进一步确保微藻生物活性成分不被氧化破坏。

3、本发明通过超声波处理，对超声波处理时间、超声波处理功率、处理温度、藻液浓度等因子进行多次试验筛选，优化出一套破碎效率高稳定性好的技术工艺，有效破碎率可达95％以上。

4、本发明由于不破坏藻体的细胞壁，只是将形态为聚合群体、丝状体、长条带状的微藻联生体进行细胞之间的破碎分离，使成列、成群或成簇的细胞群破碎成长度更短的细胞列或细胞群，甚至是破碎成单个藻体细胞，而藻细胞内营养成分得以有效保留，本方法获得的微藻破碎液，不仅满足对虾等水产动物育苗早期幼体各***期的摄食口径，而且充分供给了水产动物育苗早期的营养需求，从而达到提高水产动物育苗和养殖经济效益的目的。

附图说明

图1为钝顶螺旋藻藻体在不同超声波处理时间下的显微图片。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下举出优选实施例，对本发明进一步详细说明。然而，需要说明的是，说明书中列出的许多细节仅仅是为了使读者对本发明的一个或多个方面有一个透彻的理解，即便没有这些特定的细节也可以实现本发明的这些方面。

实施例1

一种利用超声波破碎钝顶螺旋藻的处理方法，包括如下步骤：将经过5d无菌培养的钝顶螺旋藻培养液在5000rpm的转速下离心10min，收集下层的藻细胞富集液，得到细胞密度为1.0×10⁷个/mL的浓缩藻液，在每克浓缩藻液中加入300mLPBS缓冲液，将该混合物料置于超声波清洗仪中处理20min，超声功率为80W，处理过程中保持该混合物料的温度为24℃，经过处理后，长度为4-8μm的钝顶螺旋藻占钝顶螺旋藻总量的88％。

实施例2

一种利用超声波破碎中肋骨条藻的处理方法，包括如下步骤：将经过2d无菌培养的中肋骨条藻培养液在5200rpm的转速下离心8min，收集下层的藻细胞富集液，得到细胞密度为2.6×10⁷个/mL的浓缩藻液，在每克浓缩藻液中加入320mLPBS缓冲液，将该混合物料置于超声波清洗仪中处理28min，超声功率为65W，处理过程中保持该混合物料的温度为28℃，经过处理后该混合物料中的中肋骨条藻85％以上以单细胞的形式存在。

实施例3

一种利用超声波破碎热带骨条藻的处理方法，包括如下步骤：将经过2d无菌培养的牟氏角毛藻培养液在5400rpm的转速下离心7min，收集下层的藻细胞富集液，得到细胞密度为3.7×10⁷个/mL的浓缩藻液，在每克浓缩藻液中加入340mLPBS缓冲液，将该混合物料置于超声波清洗仪中处理32min，超声功率为70W，处理过程中保持该混合物料的温度为30℃，经过处理后该混合物料中的牟氏角毛藻90％以上以单细胞的形式存在。

实施例4

一种利用超声波破碎曼氏骨条藻的处理方法，包括如下步骤：将经过3d无菌培养的铜绿微囊藻培养液在5700rpm的转速下离心6min，收集下层的藻细胞富集液，得到细胞密度为4.8×10⁷个/mL的浓缩藻液，在每克浓缩藻液中加入380mLPBS缓冲液，将该混合物料置于超声波清洗仪中处理35min，超声功率为75W，处理过程中保持该混合物料的温度为33℃，经过处理后该混合物料中的铜绿微囊藻92％以上以单细胞的形式存在。

实施例5

一种利用超声波破碎钝顶螺旋藻的处理方法，包括如下步骤：将经过4d无菌培养的钝顶螺旋藻培养液在6000rpm的转速下离心5min，收集下层的藻细胞富集液，得到细胞密度为6.0×10⁷个/mL的浓缩藻液，在每克浓缩藻液中加入400mLPBS缓冲液，将该混合物料置于超声波清洗仪中处理40min，超声功率为40W，处理过程中保持该混合物料的温度为34℃，经过处理后，长度为4-5μm的钝顶螺旋藻占钝顶螺旋藻总量的82％。

微藻破碎效果试验分析

为验证本发明的方法中，超声波处理时间、超声波功率、处理温度对微藻破碎效果的影响，发明人设计单因素试验，分别以超声波处理时间、超声波功率、PBS缓冲液温度为因子，测试它们对微藻破碎的效果。

以实施例1的钝顶螺旋藻的浓缩藻液为原料，以实施例1的方法进行破碎处理，并每间隔5分钟，观察钝顶螺旋藻的状态，结果见表1和图1。

表1超声波处理时间对微藻破碎效果的影响

超声波处理时间/min	破碎程度	超声波处理时间	破碎程度
				0	-	25	良好
5	良好	30	良好
				10	良好	35	一般
15	良好	40	较碎
				20	良好	45	破碎

如表1和图1所示，初始阶段，随着超声波处理时间的加大，钝顶螺旋藻的长度逐渐变小，破碎程度良好，藻丝段完整，生物活性物质未从细胞内泄漏，处理30min以后，随着钝顶螺旋藻的破碎程度越来越高，有生物活性物质泄漏，说明细胞壁被破坏，生物活性物质从细胞膜透过，钝顶螺旋藻的整体有效活性时间变短。因此，超声波处理30min为较佳选择。

发明人还进行了超声波功率、PBS缓冲液温度的影响试验，微藻破碎效果最好的条件为：超声波处理30min，超声波处理功率50W，PBS缓冲液温度为28℃，在此条件下经破碎之后长度为3-5μm钝顶螺旋藻占钝顶螺旋藻总量的95％以上，且藻丝段完整，有效活性时间长。