PGK1靶向siRNA干扰库及其应用
阅读说明：本技术 PGK1靶向siRNA干扰库及其应用 (PGK1 targeted siRNA interference library and application thereof ) 是由 胡宝英 王小林 高明德 沈爱国 于 2021-08-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了PGK1靶向siRNA干扰库及其应用,属于生物工程技术领域。本发明基于膀胱癌细胞存在异常的能量代谢的特点和治疗难点,通过抗膀胱癌基因治疗途径公开了一种PGK1靶向siRNA干扰库在膀胱癌的应用,并提供了该干扰库的三组siRNA核酸序列。细胞学实验表明此siRNA干扰库具有抑制膀胱癌细胞PGK1的蛋白表达和抑制癌细胞存活和增殖等重要功能。本发明为膀胱癌治疗提供了新的药物,对于膀胱癌的临床治疗及其靶向药物开发具有十分重要的应用价值。(The invention discloses a PGK1 targeted siRNA interference library and application thereof, belonging to the technical field of biological engineering. The invention discloses application of a PGK1 targeted siRNA interference library in bladder cancer through an anti-bladder cancer gene therapy approach based on the characteristic of abnormal energy metabolism of bladder cancer cells and treatment difficulty, and provides three groups of siRNA nucleic acid sequences of the interference library. Cytological experiments show that the siRNA interference library has important functions of inhibiting protein expression of bladder cancer cell PGK1, inhibiting cancer cell survival and proliferation and the like. The invention provides a new medicine for treating bladder cancer, and has very important application value for clinical treatment of bladder cancer and development of targeted medicines thereof.)
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，更具体地说，涉及一种PGK1靶向siRNA 干扰库及其应用。
背景技术
膀胱癌是第二常见的泌尿生殖系统恶性肿瘤，近90％的原发性膀胱癌是尿 路上皮引起的。70-80％的尿路上皮肿瘤表现为浅表(Ta，T1)，其余表现为肌肉浸 润(T2-4)或转移。
在膀胱癌进展过程中，某些基因的表达发生变化，是膀胱癌发生发展的关 键基因，成为膀胱癌治疗的潜在靶点。很多研究表明，磷酸甘油酸激酶PGK1 是糖酵解过程中的关键酶，能够催化产生ATP产生更高的糖酵解速率，导致肿 瘤细胞的能量代谢异常，最终促进肿瘤的生长。这些研究发现提示其作为药物 治疗靶点具有良好的应用前景。
糖酵解代谢异常与肿瘤的转移关系密切。肿瘤在转移过程中，需要通过改 造组织内部微环境，促使肿瘤细胞突破组织屏障，进入淋巴或血液循环，从而 转移到远端组织。糖酵解代谢异常可直接或间接提供众多的代谢产物促使肿瘤 转移，如乳酸和谷氨酰胺等。此外，糖酵解异常产生的中间产物如乙酰辅酶A 可以影响细胞的表观遗传，促进细胞发生上皮间质转化，使细胞从高粘附性的 上皮形态转变为易转移的间质形态。上皮间质转化过程中，细胞表面的上皮标 志物如E-cadherin表达下降，而间质标志物如N-cadherin、β-catenin、Vimentin 和相关调控因子如Snail、Twist和p-AKT发生上调，这些过程会诱导细胞发生 形态改变，从而促进肿瘤的发生。因此，通过干预糖酵解代谢异常抑制肿瘤细 胞的上皮间质转化是进行肿瘤治疗的一种有效的策略。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种 siRNA干扰库，采用siRNA干扰的方式抑制膀胱癌细胞的增殖。本发明的另一 目的是提供所述siRNA干扰库的应用。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
PGK1靶向siRNA干扰库，由三组siRNA组成，所述三组siRNA的具体序 列如下：
(1)5′-AGGAAGAAGGGAAGGGAAATT-3′，
5′-UUUCCCUUCCCUUCUUCCUTT-3′：
(2)5′-ACAAACAACCAGAGGAUUATT-3′，
5′-UAAUCCUCUGGUUGUUUGUTT-3′；
(3)5′-ACAGAAGGCUGGUGGGUUUTT-3′，
5′-AAACCCACCAGCCUUCUGUTT-3′。
所述的PGK1靶向siRNA干扰库在制备抗膀胱癌药物中的应用。
进一步地，所述的应用中，所述抗膀胱癌药物包括抑制膀胱癌细胞增殖的药 物。
进一步地，所述的应用中，所述抗膀胱癌药物包括抑制膀胱癌细胞对葡萄糖 摄取的药物。
进一步地，所述的应用中，所述抗膀胱癌药物包括抑制膀胱癌细胞乳酸脱氢 酶的活性的药物。
进一步地，所述的应用中，所述抗膀胱癌药物包括抑制膀胱癌细胞上皮间质 转化现象的药物。
一种抗膀胱癌药物，含有PGK1靶向siRNA干扰库，所述PGK1靶向siRNA 干扰库由三组siRNA组成，具体序列如下：
(1)5′-AGGAAGAAGGGAAGGGAAATT-3′，
5′-UUUCCCUUCCCUUCUUCCUTT-3′；
(2)5′-ACAAACAACCAGAGGAUUATT-3′，
5′-UAAUCCUCUGGUUGUUUGUTT-3′；
(3)5′-ACAGAAGGCUGGUGGGUUUTT-3′，
5′-AAACCCACCAGCCUUCUGUTT-3′。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明公开了一种PGK1靶向siRNA干扰库及其应用，属于生物工程技术 领域。本发明基于膀胱癌细胞存在异常的能量代谢的特点和治疗难点，通过抗膀 胱癌基因治疗途径公开了一种PGK1靶向siRNA干扰库在抗膀胱癌中的应用， 并提供了该干扰库的三组siRNA核酸序列。本siRNA干扰库克服了单独的PGK1 靶向siRNA脱靶效应和干扰效率不稳定等问题，可以对PGK1在膀胱癌细胞中 做到更有效和稳定的干扰抑制作用。细胞学实验表明此siRNA干扰库具有抑制 膀胱癌细胞PGK1的蛋白表达、抑制癌细胞存活和癌细胞增殖，以及拮抗癌细胞 上皮间质转化等功能。本发明为膀胱癌的治疗提供了新的药物，对于应用于肿瘤 的临床治疗及靶向药物开发具有十分重要的应用价值。
附图说明
图1为小干扰库中的片段转染膀胱癌细胞后的PGK1表达达结果图；
图2为小干扰库转染膀胱癌细胞与对照组增长比较图；
图3为小干扰库转染膀胱癌细胞与对照组的不同分裂时期细胞数量图，其 中，图A是对照组转染膀胱癌流式细胞图，图B小干扰库转染膀胱癌细胞流式 细胞图，图C是图A和图B不同分裂时期细胞数量统计对比图；
图4为小干扰库转染膀胱癌细胞与对照组的葡萄糖含量比较图；
图5为小干扰库转染膀胱癌细胞与对照组的乳酸浓度比较图；
图6为小干扰库转染膀胱癌细胞与对照组上皮间质转化标志物表达对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
实施例1：
第一步：
PGK1靶向siRNA干扰库组成的三种siRNA的构建具体序列如下，
si-PGK1：
(1)5′-AGGAAGAAGGGAAGGGAAATT-3′，
5′-UUUCCCUUCCCUUCUUCCUTT-3′；
(2)5′-ACAAACAACCAGAGGAUUATT-3′，
5′-UAAUCCUCUGGUUGUUUGUTT-3′；
(3)5′-ACAGAAGGCUGGUGGGUUUTT-3′，
5′-AAACCCACCAGCCUUCUGUTT-3′；
对照组siRNA序列(阴性对照序列)：
5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，
5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。
将上述小干扰库中的片段和对照组siRNA序列分别转染膀胱癌细胞株T24 后12h换液，转然后第三天，收集细胞样品并利用免疫印迹实验分析PGK1的表 达。如图1所示，对照组Con-si转染阴性对照siRNA序列的细胞，其PGK1蛋 白表达量明显高于小干扰库siRNA转染的细胞。
第二步：PGK1靶向siRNA干扰库抑制膀胱癌存活和增殖
1、CCK8实验证明PGK1靶向siRNA干扰库的抗肿瘤存活效应
将膀胱癌细胞T24和UMUC3分别以2000个/孔的密度接种于96孔培养板， 利用转染试剂将PGK1靶向siRNA干扰库的片段和对照组siRNA序列瞬时转染 T24和UMUC3细胞，分别在0h、24h、48h、72h、96h后每孔加入10μl CCK-8 溶液，2小时后，选择波长450nm，在酶联免疫检测仪上测定不同时间点每个孔 的光吸收值，记录结果。吸收值大小反映了细胞活性，根据实验数据，以时间为 横坐标，吸收值为纵坐标作图。CCK-8结果显示与对照组相比，小干扰库实验 组显著抑制了T24和UMUC3细胞的增殖，如图2所示。
2、PI染色流式细胞术周期实验证明PGK1靶向siRNA干扰库的抗肿瘤增殖 效应
将膀胱癌细胞T24，以20000个/孔的密度接种于6孔培养板，利用转染试 剂将PGK1小干扰片段和其它对照组瞬时转染T24和UMUC3细胞，3天收集细 胞。用预冷的细胞PBS重悬洗涤3次，离心，弃掉PBS，使用预冷的70％乙醇 重悬，置于-20℃固定至少24h。检测前，离心收集细胞，去除乙醇，用细胞PBS 洗涤3次，并用200μL含有1％Triton X-100的PBS进行通透处理。继而，加300μL 的RNaseA，避光4℃处理。随后加入200μL的PI染料，避光4℃，20min。最后使用PBS洗涤去除PI染料，使用流式细胞仪上机检测。结果如图3所示：与 对照组相比，小干扰库实验组T24细胞主要阻滞在G2期，说明si-PGK1干扰库 能显著抑制T24的细胞周期进程。
第三步：PGK1靶向siRNA干扰库抑制膀胱癌代谢功能
1、葡萄糖浓度检测实验
1)将膀胱癌细胞系T24培养分为对照siRNA组(Con-si)和PGK1的siRNA 干扰库组(si-PGK1)，3天收集细胞到离心管内，离心后弃上清；
2)离心收集细胞，按照细胞数量每106个需要裂解液体积为0.1mL的比例， 震荡裂解后室温静置10分钟；
3)在葡萄糖标准品、Con-si组和si-PGK1组的裂解液加入96孔板中，每组 做3个复孔，分别按比例如下表，加入组织细胞葡萄糖氧化酶法测定试剂盒(爱 必信，abs47047405)中的工作液(取8mL的试剂R1与2mL的试剂R2混合得 到10mL工作液，当天使用)。
4)将上述96孔板在37℃反应20min。
5)与酶标仪波长490nm检测每孔OD值
6)葡萄糖浓度(mmol/L)＝标准品浓度*(样品管OD-空白管OD)/(标准 管OD-空白管OD)。
结果如图4所示，以PGK1的siRNA干扰库感染膀胱癌细胞系T24可以明 显抑制癌细胞对葡萄糖的摄取。
2、乳酸脱氢酶活性检测实验
1)将膀胱癌细胞系T24培养分为对照siRNA组(Con-si)和PGK1的siRNA 干扰库组(si-PGK1)，每组重复3次或以上，3天收集细胞培养上清；
2)使用乳酸测试盒(南京建成，A019-2-1)中的推荐比例分别加对应的试 剂，如下表所示：
3)使用乳酸不同浓度的标准管(1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、 5mmol/L、6mmol/L)和测定的OD值，绘制乳酸标准曲线，计算标准曲线方程 式。
4)使用标准曲线计算待测样品Con-si组和si-PGK1组的乳酸浓度。
结果如图5所示，以PGK1的siRNA干扰库感染膀胱癌细胞系T24可以明 显抑制乳酸脱氢酶的活性。
第四步：PGK1靶向siRNA干扰库抑制细胞上皮间质转化标志物表达
1)将膀胱癌细胞系T24培养分别转染对照siRNA组(Con-si)和PGK1的 siRNA干扰库组(si-PGK1)，转染3天收集细胞到离心管内，离心后弃上清；
2)将细胞利用适量的RIPA细胞裂解液(50mM Tris-Cl pH 8.0，150mM NaCl，0.5％Sodium Deoxycholate，0.1％SDS，1*蛋白酶抑制剂)，冰上放置30分钟， 随后在13000g，4℃离心15分钟，收集上清裂解液；
3)将上清裂解液利用Bio-Rad BCA蛋白定量法定量Con-si和si-PGK1组中 的蛋白浓度。方法：将BCA试剂盒中的A液和B液以50∶1的比例混匀，以200μL/ 孔加入96孔板中，随后加入2mg/mL的蛋白标准品10μL或Con-si和si-PGK1 组上清液2.5μL，37℃孵育30分钟，在酶标仪中检测各组中的595nm的吸光度， 利用线性回归计算出各组中的蛋白浓度，将蛋白样品利用SDS上样缓冲液稀释 为2μg/μL，在沸水中煮沸5分钟；
4)将上述样品上样至10％SDS-PAGE凝胶电泳中，在100V条件下分离上 述蛋白样品，分离结束后利用Bio-Rad蛋白转膜系统转膜样品至PVDF膜中；
5)将转移后的PVDF膜利用含5％脱脂牛奶的TBST溶液(20mM Tris-C1 pH 7.6，150mM NaCl，0.05％吐温-20)封闭1分钟，随后将膜与各上皮间质标志物 的抗体进行孵育过夜；
6)孵育结束后，利用TBST溶液洗涤PVDF膜3次，每次5分钟，随后将 PVDF膜与HRP标记的二抗进行孵育，孵育结束后利用TBST溶液洗涤PVDF 膜3次，每次5分钟；
7)将上述PVDF膜利用增强的化学荧光底物进行孵育，并利用胶片显影出 各上皮间质标志物的条带信号进行分析。
结果如图6所示，与对照组相比，以PGK1的siRNA干扰库感染膀胱癌细 胞系T24细胞表面的上皮标志物E-cadherin表达上调，而间质标志物N-cadherin、 Vimentin和相关调控因子如Twist和p-AKT发生下调，说明该干扰库可以明显拮 抗癌细胞上皮间质转化功能。
序列表
<110> 南通大学
<120> PGK1靶向siRNA干扰库及其应用
<130> 100
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> si-PGK1-1-F(Artificial)
<400> 1
aggaagaagg gaagggaaa 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> si-PGK1-1-R(Artificial)
<400> 2
uuucccuucc cuucuuccu 19
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> si-PGK1-2-F(Artificial)
<400> 3
acaaacaacc agaggauua 19
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> si-PGK1-2-R(Artificial)
<400> 4
uaauccucug guuguuugu 19
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> si-PGK1-3-F(Artificial)
<400> 5
acagaaggcu gguggguuu 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> si-PGK1-3-R(Artificial)
<400> 6
aaacccacca gccuucugu 19
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