一种猪种种质资源的快速保存方法
阅读说明：本技术 一种猪种种质资源的快速保存方法 (Method for rapidly preserving pig germplasm resources ) 是由 苗义良 张霞 刘鑫 余智盛 窦成利 徐天 于 2021-09-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种猪种种质资源的快速保存方法,属于组织工程技术领域。本发明公开的一种猪种种质资源的快速保存方法,包括一种冻存猪耳组织的冻存液,冻存液以含有胎牛血清的磷酸盐缓冲液为基础液,添加乙二醇和二甲基亚砜；还包括解冻液,解冻液以含有胎牛血清的磷酸盐缓冲液为基础液,添加海藻糖。采用本发明的冻存液对猪耳组织进行低温冻存,可有效实现猪耳组织长期低温保存的效果,配合使用解冻液解冻后可获得用于培养的猪成纤维细胞,达到保存猪种种质资源的目的。(The invention discloses a method for rapidly preserving a swine germplasm resource, belonging to the technical field of tissue engineering. The invention discloses a method for rapidly preserving pig germplasm resources, which comprises a frozen stock solution for freezing and storing pig ear tissues, wherein the frozen stock solution takes phosphate buffer solution containing fetal calf serum as a base solution, and is added with glycol and dimethyl sulfoxide; the anti-freezing solution is prepared by taking phosphate buffer solution containing fetal calf serum as base solution and adding trehalose. The cryopreservation liquid provided by the invention is used for cryopreservation of the pig ear tissues at low temperature, so that the effect of long-term cryopreservation of the pig ear tissues can be effectively realized, and pig fibroblasts for culture can be obtained after unfreezing by using the unfreezing liquid in a matching manner, so that the purpose of storing the germplasm resources of pig breeds is achieved.)
技术领域
本发明涉及组织工程技术领域，更具体的说是涉及一种猪种种质资源的快速保存方法。
背景技术
我国地方猪的种质资源非常丰富，但非洲猪瘟作为广泛传播的高致死疫病，严重威胁着我国地方猪的种质资源保存。目前只能通过冻存体细胞和精液的方式来保存猪种种质资源，但这两种方法都存在弊端，体细胞保存需将新鲜的组织运送到细胞室进行细胞分离培养再冻存，不仅成本高而且不能在猪场现场操作，而精液冻存因猪个体差异大，只有部分猪的精液适宜冻存。如何建立新型的保存方法来有效保护地方和新培育猪种的种质资源已成为当前我国应对非洲猪瘟重大突发事件的关键。
因此，提供一种非洲猪瘟疫情下我国猪种种质资源的快速保存方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种猪种种质资源的快速保存方法，利用冻存液冻存猪耳组织，在冻存液中添加海藻糖可有效实现猪耳组织的冻存，并在解冻后可通过原代培养获得有活力的猪成纤维细胞。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种猪种种质资源的快速保存方法，具体步骤如下：
(1)使用液氮快速冷冻法对猪耳组织进行冻存，将猪耳组织在猪场现场消毒，修剪成组织块；
(2)将步骤(1)所述的组织块放入预处理液中处理，再放入冻存液中处理；
所述预处理液以含体积分数为20％胎牛血清(FBS)的磷酸盐缓冲液(PBS)为基础液，添加体积分数为7.5％的乙二醇、7.5％的二甲基亚砜；
所述冻存液以含体积分数为20％胎牛血清的磷酸盐缓冲液为基础液，添加体积分数为15％的乙二醇、15％的二甲基亚砜、0.1M的海藻糖；
(3)将步骤(2)处理后的组织块放在冻存管中，向冻存管中添加液氮。
进一步，步骤(1)所述组织块大小为5mm×1mm×1mm。
进一步，步骤(2)将步骤(1)所述的组织块放入预处理液中处理5min，再放入冻存液中处理5min。
进一步，所述的一种猪种种质资源的快速保存方法，还包括步骤(4)：将冻存的猪耳组织放入解冻液I中处理5min，再放入解冻液II中处理5min，通过组织块原代培养获得有活力的猪耳成纤维细胞；
所述解冻液I以含体积分数为20％胎牛血清的磷酸盐缓冲液为基础液，添加0.1M的海藻糖；所述解冻液II以含体积分数为20％胎牛血清的磷酸盐缓冲液为基础液，添加0.05M的海藻糖。
乙二醇(EG)和二甲基亚砜(DMSO)是渗透性冷冻保护剂，分子量较低，可以通过细胞膜的脂质双分子层渗入细胞内部；其保护机制是在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤。
海藻糖是非渗透性冷冻保护剂，分子质量较大，不能渗透到细胞内部，能够促进溶液玻璃化状态的形成，并且可以提高细胞悬液和整个器官的冷冻保存过程中的细胞活力。另外，有研究证明海藻糖具有清除自由基的能力。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种猪种种质资源的快速保存方法，猪耳组织冻存液可以有效地对猪耳组织进行低温保存，组织解冻后可以成功分离出可以培养的成纤维细胞；本发明方法步骤简单，在猪场使用该方法可以直接冻存猪耳组织。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明使用不同冻存液冷冻猪耳组织再解冻后培养第7天时的细胞克隆数；*：p<0.05；
图2附图为本发明将剪碎为不同程度的猪耳组织冻存再解冻后培养第7天时的细胞克隆数；
图3附图为本发明冻存不同时间的猪耳组织解冻后培养出的原代成纤维细胞；
其中，ab c为冻存一天后，解冻；a细胞从组织块迁移出来；b培养第7天，c传代后细胞生长情况；
d e f为冻存一周后，解冻；d细胞从组织块迁移出来；e培养第7天，f传代后细胞生长情况；
g h i为冻存一个月后，解冻；g细胞从组织块迁移出来；h培养第7天；i传代后细胞生长情况；
图j k l为冻存三个月后，解冻；j细胞从组织块迁移出来；k培养第7天；l传代后细胞生长情况；
均为100倍镜下采图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
PBS为HyClone公司产品，FBS为VISTECH公司产品，海藻糖为麦克林公司产品,DMEM为赛默飞世尔科技公司的产品，EG和DMSO为Sigma公司产品，胰酶、青链霉素均别为Gibco公司的产品。
实施例1
(1)配制处理液
A、预处理液：PBS中添加7.5％EG+7.5％DMSO+20％FBS；
B、冻存液：PBS中添加15％EG+15％DMSO+20％FBS+0.1M海藻糖；
C、解冻液I：PBS中添加20％FBS及0.1M海藻糖；
D、解冻液II：PBS中添加20％FBS及0.05M海藻糖；
E、细胞培养液：DMEM中添加15％FBS及100IU/mL青链霉素。
上述百分比均为体积分数，配制完成后用0.22μm滤器过滤到无菌的50mL离心管中，每管10mL液体，置于4℃冰箱保存，使用前在室温下放置15min。
(2)猪耳组织的冻存方法
猪耳组织来自华中农业大学种猪测定中心猪场。将离体的猪耳组织用碘酒消毒后，使用两支灭菌的止血钳夹住一块耳缘组织，剪下呈扇形的猪耳组织，浸入75％酒精消毒1min后，再用加500IU/mL青链霉素的PBS清洗数遍。接下来使用眼科剪将猪耳组织修剪成5mm×1mm×1mm的组织块，在预处理液中室温浸泡5min，再在冻存液中室温浸泡5min，将处理后的组织块转移至冻存管中，在冻存管中加入液氮，拧紧盖子，投入液氮罐中保存。
(3)冻存猪耳组织的解冻方法
将装有组织的冻存管从液氮罐中取出，打开盖子后，静置20-30s，待液氮蒸发完全，将冻存组织转移至解冻液I中室温浸泡5min，再转移至解冻液II中室温浸泡5min，再转移至添加体积分数为20％FBS的PBS中，室温浸泡5min，最后用PBS清洗干净。接下来将猪耳组织块放入1.5mL EP管中用眼科剪剪碎，加入0.05％的胰酶，38.5℃消化30min，加入含血清的细胞培养液终止消化，1200转每分钟离心5min，弃上清后加入细胞培养液，接种在6孔板中，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养。3-5天内尽量不晃动培养板。待有细胞贴壁后隔天换液。
试验例
(1)使用不同冻存液冷冻猪耳组织再解冻后培养第七天时的细胞克隆数
将猪耳组织块放入不同的冻存液中处理，冻存一天后解冻。其余操作步骤和参数同实施例1保持一致。冻存液分别为：PBS中添加15％EG+15％DMSO+20％FBS+0.1M海藻糖(0.1M海藻糖，实验组)；PBS中添加15％EG+15％DMSO+20％FBS+0.5M海藻糖(0.5M海藻糖，对照组1)；PBS中添加15％EG+15％DMSO+20％FBS+0.5M蔗糖(0.5M蔗糖，对照组2)；PBS中添加15％EG+15％DMSO+20％FBS+0.5M蔗糖+0.1M海藻糖(0.5M海藻糖，对照组3)。
统计使用不同冻存液冷冻猪耳组织再解冻后培养第7天时的细胞克隆数(个)，结果见图1。图1结果显示，解冻后，培养第7天时，添加0.1M海藻糖组的细胞克隆数显著高于其他三组，其他三组之间差异不显著。说明0.1M海藻糖组的冷冻保护效果优于添加0.5M蔗糖组和0.5M海藻糖组以及同时添加0.5M蔗糖和0.1M海藻糖组。
(2)将剪碎为不同程度的猪耳组织冻存再解冻后培养第7天时的细胞克隆数
将组织剪碎后(<1mm3)冻存(剪碎冻存)以及将组织剪成5mm×1mm×1mm的条状冻存(条状冻存)，冻存一天解冻后培养7天。其余操作步骤和参数同实施例1保持一致。
统计将剪碎为不同程度的猪耳组织冻存再解冻后培养第7天时的细胞克隆数(个)，结果见图2。图2结果显示，剪成碎片组平均有49个克隆，剪成条状组平均有58个克隆，两组差异不显著。说明剪成条状组冻存后，不影响解冻后的细胞克隆生成率，而且这种方法在猪场更容易操作，并且简化了冻存程序。
在非洲猪瘟疫情蔓延下，可使用此方法迅速对猪场所有猪种进行猪耳组织冻存，并标记编号。在对所有种猪是否患有非洲猪瘟进行采样检测后，可弃掉非洲猪瘟检测为阳性的猪耳组织，进一步对健康的猪种种质资源进行针对性保存。
(3)冻存不同时间的猪耳组织解冻后培养出的原代成纤维细胞
分别解冻了冻存一天、一周、一个月和三个月后的猪耳组织块，并进行原代培养操作。具体操作步骤和参数同实施例1保持一致。结果见图3，结果发现，解冻了冻存一天、一周、一个月和三个月后的猪耳组织块，均能够迁移出增殖活力旺盛且可以继续传代的原代成纤维细胞，说明用本发明方法可以长期保存猪的耳组织。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。