聚电解质包覆载药Gd2O3@介孔二氧化硅纳米粒子的制备和应用
阅读说明：本技术 聚电解质包覆载药Gd2O3@介孔二氧化硅纳米粒子的制备和应用 (Polyelectrolyte-coated drug-loaded Gd2O3Preparation and application of @ mesoporous silica nanoparticles ) 是由 贺克武 余永强 沈玉先 于 2021-08-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种聚电解质包覆载药Gd-(2)O-(3)@介孔二氧化硅纳米粒子的制备和应用,涉及药物化学技术领域,本发明采用一步法将合成的Gd-(2)O-(3)纳米粒子负载于MSN的介孔壁上,运用煅烧法去除合成模板CTAB,利用超声震荡法将DOX负载于MSN的介孔内,利用LBL法将pH响应物PAH/P(DMA-co-TPAMA)包覆于MSN的表面,并在包覆材料的最外层接叶酸作为靶向剂,从而制备了pH响应性聚电解质包覆载药Gd-(2)O-(3)@介孔二氧化硅纳米粒子,使其具有癌细胞靶向性、癌细胞微环境响应药物控释性和MRI对比剂增强效果,从而实现诊疗一体化、抗癌药物示踪和疗效实时监测等目的。(The invention discloses a polyelectrolyte-coated drug-loaded Gd 2 O 3 The invention discloses preparation and application of @ mesoporous silica nanoparticles, relates to the technical field of pharmaceutical chemistry, and adopts a one-step method to synthesize Gd 2 O 3 Nano particles are loaded on mesoporous walls of MSN, a calcination method is used for removing a synthetic template CTAB, an ultrasonic oscillation method is used for loading DOX in mesopores of the MSN, a LBL method is used for coating a pH responder PAH/P (DMA-co-TPAMA) on the surface of the MSN, and the outermost layer of a coating material is provided with folic acid as a targeting agent, so that the pH responsive polyelectrolyte coated drug-loaded Gd is prepared 2 O 3 The @ mesoporous silica nanoparticle has cancer cell targeting property, cancer cell microenvironment response drug controlled release property and MRI contrast agent enhancement effect, so that the purposes of diagnosis and treatment integration, anti-cancer drug tracing, real-time curative effect monitoring and the like are achieved.)
技术领域
：本发明涉及药物化学技术领域，具体涉及一种聚电解质包覆载药Gd2O3@介孔二氧化 硅纳米粒子的制备和应用。
背景技术
：肝癌是我国常见病及多发病，尽管目前针对肝癌的治疗发展了多种方法，如外科手术 切除、TACE、射频消融、全身化疗、基因靶向药物治疗、免疫治疗、放疗等，但我国肝 癌无论发病率还是死亡率均逐年增加。目前制约肝癌疗效的关键因素是难以早期发现、早 期确诊、早期治疗肿瘤。近年来全世界范围内对纳米材料的医学应用的广泛关注和深入研究，尤其是靶向剂、肿瘤内环境响应材料、多模态成像、诊疗一体化等领域的快速发展， 并在此基础上形成了一门新的学科-治疗诊断学(theranostic)。其具有可视化药物体内递送过程，可视化药物在病灶内分布、释放、代谢过程，诊疗一体化，实现肿瘤治疗的实时监 控和个体化给药等优点，这有助于实现肿瘤诊治三“早”目标、精准化及个性化治疗、无 创实时在体监测等目标。
钆是一种顺磁性镧系金属，具有易与水配位，弛豫效率高等优点，但游离的Gd3+在静 脉血中易沉淀析出，毒性强，常通过制成螯合物以降低毒性后才能使用。螯合物的引入在 一定的程度上降低了Gd3+的毒性，但也因此占据了Gd3+的大部分水配位点，降低了Gd3+的弛豫率。这些螯合物进入体内后部分会被降解，从而导致Gd3+的异常沉积于重要的脏器， 如脑、骨骼等。如何制备一种新型Gd3+对比剂，使其既具有高弛豫率，又不易泄露进入血 循环是研究重点。
MSN是指孔径介于2-50nm的一类介孔材料，因其比表面积高，孔径均一可调并且维度 有序，良好的生物相容性，表面有大量的硅羟基等优点，在药物装载、运输与催化反应、分子影像等方面具有重要的应用价值。将Gd3+装载到MSN中的方法包括将Gd3+封装和/或附着在MSN的孔隙或二氧化硅骨架上。后者不仅避免了Gd3+的泄露，而且有利于水中的氢原 子与磁性中心的交换，从而增加了r1弛豫率，同时空出的介孔内的空间有利于负载更多的 抗癌药物。
在正常分化的成熟细胞中，细胞内pH值(pHi)通常在7.2以下，细胞外pH值(pHe)通常 在7.4以下。然而，癌细胞pHi高于7.4，pHe约为6.7-7.1。这种“反向”的pH梯度是大多数癌细胞的自适应特征，而与它们的组织来源或遗传背景无关。溶酶体是从高尔基体和内质网(ER)中产生的细胞器，在细胞自噬方面有着非常重要的作用。囊泡型H+-ATP酶(V-ATP酶)将质子泵入溶酶体，形成一个由磷脂膜包裹的酸性囊腔(pH值约为4.5-5.0)。溶酶体含有许多pH敏感的酶，包括脂肪酶、肽酶、核酸酶、糖苷酶、磷酸酶和水解大分子的硫酸盐酶。 癌细胞与正常细胞内环境的差异，为制备pH敏感对比剂提供了条件。
本发明旨在提供一种聚电解质包覆载药Gd2O3@介孔二氧化硅纳米粒子，使其具有癌 细胞靶向性、癌细胞微环境响应药物控释性和MRI对比剂增强效果，从而实现诊疗一体化， 抗癌药物示踪和疗效实时监测等目的。
发明内容
：本发明所要解决的技术问题在于提供一种聚电解质包覆载药Gd2O3@介孔二氧化硅纳 米粒子的制备方法，使用透射电镜、扫描电镜、X射线衍射仪、全自动微孔物理吸附和化学吸附分析仪、核磁共振波谱仪，傅里叶变换红外光谱、热重分析仪、荧光分光度计、粒 子分析仪、电感耦合等离子发射光谱仪、双光束UV/Vis分光光度计等手段对其进行了表征，并且研究显示其具有癌细胞靶向性、癌细胞微环境响应药物控释性和MRI对比剂增强效果。
本发明所要解决的技术问题采用以下的技术方案来实现：
本发明的一个目的是提供一种聚电解质包覆载药Gd2O3@介孔二氧化硅纳米粒子的制 备方法，包括以下步骤：
(1)Gd2O3纳米粒子的合成：由氯化钆六水合物和二乙二醇合成Gd2O3纳米粒子；
(2)Gd2O3@MSN的合成：由Gd2O3纳米粒子、CTAB和TEOS合成Gd2O3@MSN：
(3)P(DMA-co-TPAMA)和FA-P(DMA-co-APMA)的合成：由DMA和APMA反应得到 P(DMA-co-APMA)，再由P(DMA-co-APMA)分别与THPA、FA反应得到P(DMA-co-TPAMA) 及FA-P(DMA-co-APMA)；
(4)Gd2O3@MSN的氨基化：用APTES对Gd2O3@MSN进行氨基化改性，得到Gd2O3@ MSNs-NH2；
(5)Gd2O3@MSN-DOX和FA-Gd2O3@MSN-DOX的制备：用Gd2O3@MSNs-NH2负载药 物DOX，然后分别用P(DMA-co-TPAMA)和PAH进行交替处理以多层包覆聚电解质，再用 PAH或FA-P(DMA-co-APMA)进行最外层聚电解质包覆，得到表面不含FA的Gd2O3@MSN- DOX和表面含有FA的FA-Gd2O3@MSN-DOX。
P(DMA-co-TPAMA)和FA-P(DMA-co-APMA)的合成路线图如下：
本发明的第二个目的是提供上述合成的Gd2O3@MSN在制备MRI对比剂中的应用。
本发明的第三个目的是提供上述合成的Gd2O3@MSN-DOX和FA-Gd2O3@MSN-DOX在 制备抗肿瘤药物中的应用。
所述肿瘤包括肝癌、宫颈癌、肺癌，但并不限于此。
化合物的简称说明：
CTAB：十六烷基三甲基溴化铵；
TEOS：正硅酸四乙酯；
DMA：N,N-二甲基丙烯酰胺；
APMA：N-(3-氨丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐；
THPA：四氢苯酐；
FA：叶酸；
APTES：3-氨基丙基三乙氧基硅烷；
DOX：阿霉素盐酸盐；
PAH：聚(烯丙胺盐酸盐)。
本发明的有益效果是：本发明采用一步法将合成的Gd2O3纳米粒子负载于MSN的介孔 壁上，运用煅烧法去除合成模板CTAB，利用超声震荡法将DOX负载于MSN的介孔内，利 用LBL法将pH响应物PAH/P(DMA-co-TPAMA)包覆于MSN的表面，并在包覆材料的最外层 接叶酸作为靶向剂，从而制备了pH响应性聚电解质包覆载药Gd2O3@介孔二氧化硅纳米粒 子，使其具有癌细胞靶向性、癌细胞微环境响应药物控释性和MRI对比剂增强效果，从而 实现诊疗一体化、抗癌药物示踪和疗效实时监测等目的。
说明书附图：
图1为(a)Gd2O3纳米粒子的透射电镜图；(b)合成的MSN经盐酸回流去除CTAB后的透射 电镜图；(c)Gd2O3@MSN的扫描电镜图；(d)Gd2O3@MSN的透射电镜图；
图2中(a)、(b)分别是用1％盐酸溶液回流24h和在600℃高温焙烧3h的Gd2O3@MSN的TEM-EDS图像；(c)通过上述两种方法获得的主要元素的含量对比柱状图；(d)在600℃高温焙烧3h后，通过高温焙烧除去CTAB后的裸Gd2O3@MSN的XPS检测图；
图3为裸Gd2O3@MSN的氮吸附与脱附检测及小角X射线散射检测图；(a)BET氮吸附及脱附等温曲线；(b)BET比表面积曲线；(c)BJH孔径分布曲线；(d)小角度X射线散射曲线；
图4中(a)、(b)分别为P(DMA-co-APMA)和P(DMA-co-TPAMA)在D2O中的1H NMR波谱，(c)P(DMA-co-FAPMA)在DMSO-d6中的1H NMR波谱；
图5为P(DMA-co-TPAMA)在pH 5.0的PBS液中搅拌24h前(a)后(b)1H NMR波谱分析(A)， 溶剂为D2O和FT-IR波谱分析(B)；
图6为(a)裸Gd2O3@MSN、裸Gd2O3@MSN-NH2、P(DMA-Co-TPAMA)和多层聚合物包 覆的Gd2O3@MSN的FT-IR光谱；(b)裸Gd2O3@MSN-NH2与阴离子P(DMA-Co-TPAMA)和阳 离子PAH交替沉积的Zeta电位的变化；(c)裸Gd2O3@MSN、裸Gd2O3@MSN-NH2和FA- Gd2O3@MSN的热重分析图(TGA)；(d)Gd2O3@MSN的TEM图像；
图7为不同pH条件下Gd2O3@MSN-DOX(1mg/mL)水分散体的DOX释放曲线，嵌入图显示在前6h的DOX释放概况；
图8为在3.0T MRI中测试T1弛豫率(1/T1)，裸Gd2O3@MSN-NH2、裸[email protected]、 Gd-DTPA和pH响应聚合物涂层[email protected]以Gd3+浓度计算，在pH7.4 PBS中的弛豫 功能对比；
图9为FA-Gd2O3@MSN在pH 5.0去离子水中搅拌不同时间后3.0T MRI T1WI图像(a)及 相应的时间-信号强度曲线(b)；
图10为细胞活性检测结果，用不同浓度的Gd2O3@MSN、FA-Gd2O3@MSN、Gd2O3@ MSN-DOX和FA-Gd2O3@MSN-DOX处理(a)HepG2细胞、(b)Hela细胞、(c)A549细胞、(d)3T3 细胞后，采用Alamar蓝法测定的细胞活性曲线图；
图11为(a)CLSM观测HepG2细胞摄取FA-Gd2O3@MSN-DOX不同时间代谢分布图； (b)CLSM观测HepG2细胞摄取Gd2O3@MSN-DOX不同时间代谢分布图；(c)红色荧光(DOX) 定量分析HepG2细胞摄取FA-Gd2O3@MSN-DOX及Gd2O3@MSN-DOX随时间延长的变化； (d)CLSM观测Hela细胞摄取FA-Gd2O3@MSN-DOX不同时间代谢分布图；(e)CLSM观测Hela 细胞摄取Gd2O3@MSN-DOX不同时间代谢分布图；(f)CLSM观测HepG2细胞摄取游离DOX 在不同的时间代谢分布图；(g)CLSM观测Hela细胞摄取游离DOX在不同时间代谢分布图；
图12为不同纳米粒子诱导的细胞凋亡率-时间动态变化图，用AnnexinV-FITC和PI双染 流式细胞术分析Gd2O3@MSN、FA-Gd2O3@MSN、Gd2O3@MSN-DOX和FA-Gd2O3@MSN- DOX在MSN浓度为125μg/mL时与HepG 2细胞作用不同时间间隔后对细胞凋亡的影响，(a) 凋亡细胞分布图，(b)平均凋亡率柱状图，1：control；2：Gd2O3@MSN；3：FA-Gd2O3@MSN； 4：Gd2O3@MSN-DOX；5：FA-Gd2O3@MSN-DOX；
图13为FA-Gd2O3@MSN-DOX在细胞内药物释放过程中药物荧光寿命变化图；
图14为HepG2细胞与125μg/mL不同类型的纳米粒子孵育不同的时间Western Blot检测 结果；
图15为HepG2细胞(a)和Hela细胞(b)与125μg/mL不同类型的纳米粒子孵育48h后透射电镜检测结果；
图16为HepG2细胞与不同浓度的FA-Gd2O3@MSN、Gd2O3@MSN、Gd-DTPA孵育48h 后MRIT1WI图像(a)和信噪比曲线图像(b)；Hela细胞与不同浓度的FA-Gd2O3@MSN、 Gd2O3@MSN、Gd-DTPA孵育48h后MRI T1WI图像(c)和信噪比曲线图像(d)；细胞分散于 1％琼脂糖溶液中，3.0T MRI扫描。
具体实施方式
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为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合 具体实施例，进一步阐述本发明。
合成Gd2O3纳米粒子
2.4g GdCl3.6H2O和40ml DEG加入50ml反应釜中，旋紧密封螺丝，放置于恒温搅拌台上，750rpm，80℃，60min；打开反应釜，取1mmol/LNaOH 4.5ml加入反应釜中，充分 混匀，旋紧反应釜盖，750rpm，140℃，60min，然后改变反应条件为750rpm，180℃，240min， 停止反应，自然冷却。淡褐色产物移入容器中，加入400ml超纯水，充分混匀，4℃冰箱 保存。取10ul样品滴于TEM碳支持膜上，自然晾干，TEM上机检测。
合成Gd2O3@MSN
分析天平称取500mg CTAB放置于250mL圆底烧瓶内，缓慢加入220mL去离子水和20mL上述合成的Gd2O3溶液及1.75mL NaOH(2M)，反应条件：80℃油浴，800rpm搅拌， 反应30min；2.5mL TEOS缓慢泵入(2.5mL，15mL/h)，上述反应条件继续反应2h。 产物抽吸过滤，500mL去离子水及100mL甲醇冲洗。所得固体产物真空干燥箱30℃干燥 过夜。干燥后的产物分成两半，一半用马弗炉600℃煅烧3小时，另一半采用上述盐酸回 流的方法去除CTAB。分别取两种方法所得最终产物各1mg溶于10mL无水乙醇中，取10μL 行TEM纯碳膜涂片，TEM检测并进行TEM EDC检测样品元素含量。另取10uL行涂于 SEM硅片上。
煅烧法所得样品分别行粒度仪测粒子直径，傅里叶变换红外光谱测元素波普，X射线 衍射仪小角衍射测粒子孔径，全自动微孔物理吸附和化学吸附分析仪测粒子比表面积和介 孔内径。取1mg样品溶于2mL氢氟酸，600rpm充分搅拌，持续氮气输注，待氢氟酸挥发完全后，样品加入1mL去离子水混匀，电感耦合等离子发射光谱仪检测钆元素含量。
合成P(DMA-CO-TPAMA)及FA-P(DMA-co-APMA)
分析天平称取DMA(0.30g,3mmol)、APMA.HCl(0.36g,2mmol)、CTA(12mg)、Va044(3.2mg)放入5mL封液管中，然后加入0.2mL二氧六环和0.8mL去离子水，超声充分 混匀，三次冻融循环脱气，真空封存，45℃油浴，4h，液氮冷却，去离子水透析48h(pH 4–5， MWcutoff,3.0kDa)，样品冻干法干燥获得P(DMA-co-APMA)淡黄色粉末(0.35g，产率： 53％)。取10mg产物溶于1mLD2O中，送检1H NMR。
分析天平称取0.4g P(DMA-co-APMA)(约1.08mmol APMA)、30ml DMF(干)、0.78mlTEA(干，5.4mmol)加入50mL橡胶塞封口的圆底烧瓶内，0.20g THPA(1.3mmol，1.2equiv.)溶于5mL DMF(干)，然后加入上述烧瓶内，室温，600rpm搅拌，反应24h，减压蒸馏去 除多余溶液，产物溶于去离子水，随后去离子水透析24h(pH 8-9；MW cutoff,3.0kDa)，产 物冻干法干燥获得P(DMA-co-TPAMA)淡黄色粉末0.50g(产率：83.3％)。取10mg产物 溶于1mLD2O中，送检1H NMR。
分析天平称取0.1g P(DMA-co-APMA)(氨基含量～0.4mmol)、0.02g FA(0.045mmol) 加入50mL圆底烧瓶内，并用橡胶塞密封烧瓶，烧瓶内加入0.10g TEA(1mmol)、10ml DMSO、191.7mg EDC(1mmol)混匀，常温避光室温450rpm搅拌24小时，去离子水透 析48h(pH＝4-5，MW cutoff,3.0kDa)，220μm有机膜过滤，冻干法干燥获得FA-P(DMA-co-APMA)淡黄色粉末，FA含量约为13.7％。取10mg产物溶于1mLD2O中，送检1H NMR。
Gd2O3@MSN的氨基化
分析天平称取1gGd2O3@MSN投入250mL双口圆底烧瓶内，橡胶塞密封瓶口，瓶内 抽取80mL无水甲苯，真空抽吸，600rpm搅拌，45℃油浴共沸蒸馏30min，经橡胶塞注射5mLAPTES继续共沸蒸馏30min，600rpm搅拌，110℃油浴，氮气保护，反应20h；产物 抽吸过滤，分别用100mL甲苯和100mL无水乙醇洗涤2次，产物真空干燥箱干燥过夜。 取上述产物10mg行FT-IR检测。
pH响应多层聚电解质包覆负载DOX的Gd2O3@MSN-NH2的制备
分析天平称取Gd2O3@MSNs-NH2 60mg和25mg DOX投入50mL离心管内，加入25mL PBS缓冲液(0.02M，pH＝7.4)，室温，600rpm搅拌12小时，25℃，13000rpm离心15min， 去离子水洗两遍，去除无负载DOX。负载DOX的Gd2O3@MSNs-NH2在25℃条件下，分别 用P(DMA-co-TPAMA)(25.0mL，1.0g/L，pH 8)和PAH(25.0mL，1.0g/L，pH 6.8)交替处理， 每层沉淀后离心(13000rpm，15min，25℃)，用去离子水洗涤，去除多余的共聚物。最外 层为FA-P(DMA-co-APMA)或PAH。用荧光光谱法计算Gd2O3@MSN-DOX和FA-Gd2O3@ MSN-DOX的DOX负载量和在不同pH溶液中Gd2O3@MSN-DOX中的DOX释放量。不携载药 物的MSN表面所含有的P(DMA-co-TPAMA)/PAH层数用TGA测量，并采用FT-IR法表征包覆 多层电解质膜后的MSN的红外光谱。热重分析仪表征MSN表面包覆的聚合物重量。
MRI扫描表征Gd2O3@MSN作为MRI对比剂的性能
将裸Gd2O3@MSN、裸Gd2O3@MSN-NH2、FA-Gd2O3@MSN、Gd-DTPA分散在1mL 1％ 琼脂糖溶液中，Gd3+浓度分别为0.4、0.2、0.1、0.05、0mm，MRI扫描测量其弛豫速率。 采用西门子3.0T磁共振仪，人体肩部线圈，常规横断面，冠状扫描.SET1WI序列。具体参 数：T1WI(TR/TE300，400，500，600，800，1000ms/14ms)，回声链长20-40，扫描参数： 层厚2mm，层间距2mm，基质384×256，FOV 14cm×14cm，Nexus 2倍。
Gd2O3纳米粒子、MSN及裸Gd2O3@MSN的合成与表征
TEM观察证实了顺磁性Gd2O3纳米粒子的成功制备(图1-a)，其直径为3～5nm。CTAB在 超过临界胶束浓度(critical micelle concentration，CMC)时，在水溶液内形成大量的胶束， 以作为合成MSN的模板，在碱性液体内，TEOS硅酸盐阴离子通过强库仑力缩合在阳离子 表面活性剂CTAB胶束表面上，并最终形成球形MSN，通过盐酸溶液回流或煅烧的方法即 可获得含有大量有序排列的介孔纳米粒子(图1-b)。将前述合成的Gd2O3纳米粒子分散在MSN的前驱体TEOS中。碱的加入导致TEOS前体的水解和MSN的形成，使预分散的Gd2O3纳米粒子包覆到MSN中(简称裸Gd2O3@MSN)。TEM和SEM分析表明，负载Gd2O3的MSN 的平均直径为50nm(图1-c，d)。采用EDC法分别测量盐酸溶液回流法和煅烧的方法去除 CTAB后，MSN所含Gd3+质量百分比显示，盐酸回流的方法在去除CTAB的同时，也溶解掉 了介孔壁上的Gd2O3纳米粒子(图2a，b，c)。
在600℃高温焙烧3小时后，通过高温焙烧除去CTAB后的Gd2O3@MSN用XPS(图2d) 检测到Gd3d(～1125.3eV)和Gd4d(152.6eV)信号的存在。在氢氟酸(HF)中溶解Gd2O3@MSN 后，用ICP-AES法测定了Gd3+离子的准确含量为2.6wt％。这些结果清楚地表明Gd2O3纳米粒 子已成功地负载到MSN中。焙烧去除CTAB模板后，氮气吸收实验表明，制备的裸 Gd2O3@MSN为介孔材料典型的Ⅳ型等温曲线，即等温线的吸附曲线与脱附曲线不一致， 可以观察到迟滞回线，在高p/p0值区域可观察到一个平台(图3a)。以Relative Pressure(P/Po) 为横坐标，1/(Q(Po/P-1))为纵坐标作图，为一直线，根据公式Vm＝1/(斜率+截距)，再 根据BET比表面积计算公式SBET＝Vm.L.σm(L和σm为常数)，经计算合成的Gd2O3@MSN比 表面积为862.2m2/g(图3b)。用Barrett-JoynerHalenda(BJH)法和用小角度X射线散射法测量 介孔内径(图3c，d)，计算了Gd2O3@MSN的孔径分别为3.8nm和4nm。结果表明，Gd2O3纳米粒子在MSN中的包覆对MSN的微观结构没有明显的影响。
P(DMA-co-TPAMA)的合成及Gd2O3@MSN多层膜包覆与表征
采用可逆加成-断裂链转移(reversible addition fragmentation chaintransfer,RAFT)聚合 法合成了一种带正电荷的P(DMA-co-APMA)共聚物，用THPA对生成的胺残基进行改性， 生成带负电荷的pH不稳定的P(DMA-co-TPAMA)，在温和pH条件下通过酸性催化酰胺键 的水解，可使其发生改性重新生成含正电荷的P(DMA-co-APMA)。通过1HNMR分析证实 了P(DMA-co-APMA)和P(DMA-co-TPAMA)共聚物的成功制备，并对相应质子的信号进行 了归属(图4)。此外，还引入了细胞靶向剂叶酸(FA)改性的P(DMA-co-APMA)。1HNMR 分析也证实了FA功能化P(DMA-co-APMA)的成功形成，证明了FA在6～8ppm的特征信 号的出现，这些特征信号属于FA残基的芳香环(图4)。
进一步评价合成的P(DMA-co-TAPMA)共聚物的pH响应行为。尽管常规的胺键对酸性pH是惰性的，但先前的研究证实了THPA官能化的胺对轻度酸性pH敏感，而可再形成 胺前体。P(DMA-co-TAPMA)共聚物在pH 5.0下孵育24小时后，通过1HNMR分析(图5A)， 可见除去了THPA部分(～2.2ppm)的特征信号，并可见前体P(DMA-co-APMA)的信号再形 成。此外，FT-IR结果显示在酸处理时，羟基酸基团(2940cm-1和1540cm-1)的损失(图5B)。 这些结果有效地验证了p(DMA-co-TAPMA)共聚物的pH响应特性，与先前的结论一致。
MSN的介孔结构使得负载许多治疗剂成为可能，这些药物曾用于药物载体。为了减少 封装有效载荷的自发释放，本发明用APTES将MSN表面功能化，形成胺功能化的Gd2O3 @MSN(简称裸Gd2O3@MSN-NH2)。红外光谱证实了裸Gd2O3@MSN-NH2表面存在胺基团， 在2900cm-1处出现了广泛的N-H伸缩振动峰，在1562cm-1处出现了N-H的剪式振动峰(图 6a)。此外，裸Gd2O3@MSN-NH2的失重率比裸Gd2O3@MSN的7.1wt％增加了12.4wt％， 说明有机组分增加，间接证实了胺基团的成功接枝。Zeta电位测试表明，裸Gd2O3@MSN- NH2表面电荷为15mV(图6c)。值得强调的是正电表面的存在使得通过多价静电相互作用 吸收带负电荷的聚合物成为可能。在裸Gd2O3@MSN-NH2的水分散体系中加入 P(DMA-Co-TPAMA)，Zeta电位降低(图6c)。这可能意味着加入负电荷P(DMA-Co-TPAMA) 后表面电荷的变化。有趣的是，进一步添加带正电的PAH会导致Zeta电位的增加，Zeta 电位的变化可以被反复操纵多次(图6c)，表明聚合物在MSN表面逐渐沉积。最外层要么 是带负电荷的P(DMA-co-TPAMA)，要么是FA功能化的P(DMA-co-APMA)。采用离心法 制备了聚电解质包覆的杂化MSN纳米粒子，分别表示为表面无FA修饰的Gd2O3@MSN 和表面有FA修饰的FA-Gd2O3@MSN。一张典型的Gd2O3@MSN TEM图像显示，在MSN 纳米粒子之外存在聚合物涂层(图6d)。TGA分析表明，在600℃时，Gd2O3@MSN的残余 重量进一步下降到70.2％(图6b)，与表面存在的聚电解质相符合。除无DOX纳米粒子外，还通过在聚电解质沉积前将Gd2O3@MSN-NH2与DOX药物孵育制备了DOX负载杂化纳 米粒子，用荧光光谱法计算了DOX负载量约为4.2wt％。制备的pH响应聚电解质稳定的 杂化MSN纳米粒子分别表示为表面不含FA的Gd2O3@MSN-DOX和表面含有FA基团的 FA-Gd2O3@MSN-DOX。
pH引发的药物释放特性
以Gd2O3@MSN-DOX为研究对象，研究了pH引发的DOX释放。在中性pH(7.4)下， 72h释放出～22.3％的DOX，而在pH6.0和pH5.0条件下，DOX的释放量分别提高到36.8％ 和60.2％(图7)。这一结果清楚地表明DOX的释放具有高度的pH依赖性，这应归因于pH 引发的包覆聚电解质的断裂。
MRI弛豫性能测试
证实了Gd2O3@MSN-DOX在不同pH触发的释放，本发明还进一步证实了Gd2O3@ MSN作为MRI对比剂的潜在用途。以前，顺磁性Gd2O3纳米颗粒已经用作MRI对比剂， 其相对于市售MRI对比剂具有更高的弛豫率。在3.0T MRI中裸Gd2O3@MSN和裸 Gd2O3@MSN-NH2的弛豫率(r1)分别为6.843s-1mm-1和9.135s-1mm-1，远高于临床应用的 MIR对比剂Gd-DTPA(r1＝3.675s- 1mm-1)，这表明Gd2O3@MSN可能用作MRI对比剂(图 8)。而包覆多层聚电解质膜的Gd2O3@MSN弛豫率(r1＝3.43s-1mm-1)略低于Gd-DTPA。 我们初步认为裸Gd2O3@MSN-NH2比Gd2O3@MSN具有更高弛豫率，是因为前者具有更好 的水分散性。值得注意的是，虽然裸露的[email protected]比Gd-DTPA具有更高的弛豫 性，但在用pH响应的聚电解质包覆后，其弛豫率下降到～3.43mm-1s-1，这可能是由于聚 合物涂层后的Gd2O3与水分子的交换率降低所致。有趣的是，我们发现，在pH值为5的 条件下，pH响应的FA-Gd2O3@MSN可以恢复弛豫率(图9a，b)。这一结果表明，pH介导 的MSNs表面电解质的解离不仅可以触发包封的化疗药物的释放，而且还可以激活MRI 信号，这对于通过MRI信号的增强来原位反馈治疗疗效是非常有利的。
细胞毒性实验
分别取对数生长期的HepG2细胞、Hela细胞、A549细胞和3T3细胞，用含10％FBS，1％青霉素-链霉素的DMEM培养液调整细胞浓度为5×104/mL，96孔板中每孔加入100μ L细胞悬液，周围一圈孔中加入100μL PBS缓冲液，每种细胞均分为以下4组： Gd2O3@MSN组、FA-Gd2O3@SMSN组、Gd2O3@MSN-DOX组、FA-Gd2O3@MSN-DOX组， 每组分九个亚组，每个亚组设3个复孔，5％CO2、37℃常规培养12h后进行实验。
上述每组细胞加入相应的含有MSN的浓度分别为500、250、125、62.5、32、16、8、 4、0μg/mL的10％FBS，1％青霉素-链霉素的DMEM培养基溶液100μL，5％CO2、37℃ 孵育24h后换液，5％CO2、37℃继续培养48小时。然后每孔加入10μL Alamar Blue溶液， 5％CO2、37℃继续培养4h。采用酶标仪检测细胞活性，激发波长为550nm，接收波长为 590nm，测量各孔的吸光值A。同时设置空白调零孔(培养基、Alamar Blue)，对照孔(细胞、 培养液、Alamar Blue)。
细胞活力*(％)＝(A加药-A空白)/(A对照-A空白)×100。
Gd2O3@MSN-DOX及FA-Gd2O3@MSN-DOX在细胞内的代谢分布
分别取对数生长期的HepG2细胞、Hela细胞，用10％FBS，1％青霉素-链霉素的DMEM培养基调整细胞浓度为5×104/ml，每种细胞接种于4块聚焦四分隔玻璃培养皿中，每个隔孔加入200uL细胞悬液，37℃，5％CO2培养12h，吸出培养基，每块聚焦四分隔玻璃培养 皿分两组，每组设1个复孔，每组分别加入200μl 125μg/mL Gd2O3@MSN-DOX、FA-Gd2O3@ NSN-DOX的10％FBS，1％青霉素-链霉素的DMEM培养基。分别37℃，5％CO2孵育12、 24、48、72小时，移出培养液，PBS液冲洗细胞3次，每孔加入1％(V/V)Lyso track green 及DAPI的PBS，37℃，5％CO2孵育40分钟，移出染色液，PBS缓冲液冲洗细胞3次， 每孔加入100μl PBS，激光共聚焦显微镜观测。
采用同样的方法观察游离DOX在HepG2细胞、Hela细胞内的代谢过程，DOX的浓 度为5μg/ml，37℃，5％CO2孵育1、2、3、4小时后，激光共聚焦显微镜观察DOX在细 胞内的分布状态。
细胞凋亡率检测
取对数生长期的HepG2细胞和Hela细胞，用含10％FBS，1％青霉素-链霉素的DMEM培养基稀释细胞浓度为1.25×106个/mL，接种于6孔培养板上，每孔加入2mL细胞悬液， 37℃5％CO2培养箱孵育12h；移出6孔板内的培养基，PBS洗涤一次，孔内分别加含有 62.5ug/mL的A(Gd2O3@MSN)，B(FA-Gd2O3@MSN)，C(Gd2O3@MSN-DOX)，D (FA-Gd2O3@MSN-DOX)的2mL10％FBS，1％青霉素-链霉素的DMEM培养基，并设空 白对照组，分别共孵育12，24，48小时；用不含EDTA的胰酶消化收集后，37℃，1000rpm， 5min离心。用4℃预冷的1×PBS悬浮细胞，4℃，1000rpm，5min离心，洗涤细胞一次； 加入300μL的1×Binding Buffer悬浮细胞；加入5μL的Annexin V-FITC混匀后，避光，室 温孵育15分钟；上机前5分钟再加入5μL的PI染色；上机前，补加200μL的1×Binding Buffer。流式细胞仪上机检测细胞凋亡率。
细胞荧光寿命检测
取对数生长期的HepG2细胞，用含10％FBS，1％青霉素-链霉素的DMEM培养基稀释细胞浓度为5×106个/mL，取2mL细胞悬液接种于5cm培养皿，37℃，5％CO2培养箱 孵育12h；移出培养皿内的培养基，PBS洗涤一次，孔内加含有62.5ug/mL的FA-Gd2O3@ MSN的2mL10％FBS，1％青霉素-链霉素的DMEM培养基，分别共孵育12，24，48、72 小时，采用Q2集成激光扫描共焦荧光寿命成像系统进行细胞荧光寿命成像，激发采用光 纤耦合脉冲激光二极管，工作波长为488nm(40MHz)，脉冲宽度小于200ps。发射波长 600nm，时间相关的单光子计数法(time-correlated single-photon counting,TCSPC)，单光子雪 崩二极管接收器(single-photon avalanche diode,TCSPC)(PDM,MicroPhoton Devices)。数据 用SymphoTime软件(Picoquant)进行采集和分析。
Western Blot检测
取对数生长期的HepG2细胞，含10％FBS，1％青霉素-链霉素的DMEM培养基稀释 细胞浓度为1.25×106个/mL，接种于6孔培养板上，每孔加入2mL细胞悬液，37℃，5％CO2培养箱孵育12h；移出6孔板内的培养基，PBS洗涤一次，孔内分别加含有62.5ug/mL的 A(Gd2O3@MSN)，B(FA-Gd2O3@MSN)，C(Gd2O3@MSN-DOX)，D(FA-Gd2O3@MSN-DOX) 的2mL10％FBS，1％青霉素-链霉素的DMEM培养基，并设空白对照组，分别共孵育12、 24、48小时；吸掉培养基，PBS洗2遍，加入蛋白酶抑制剂：1×SDS sample buffer(1:1)， 放置于冰盒内，充分吹打震荡10min，使细胞充分裂解。将其移入EP管内，100℃水煮15min， 冷却后用于聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。
制备凝胶电泳板：两块玻璃板之间的两侧用1mm有机玻璃条相隔，并用石蜡密封。配制SDS-PAGE分离胶和浓缩胶：
表1分离胶和浓缩胶的配制
分离胶混匀后小心注入上述玻璃凝胶膜中(上面预留2cm空隙放浓缩胶)，在上面用 移液枪缓慢加入1mL双蒸水覆盖其界面，使界面平整，防止混入空气，室温放置0.5h，吸掉分离胶上面的水，并用滤纸吸干顶部残留液体。加入浓缩胶，插入竖梳子，室温放置0.5h。
将凝胶电泳板放入电泳槽，加入电泳缓冲液，并使缓冲液没过胶面。移去梳子，每孔 用移液枪加入20μL上述准备好的预染的marker或蛋白样品。打开电源开关，电压50v，约20min后当marker进入分离胶后，120v继续电泳直至marker的前沿接近凝胶的低端 2cm处，断开电源。
弃去电泳液，去除胶板，切除多余的凝胶，取6张与凝胶一样大小的滤纸和一张PVDF 膜，用转移缓冲液浸泡5min后贴于凝胶上，然后在两侧各铺3层滤纸，注意赶走滤纸、PVDF膜和凝胶之间的气泡，然后固定装置。将整个装置浸泡于配备有铂电极并盛放有转 移缓冲液的电泳槽内，凝胶层位于负极，膜层位于正极。接通电源，110v电转移2.5h。
转模结束后，断开电源，取出PVDF膜放入丽春S染液中染色数分钟，膜用自来水重新数遍，直至背景清晰。剪下每份样品色谱带，浸泡在封闭液中(5％脱脂牛奶/PBS)，摇 床上室温轻摇2h。膜用PBST清洗3遍，每次5min。取20μL一抗(兔抗人M1ck抗体)， 加入到10mL5％脱脂牛奶/PBS中，将膜放入，摇床上室温孵育2h。PBST浸洗3次，每次 10min。取20μL二抗(用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体)加入到10mLPBS中， 将膜放入，摇床上室温孵育2h。PBST浸洗3次，每次10min。一定比例的ECL显影剂均 匀涂于PVDF膜上，用凝胶成像系统曝光。
细胞电镜检测
分别取对数生长期的HepG2细胞和Hela细胞，用含10％FBS，1％青霉素-链霉素的DMEM培养基稀释细胞浓度为5×106个/mL，接种于5cm培养皿，每个培养皿里入2mL 细胞悬液，37℃5％CO2培养箱孵育12h；移出培养皿内的培养基，PBS洗涤一次，每个培 养皿分别加含有62.5ug/mL的A(Gd2O3@MSN)，B(FA-Gd2O3@MSN)，C(Gd2O3@MSN- DOX)，D(FA-Gd2O3@MSN-DOX)的2mL10％FBS，1％青霉素-链霉素的DMEM培养基， 并设空白对照组，分别共孵育48小时；吸掉培养基，PBS洗涤，胰酶消化，10％FBS，1％ 青霉素-链霉素DMEM培养基悬浮细胞，1000rpm，5min离心。立刻加入1mL 2.5％戊二醛 固定24h。吸出固定液，加入PBS浸泡6小时。吸出PBS，加入1mL 1％锇酸固定2h。吸 出固定液，30％乙醇浸润10min，50％乙醇浸润10min，70％乙醇醋酸铀(包埋前染色)浸 润3h，80％乙醇浸润10min，95％乙醇浸润15min，100％乙醇浸润50min，并重复一次完 成脱水。环氧丙烷浸润30min，环氧丙烷：环氧树脂(1:1)浸润2h，纯环氧树脂浸润3小 时，然后放入40℃烤箱12h，60℃烤箱48h。取出包埋块修块后超薄切片(片厚70nm)， 铜网捞片，电子染色(铅、铀染色)，透射电镜观察。
细胞核磁共振成像扫描
分别取对数生长期的HepG2细胞和Hela细胞，用10％FBS，1％青霉素-链霉素的DMEM 培养基稀释细胞浓度为2.5×106/mL，每种细胞接种于3块6孔培养板上，每孔加入2mL细胞悬液，37℃，5％CO2培养箱培养12h。3块6孔板分别加A(Gd2O3@MSN)， B(FA-Gd2O3@MSN)，C(Gd-DTPA)3组制剂，每组Gd3+浓度分别为0.1、0.05、0.025、0.01、 0.005、0mM，每组设去离子水作为对照，37℃，5％CO2培养箱孵育48小时。吸掉培养 基，PBS洗涤，胰酶消化，10％FBS，1％青霉素-链霉素DMEM培养基悬浮细胞，1000rpm， 5min离心，0.6mLPBS+0.6mL2.0％多聚甲醛悬浮细胞，4℃孵育30分钟。1000rpm，5min 离心，PBS洗涤，1000rpm，5min离心。0.5mLPBS+0.5mL2.0％琼脂糖溶液分散细胞于2ml 离心管内。MRI扫描条件：使用西门子3.0T磁共振仪，人肩关节线圈，常规横断面、冠 状面扫描。采用SET1WI序列。具体参数：T1WI(TR/TE300ms/14ms)，回波链长度：20-40， 扫描参数：层厚2mm，层间距2mm，矩阵384×256，FOV 14cm×14cm，NEX2～4次
统计学处理方法
ˉ
采用SPSS 19.0统计软件，计量资料用x±s表示，样本采用单因素方差分析。 p<0.05表示差异有统计学意义。
细胞毒性实验结果
不含DOX的Gd2O3@MSN对HepG2细胞、Hela细胞、A549细胞和3T3细胞是无毒 的，而负载DOX的Gd2O3@MSN显示出明显的浓度依赖性细胞毒性。此外， FA-Gd2O3@MSN-DOX具有比Gd2O3@MSN-DOX更高的细胞毒性(图10a、b、c)。 Gd2O3@MSN和FA-Gd2O3@MSN-DOX对HepG2细胞、Hela细胞、A549细胞半抑制浓度 (half maximal inhibitory concentration，IC50)分别约为：52/30μg/mL、11/4μg/mL、119/93 μg/mL。该结果的差异可能是由于不同的肿瘤细胞摄取纳米粒子效率不同， FA-Gd2O3@MSN-DOX由于叶酸受体的介导作用表现出更高的细胞内化性能。此外，本发 明发现负载DOX的Gd2O3@MSN在相同浓度下对成纤维细胞具有低得多的细胞毒性作用 (图10d)，提示该体系具有较小的全身毒性从而有益于其生物医学应用。
共聚焦激光扫描显微镜检测Gd2O3@MSN-DOX及FA-Gd2O3@MSN-DOX在细胞内 的代谢分布结果
共聚焦激光扫描显微镜(confocal laser scanning microscopy，CLSM)图像显示，HepG 2 细胞和Hela细胞均可以摄取Gd2O3@MSN-DOX及FA-Gd2O3@MSN-DOX。摄入细胞内的Gd2O3@MSN-DOX/FA-Gd2O3@MSN-DOX主要位于溶酶体内，表现为绿色通道(即 LysotrackerGreen)和红色通道(即DOX)重叠的黄色荧光，这对pH介导的DOX释放是有利 的(图11a，b，d，e)。随着时间的延长，摄入细胞内的FA-Gd2O3@MSN-DOX或Gd2O3@ MSN-DOX在溶酶体内的聚集呈现差异，FA-Gd2O3@MSN-DOX呈持续性增高， Gd2O3@MSN-DOX在前24小时内呈上升趋势，其后呈下降趋势(图11c)，这归因于前者 是叶酸介导的主动靶向进入细胞，后者依靠被动靶向进入细胞，进入细胞内的纳米粒子量 取决于细胞内外纳米粒子的浓度梯度。进一步观测游离的DOX在细胞内分布可见游离 DOX进入细胞后呈弥散分布，可见细胞核内有大量DOX，表现为蓝色通道(即DAPI)和红 色通道(即DOX)重叠的紫色荧光，而不是仅局限于溶酶体内(图11f，g)，表现为绿色通 道(即Lysotracker Green)和红色通道(即DOX)重叠的黄色荧光，这归因于小分子的游离DOX 主要以扩散的方式跨膜进入细胞。
细胞凋亡率检测结果
AnnexinⅤ-FITC/PI双染法流式细胞仪定量分析表明：合成的纳米材料与HepG2细胞 共孵育后，在对照组和不载DOX的Gd2O3@MSN和FA-Gd2O3@MSN组细胞凋亡率在各 个时间点无显著差异(P＜0.05)。然而，载DOX的治疗组随时间的延长细胞凋亡率逐渐增 加，在48小时后Gd2O3@MSN-DOX组平均凋亡率为(29.3133±0.67026)％，FA-Gd2O3@ MSN-DOX组平均凋亡率为(42.9100±6.22820)％，凋亡率明显高于对照组及不载DOX 的Gd2O3@MSN和FA-Gd2O3@MSN组(P＜0.01)(表2，3，4，5，图12a，b)。这个结 果很好的佐证了前文用AlmarBlue测定的细胞毒性结果，即Gd2O3@MSN-DOX和 FA-Gd2O3@MSN-DOX较不载DOX的Gd2O3@MSN和FA-Gd2O3@MSN组具有较高的肿 瘤细胞毒性。
表2 HepG2细胞与不同的纳米粒子孵育不同时间后凋亡率统计表n＝3
表3孵育12h后HepG2细胞凋亡率方差分析结果(F值)
表4孵育24h后HepG2细胞凋亡率方差分析结果(F值)
表5孵育48h后HepG2细胞凋亡率方差分析结果(F值)
细胞荧光寿命检测结果
激光扫描共聚焦荧光寿命成像结果显示HepG2细胞内吞的FA-Gd2O3@MSN-DOX在 细胞内可释放DOX，随着孵育时间的延长，荧光寿命较长的细胞数量逐渐减少，荧光寿命 较短的细胞数量逐渐增加(图13)。这一结果与文献报道一致，即游离的DOX的寿命较短， 但封装的DOX的寿命更长。
Western Blot检测结果
HepG2细胞与125μg/mL不同类型的纳米粒子孵育不同的时间Western Blot检测结果 显示在孵育24小时后LC3Ⅰ/Ⅱ在control、Gd2O3@MSN、FA-Gd2O3@MSN三组无明显差 异，而在Gd2O3@MSN-DOX组和FA-Gd2O3@MSN-DOX组则明显增加，P62在五个组间 无明显差异，提示在孵育24小时后载药组自噬增加，但自噬流是通畅的，而不载药组自 噬和自噬流都是正常的。在孵育24小时后caspase3及Cleaved caspase3在control、 Gd2O3@MSN、FA-Gd2O3@MSN三组无明显变化，而在Gd2O3@MSN-DOX组和FA-Gd2O3@ MSN-DOX组则显示增加，提示在孵育24小时后载药组开始启动凋亡(图14a，d-f)。在 孵育36小时后LC3Ⅰ/Ⅱ在control、Gd2O3@MSN、FA-Gd2O3@MSN三组无明显差异，而 在Gd2O3@MSN-DOX组和FA-Gd2O3@MSN-DOX组则较contol组明显增加，P62在control、 Gd2O3@MSN、FA-Gd2O3@MSN、Gd2O3@MSN-DOX四组无明显差异，而在FA-Gd2O3@ MSN-DOX组则较contol组明显增加，提示在孵育36小时后载药组自噬增加，Gd2O3@MSN -DOX组自噬流是通畅的，而FA-Gd2O3@MSN-DOX组自噬流受到抑制。在孵育36小时后caspase3及Cleaved caspase3在control、Gd2O3@MSN、FA-Gd2O3@MSN三组无明显变 化，而Gd2O3@MSN-DOX组和FA-Gd2O3@MSN-DOX组与control组比较显示有所降低， 提示在孵育36小时后载药组开始凋亡，凋亡蛋白被消耗，细胞合成蛋白功能降低，凋亡 蛋白合成受限(图14b，d-f)。在孵育48小时后LC3Ⅰ/Ⅱ在control、Gd2O3@MSN、 FA-Gd2O3@MSN三组无明显差异，而在Gd2O3@MSN-DOX组和FA-Gd2O3@MSN-DOX组 则较contol组明显增加，P62在control、Gd2O3@MSN、FA-Gd2O3@MSN三组无明显差异， 而Gd2O3@MSN-DOX组和FA-Gd2O3@MSN-DOX组与contol组比较明显增加，提示在孵 育48小时后载药组自噬增加，继FA-Gd2O3@MSN-DOX组之后，Gd2O3@MSN-DOX自噬 流也受到抑制。在孵育48小时后caspase3及Cleaved caspase3在Gd2O3@MSN、 FA-Gd2O3@MSN两组与control组比较无明显变化，而Gd2O3@MSN-DOX组和FA-Gd2O3@ MSN-DOX组与control组比较显示明显降低，提示在孵育48小时后载药组凋亡蛋白进一 步被消耗，细胞合成蛋白功能降低，凋亡蛋白合成进一步受限。(图14c，d-f)。
细胞透射电镜检测结果
HepG2细胞与125μg/mL不同类型的纳米粒子孵育48小时后透射电镜检测结果显示Gd2O3@MSN组、FA-Gd2O3@MSN组与control相比可见自噬溶酶体，但数量较少，细胞 核的形态较正常；而在Gd2O3@MSN-DOX组和FA-Gd2O3@MSN-DOX组细胞质内见大量 的自噬溶酶体，自噬溶酶体体积巨大，细胞核膜变形、部分断裂(图15a)。这与Western Blot结果相呼应，从细胞形态学方面印证了载药组细胞自噬增加，自噬流受到明显抑制。 采用相同的条件，在Hela细胞上同样可以观察到类似的现象(图15b)。
细胞核磁共振成像扫描结果
HepG2细胞分别与不同浓度的FA-Gd2O3@MSN、Gd2O3@MSN和Gd-DTPA孵育48 小时后，MRI扫描显示[email protected]组具有最高信噪比(SNR)，其次是Gd2O3@MSN 组，Gd-DTPA组的信噪比最低(图16a，b)。采用相同的条件，Hela细胞分别与不同浓度 的FA-Gd2O3@MSN、Gd2O3@MSN和Gd-DTPA孵育48小时后，MRI扫描显示类似的趋 势(图16c，d)。这与前面没有细胞的水溶液中所测的弛豫率相一致。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员 应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明 的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化 和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等 效物界定。
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