一种用于多病毒核酸检测的纸基装置及其制作方法和应用
阅读说明：本技术 一种用于多病毒核酸检测的纸基装置及其制作方法和应用 (Paper-based device for multi-virus nucleic acid detection and manufacturing method and application thereof ) 是由 李嘉露 丁显廷 张晓� 李思杰 杨逸雯 于 2021-10-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于多病毒核酸检测的纸基装置及其制作方法和应用,涉及病毒型传染病检测领域,该纸基装置包括电池、导电胶带、加热片、纸基腔室和密封薄膜；该装置的制作方法包括制作rGO/MWCNTs加热片、制作纸基腔室以及组装各部件制成纸基装置；该装置在病毒核酸检测中的应用。本发明能够实现更快、特异性更强、更加灵敏的多种病毒的同时检测,其基于LAMP反应并采用染料作为颜色指示剂,可在M-HiPad中45分钟内实现完成多种病毒的可视化核酸检测。(The invention discloses a paper-based device for detecting multi-virus nucleic acid and a manufacturing method and application thereof, relating to the field of virus type infectious disease detection, wherein the paper-based device comprises a battery, a conductive adhesive tape, a heating sheet, a paper-based cavity and a sealing film; the manufacturing method of the device comprises the steps of manufacturing an rGO/MWCNTs heating sheet, manufacturing a paper-based chamber and assembling all parts to manufacture a paper-based device; the application of the device in virus nucleic acid detection. The kit can realize the simultaneous detection of various viruses with higher speed, stronger specificity and higher sensitivity, is based on LAMP reaction and adopts dye as a color indicator, and can realize the visual nucleic acid detection of various viruses within 45 minutes in M-HiPad.)
技术领域
本发明涉及病毒型传染病检测领域，尤其涉及一种用于多病毒核酸检测的纸基装置及其应用。
背景技术
核酸检测(NAT)是一种广泛使用的分子诊断技术，能够实现更好的特异性和灵敏度的靶标检测。通常NAT都需要递的专业仪器来执行样品制备，核酸扩增和信号检测的不同步骤。最近这些步骤已完全或部分集成到单个NAT设备中，可以帮助减少由于步骤繁多造成过的错误几率同时提高检测效率。但是，目前的大多这样集成的即时检测装置都是由石化塑料制成，耗费成本较高，操作难度较大，为了实现便携化以及降低检测成本，开发成本较低的纸基装置是潜在的研究方向。
目前对于纸基即时检测(POCT)的研究并不常见，大多都是在已有的POCT技术如：微流控技术或侧向流技术的基础上进行稍微的改动，加入纸基材料的元素。比如有研究在NAT的所有三个步骤中都采用纸基材料，它将过滤纸或快速技术分析卡(FTA)用于提取核酸，通过塑料和胶带覆盖的玻璃纤维进行核酸扩增，以及通过最常用的侧向流动分析(LFA)和纸基微流体装置进行核酸检测。也有课题组是通过含链霉亲和素偶联磁珠的阳性DNA扩增液在Fusion 5试纸上扩散时会有特殊的显色反应，进行核酸的诊断。关于设计和制造基于纸张的微流体的基底和方法，基于纸张诊断的工作原理和反应机制的介绍也有相关的研究,但这一系列的研究都仍需要较为严格的实验环境和设备，并未对加热装置进行性能改进，而且操作复杂，难以生成集成化、方便使用的产品，因此仍有一定的局限性。
最常见的温度模块是电热管和帕尔贴半导体加热块，而铝块与铜块制作温度模块的小型化尝试由于工艺复杂，成本昂贵而不尽人意。因此，此装置利用了非金属电热材料，还原氧化石墨烯(rGO)与多碳纳米管(MWCNTs)。最近的研究表明，碳纳米管和GO或rGO的混合物会重新堆积并增强其电导率和导热率，因为rGO与碳纳米管混合可以成为增强的导电分散剂。然而，尚未有将混合的rGO/MWCNT开发成用于即时核酸检测装置中电热模块的研究。
对于多病毒同时检测，最近的研究显示，通过设计可同时扩增和检测多个病毒靶标的PCR反应可以解决这一问题，但随着多重反应中反应物(引物，探针，靶标和内部对照)的数量增加，优化测定并保持灵敏度和特异性变得更加困难，也存在技术界限。
现有的大部分核酸检测装置均采用PCR技术，以新冠肺炎为例，以ORF1ab基因和N基因中的序列为靶位点设计特异性引物，以寡核苷酸作为荧光探针进行检测。而部分新型的微流控芯片检测技术，操作难度较大，且装置都是由硅、玻璃、塑料等石化塑料制成，成本较高。而且目前大多核酸检测装置只针对一种病毒。因此相比于目前的核酸检测装置，现有技术的缺点如下：
1.PCR技术受到传热速度及装置热容的限制，整个扩增过程耗时较长，对设备及操作人员要求较高；
2.装置所用材料多为硅、玻璃塑料等，耗费成本较高；
3.仅针对一种病毒，核酸检测效率不高。
目前的设备大多是由石化塑料制成的，耗费成本较高，需要进行繁琐的步骤，也需要有大量的知识储备方可进行。即时检测与其他常规的检测方法相比，能够实现更快、特异性更强、更加灵敏的检测。开发一种基于纸基材料能够同时进行多种病毒核酸检测的装置，即快速，耐用且经济高效的设备并且不一定需要经过培训的技术人员就可操作，是有潜在意义的。
因此，本领域的技术人员致力于开发一种无需过多特殊仪器，也拥有更高的特异性扩增效率的多种病毒进行核酸检测的纸基装置及制作方法和应用。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种无需过多特殊仪器，也拥有更高的特异性扩增效率的多种病毒进行核酸检测的纸基装置及应用。
为实现上述目的，本发明提供了一种用于多病毒核酸检测的纸基装置及其制作方法和应用，其满足以下要求：
1.采用LAMP技术，降低操作难度和成本，能够通过可视化快速进行核酸检测。
2.采用纸基材料制作装置，大大降低成本消耗。
3.多个腔室可以同时对多种病毒进行核酸检测。
本申请设计并制作的可用于多种病毒核酸检测的纸基装置(M-HiPad)，基于LAMP反应并采用染料作为颜色指示剂，可在M-HiPad中45分钟内实现完成多种病毒的可视化核酸检测。
本发明提供一种用于多病毒核酸检测的纸基装置，该纸基装置的部件包括电池、导电胶带、加热片、纸基腔室和密封薄膜。
进一步地，该纸基装置中各部件的组装顺序由上而下为：电池、导电胶带、加热片、纸基腔室和密封薄膜；所有部件按照组装顺序分别使用粘合剂粘附。
进一步地，粘合剂包括固体胶或光学粘合剂。
进一步地，电池包括柔性电池或者锂电池；柔性电池包括极耳材料，极耳材料为导电碳胶；导电碳胶由新型纳米材料制成，新型纳米材料的厚度为1mm-2mm；柔性电池的电压保持在1.5V～10V。
进一步地，导电胶带作为线路板为加热片与电池提供连接，导电胶带厚度为0.05mm。
进一步地，加热片包括由还原氧化石墨烯(rGO)与多碳纳米管(MWCNTs)集成制成的rGO/MWCNTs加热片或者仅用MWCNTs制成的MWCNTs加热片；密封薄膜包括一次性可燃烧的光学密封膜或者密封玻璃。
进一步地，密封薄膜用于防止液体挥发和污染，采用一次性可燃烧的光学密封膜制作。
本发明还提供用于多病毒核酸检测的纸基装置的制作方法，包括以下步骤：
步骤1、制作rGO/MWCNTs加热片或者MWCNTs加热片；
步骤2、制作纸基腔室，纸基腔室包括单孔或者多孔腔室；
步骤3、组装各部件制成纸基装置：将电池、导电胶带、步骤1制作的加热片、步骤2制作的纸基腔室和密封薄膜由上而下用粘合剂粘附。
进一步地，上述步骤1中制作rGO/MWCNTs加热片的步骤还包括：
步骤1.1采用改良的Hummers方法合成氧化石墨烯(GO)，将20mL准备好的含有GO的悬浮液密封在聚四氟乙烯反应器中，在马弗炉中于100℃持续加热24小时；
步骤1.2将含有15mg rGO/MWCNTs和5mg SDBS作为表面活性剂的100mL混合成的rGO/MWCNTs的分散液在37℃下超声处理1h，得到超声后的rGO/MWCNTs分散液，其中rGO重量百分比为5％；
步骤1.3将步骤1.2获得的超声后的rGO/MWCNTs分散液在尼龙滤纸上进行真空过滤，得到尼龙rGO/MWCNTs复合纸；
步骤1.4再将步骤1.3获得的尼龙rGO/MWCNTs复合纸在烘箱中于60℃干燥2小时，得到干燥的尼龙rGO/MWCNTs纸；
步骤1.5将步骤1.4得到的干燥的尼龙rGO/MWCNTs纸切成适当尺寸的正方形纸，为rGO/MWCNTs加热片；
上述步骤2中制作纸基腔室的步骤还包括:
步骤2.1、将Whatman 1级色谱纸快速浸入融化的切片石蜡中，取出并干燥，制成疏水蜡纸；
步骤2.2、腔室主要由两部分组成，包括基础层和中间层；将步骤2.1获得的疏水蜡纸作为基础层，中间层由五层疏水蜡纸堆积而成，中间层包括单个或者多个有一定直径的圆柱状孔；基础层在中间层的下方；密封薄膜覆盖在中间层上方。
进一步地，中间层是六个直径为5mm的孔容纳不同的LAMP反应混合物，顶层是密封膜密封腔室。
进一步地，多孔腔室可改为单孔，仅检测一种病毒。
本发明还提供一种用于多病毒核酸检测的纸基装置在病毒核酸检测中的应用。
应用的方法包括以下步骤：
步骤4、对需要检测的样品进行采样，得到待测样品；
步骤5、将步骤4获得的待测样品利用病毒DNA/RNA试剂盒提取核酸，得到病毒基因DNA模板；
步骤6、在LAMP反应混合物中加入染料，得到加入染料的LAMP反应混合物，LAMP反应混合物包括：5μL甜菜碱(5M)，1μLMgSO4(150mM)，3.5μLdNTPs(10mM)，2.5μL 10×Bsm缓冲液(200mM Tris-HCl，100mM KCl，100mM(NH4)2SO4、20mM MgSO4、1％(v v-1)Tween20，pH＝8.8)，1μLBsm DNA聚合酶大片段，1μL染料，4μLH2O，1μL步骤5获得的病毒基因DNA模板，6μL引物混合物；
步骤7、.将不同病毒分别由步骤6获得的加入染料的LAMP反应混合物加入纸基装置的纸基腔室中的不同孔中，对检测结果进行直接分析。
在本发明的较佳实施方式中，设计并制作了一个可用于多种病毒核酸检测的纸基装置M-HiPad。基于LAMP反应并采用染料作为颜色指示剂，可在M-HiPad中45分钟内实现完成多种病毒的可视化核酸检测。
在本发明的另一较佳实施方式中，使用该核酸检测纸基装置以乙肝病毒(HBV)的检测为例，验证了M-HiPad的可用性。
在本发明的另一较佳实施方式中，使用该核酸检测纸基装置以埃博拉病毒(EBOV)的检测为例，验证了M-HiPad的可用性。
在本发明的另一较佳实施方式中，使用该核酸检测纸基装置以中东呼吸综合征病毒(MERS)的检测为例，验证了M-HiPad的可用性。
在本发明的另一较佳实施方式中，使用该核酸检测纸基装置以艾滋病病毒(HIV)的检测为例，验证了M-HiPad的可用性。
在本发明的另一较佳实施方式中，使用该核酸检测纸基装置以疟疾病毒(Malaria)检测为例，验证了M-HiPad的可用性。
通过本装置所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：
1.本装置提供了一种能够简便、轻松、精准通过可视化对病毒进行核酸检测的方式；
2.本装置能够同时检测多种病毒，对于疾病多发的地区有较有效的检测意义；
3.本装置主要是纸基材料，成本较低。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明的一个较佳实施例1中的一种用于多病毒核酸检测的纸基装置的组成和组装示意图；
图2是本发明的一个较佳实施例1中的一种用于多病毒核酸检测的纸基装置的边长和纸基腔室直径的尺寸示意图；
图3是本发明的一个较佳实施例1中的一种用于多病毒核酸检测的纸基装置的纸基腔室孔深尺寸示意图。
图4是本发明的一个较佳实施例1中的一种用于多病毒核酸检测的纸基装置本装置以病毒乙肝(HBV)为例在M-HiPAD中进行核酸检测的结果图；
图5是本发明的一个较佳实施例1中的一种用于多病毒核酸检测的纸基装置以埃博拉(EBOV)为例在M-HiPAD中进行核酸检测结果图；
图6是本发明的一个较佳实施例1中的一种用于多病毒核酸检测的纸基装置以中东呼吸综合征(MERS)为例在M-HiPAD中进行核酸检测的结果图；
图7是本发明的一个较佳实施例1中的一种用于多病毒核酸检测的纸基装置以艾滋病(HIV)为例在M-HiPAD中进行核酸检测的结果图；
图8是本发明的一个较佳实施例1中的一种用于多病毒核酸检测的纸基装置以疟疾(Malaria)为例在M-HiPAD中进行核酸检测的结果图。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
附图所示的每一组件的尺寸和厚度是任意示出的，本发明并没有限定每个组件的尺寸和厚度。为了使图示更清晰，附图中有些地方适当夸大了部件的厚度。
本申请实施例1设计并制作了一个可用于多种病毒核酸检测的纸基装置M-HiPad。基于LAMP反应并采用染料作为颜色指示剂，可在M-HiPad中45分钟内实现完成多种病毒的可视化核酸检测。实施例2-5分别使用该核酸检测纸基装置以病毒HBV、EBOV、MERS、HIV和Malaria的检测为例，验证了M-HiPad的可用性。
实施例1：制作和组装核酸检测纸基装置(M-HiPad)
如图1所示，用于多病毒核酸检测的纸基装置(M-HiPAD)，主要包括五个部件，即柔性电池、导电胶带、还原氧化石墨烯与多碳纳米管集成制成的rGO/MWCNTs加热片、纸基腔室和密封薄膜；五个部件分别使用粘合剂由上而下粘附组装成用于多病毒核酸检测的纸基装置(M-HiPAD)。
装置中的柔性电池，极耳材料为导电碳胶，由新型纳米材料制成，安全环保。厚度在1mm-2mm,保证了装置的小型化，电压保持在1.5V～10V，为rGO/MWCNTs加热片供电。如图1所示位于装置最底部。
装置中的导电胶带，作为柔性线路板为rGO/MWCNTs加热片提供电极，厚度仅在0.05mm。如图1所示位于柔性电池与加热片之间。
装置中的rGO/MWCNTs加热片，用于为纸基腔室的LAMP反应加热。制作流程如下：首先，采用改良的Hummers方法合成了横向尺寸为10～10μm的GO，为了获得rGO，将20mL准备好的GO悬浮液(2mg/mL)密封在聚四氟乙烯反应器中，然后在马弗炉中于100℃持续加热24小时。然后，将含有15mg rGO/MWCNTs和5mg SDBS作为表面活性剂的100mL混合rGO/MWCNTs分散液在37℃下超声处理1h，其中rGO重量百分比为5％。超声处理后，将制备的rGO/MWCNTs分散液在尼龙滤纸上进行真空过滤，再将尼龙rGO/MWCNTs复合纸在烘箱中于60℃干燥2小时。最后将干燥的尼龙rGO/MWCNTs纸切成适当尺寸的正方形纸，作为rGO/MWCNTs加热片。如图1所示位于纸基腔室的下层。
装置中的纸基腔室，是进行病毒核酸检测的LAMP反应区。制作纸基腔室流程如下：将Whatman 1级色谱纸快速浸入融化的切片石蜡中，取出并干燥，制成疏水蜡纸。该腔室主要由三部分组成，从下到上分别是蜡纸作为基础层，五层堆积的蜡纸，中间层是六个直径为5mm的孔容纳不同的LAMP反应混合物，顶层是密封膜密封腔室。如图2所示，纸基腔室的孔直径为5mm,用于多病毒核酸检测的纸基装置(M-HiPAD)的边长为24mm。如图3所示，纸基腔室的孔深为3mm。
将以上四个部件与密封膜组合起来，则制成多病毒核酸检测的纸基装置M-HiPad。
实施例2：以乙肝病毒(HBV)为例，验证M-HiPAD检测灵敏度。
根据试剂配方，并且设计以下LAMP引物，配置LAMP反应混合物。
B3:5'-CGGGGTTTTTCTTGTTGAC-3',
F3:5'-TGAGGCATAGCAGCAGGAT-3',
BIP:5'-TCCCCCTAGAAAATTGAGAGAAGTAATCCTCACAATACCACAGAG-3',
FIP:5'-TGGCCAAAATTCGCAGTCCCAAAACGCCGCAGACACATC-3'。
为了验证本发明M-HiPad检测的实际应用性，加入染料作为颜色指示剂，在5V电压下加热加热片。反应45分钟后，检测结果如图4所示，我们可肉眼观察到1号孔中含有HBVDNA实验组的LAMP反应为蓝色(阳性)，而未与HBV DNA混合对照组n的LAMP反应为紫色(阴性)。
实施例3：以病毒EBOV为例，验证M-HiPad检测特异性。
根据试剂配方，并且设计以下LAMP引物，如表1所示，配置LAMP反应混合物。
表1检测病毒EBOV用LAMP引物
为了验证本发明M-HiPad检测的实际应用性，加入染料作为颜色指示剂，在5V电压下加热加热片。反应45分钟后，结果如图5所示，我们可肉眼观察到2号孔含有EBOV DNA实验组的LAMP反应与未与HBV DNA混合对照组n的LAMP反应颜色不同。
实施例4：以病毒MERS为例，验证M-HiPad检测特异性。
根据试剂配方，并且设计以下LAMP引物，如表2所示，配置LAMP反应混合物。
表2检测病毒MERS用LAMP引物
为了验证本发明MiPad检测的实际应用性，加入染料作为颜色指示剂，在5V电压下加热加热片。反应45分钟后，结果如图6所示，我们可肉眼观察到3号孔含有MERS DNA实验组的LAMP反应与未与HBV DNA混合对照组n的LAMP反应颜色不同。
实施例5：以病毒HIV为例，验证M-HiPad检测特异性。
根据试剂配方，并且设计以下LAMP引物，如表3所示，配置LAMP反应混合物。
表3检测病毒HIV用LAMP引物
为了验证本发明MiPad检测的实际应用性，加入染料作为颜色指示剂，在5V电压下加热加热片。反应45分钟后，结果如图7所示，我们可肉眼观察到4号孔含有MERS DNA实验组的LAMP反应与未与HBV DNA混合对照组n的LAMP反应颜色不同。
实施例6：以病毒Malaria为例，验证M-HiPad检测特异性。
根据试剂配方，并且设计以下LAMP引物，如表4所示，配置LAMP反应混合物。
表4检测病毒Malaria用LAMP引物
为了验证本发明MiPad检测的实际应用性，加入染料作为颜色指示剂，在5V电压下加热加热片。反应45分钟后，结果如图8所示，我们可肉眼观察到5号孔含有MERS DNA实验组的LAMP反应与未与HBV DNA混合对照组n的LAMP反应颜色不同。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
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