阅读说明：本技术 一种长柄类大型真菌的超大原生质体及其制备方法 (Oversized protoplast of macrofungi with long petioles and preparation method thereof ) 是由 严俊杰 韩星 甘炳成 苗人云 冯仁才 赵金 林俊彬 甘颖 于 2021-09-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种长柄类大型真菌的超大原生质体及其制备方法,属于原生质体制备技术领域,该制备方法主要包括以下步骤：首先将长柄类大型真菌子实体样品横切取下菌柄区段,然后将菌柄区段纵切得到若干细条型的样品组织块；再将所得的样品组织块置于装有酶解液的装置中涡旋振荡1～3分钟后,然后将装置置于恒温摇床中,于25～30℃温度下酶解2～4小时；最后将样品进行过滤得到滤液,并将所得的滤液进行离心去除酶解液,得到长柄类大型真菌的超大原生质体。与现有常规方法相比,本发明获得的原生质体直径可达20～50μm,是常规方法制备的原生质体的4～10倍,有效解决了现有技术中存在原生质体直径小和显微操作困难的问题。(The invention discloses a super large protoplast of a macrofungi with long handle and a preparation method thereof, belonging to the technical field of protoplast preparation, wherein the preparation method mainly comprises the following steps: firstly, transversely cutting a stipe section of a fruiting body sample of a long-stalked large fungus, and then longitudinally cutting the stipe section to obtain a plurality of strip-shaped sample tissue blocks; placing the obtained sample tissue block in a device filled with enzymolysis liquid, performing vortex oscillation for 1-3 minutes, then placing the device in a constant-temperature shaking table, and performing enzymolysis for 2-4 hours at the temperature of 25-30 ℃; and finally, filtering the sample to obtain filtrate, and centrifuging the obtained filtrate to remove enzymolysis liquid to obtain the oversized protoplast of the macrofungi belonging to the long stalk class. Compared with the conventional method, the diameter of the obtained protoplast can reach 20-50 μm, which is 4-10 times of the diameter of the protoplast prepared by the conventional method, and the problems of small diameter of the protoplast and difficult micromanipulation in the prior art are effectively solved.)

一种长柄类大型真菌的超大原生质体及其制备方法

技术领域

本发明涉及原生质体制备技术领域，具体涉及到一种长柄类大型真菌的超大原生质体及其制备方法。

背景技术

大型真菌原生质体在杂交育种、基因编辑育种、遗传转化等方面广泛应用，是细胞生物学、分子生物学、遗传学研究过程的重要材料。比如在CRISPR-Cas9 RNP(核糖核蛋白复合物)基因编辑技术、细胞核移植技术等显微操作过程中，原生质体的大小直接关系到实验开展的可行性和难易程度。常规方法制备的真菌原生质体通常很小(以金针菇为例，其原生质体直径只有5μm左右)，远小于动物细胞(直径30μm左右)和大部分植物的原生质体(直径50μm左右)，这导致金针菇等大型真菌的显微操作技术难以突破。

发明内容

针对上述不足，本发明的目的是提供一种长柄类大型真菌的超大原生质体及其制备方法，可有效解决现有技术中存在原生质体直径小和显微操作困难的问题。

为达上述目的，本发明采取如下的技术方案：

本发明提供一种长柄类大型真菌的超大原生质体的制备方法，具体包括以下步骤：

步骤1-样品的预处理：

将长柄类大型真菌子实体样品横切取下菌柄区段，然后将菌柄区段纵切得到若干细条型的样品组织块；

步骤2-样品的酶解：

将步骤1所得的样品组织块置于装有酶解液的装置中涡旋振荡1～3分钟后，然后将装置置于恒温摇床中，于25～30℃温度下酶解2～4小时；

步骤3-样品的过滤与离心：

将步骤2酶解后所得的样品进行过滤得到滤液，并将所得的滤液进行离心去除酶解液，得到长柄类大型真菌的超大原生质体。

进一步地，本发明中长柄类大型真菌为具备长柄结构的大型真菌，长柄结构是指大型真菌的成熟子实体菌柄的长度于6cm以上，长柄类大型真菌具体包括但不限于金针菇、杏鲍菇、长根菇、鸡枞菌、灰盖鬼伞、真姬菇、滑菇、大球盖菇、茶树菇、草菇等等。

进一步地，本发明中制得的超大原生质体的直径为20～50μm。

进一步地，步骤1中长柄类大型真菌子实体样品为处于伸长期的新鲜健壮长柄类大型真菌子实体，全长为6～10cm，优选为8cm。

进一步地，步骤1中横切的位置为距离长柄类大型真菌子实体的菌盖2～4cm处，优选为3cm。

进一步地，步骤1中菌柄区段的长度为0.15～0.35cm，优选为0.20cm。

进一步地，步骤1中样品组织块的宽度为1～2mm，优选为1mm。

进一步地，本发明中酶解液的配制过程如下：将溶壁酶加入0.6mol/L的甘露醇充分溶解，制备成质量体积比为1～3％的酶解液，并将其过滤除菌，即可；其中，酶解液的质量体积比优选为2％。

本发明中上述的溶壁酶为本领域常用试剂，可直接购买，并无特殊限定。

进一步地，步骤2中样品的酶解时，每1mL的质量体积比为2％酶解液中加入样品组织块的数量为4～7块，优选为5块。

进一步地，步骤2中样品的酶解时，恒温摇床的转速为140～170rpm，优选为150rpm。

进一步地，步骤3中过滤的具体操作过程为：将步骤2酶解后所得的样品通过带有无菌擦镜纸的漏斗进行过滤，并用1～2mL无菌的0.6mol/L的甘露醇冲洗擦镜纸2～3次，得到滤液。

进一步地，步骤3中离心去除酶解液的具体操作过程为：将得到的滤液转移至离心管中，然后将离心管置于10℃预冷后的离心机中，设置离心力为3000g，离心10～20分钟，然后用移液枪缓慢移除上清液，即可。

进一步地，本发明中适用于长柄类大型真菌的超大原生质体的制备方法还包括重悬与镜检，具体过程为：将步骤3所得的长柄类大型真菌的超大原生质体加入200μL的0.6mol/L的甘露醇进行重悬，并吸取10～15μL悬液在光学显微镜下观察原生质体大小。

本发明还提供上述长柄类大型真菌的超大原生质体的制备方法制得的原生质体。

综上所述，本发明具有以下优点：

1、现有常规方法制备的长柄类大型真菌的原生质体直径小，如金针菇原生质体的直径在5μm左右，难以实现显微操作等技术的应用，本发明获得的原生质体直径可达20～50μm，是常规方法制备的原生质体的4～10倍，可以充分保障显微操作技术的顺利开展，实现现代细胞生物学技术在金针菇等长柄类食用菌上的应用，拓展食用菌的基础生物学研究领域；

2、现有常规方法中原生质体制备需要提前培养菌丝，耗时长(通常菌丝的培养需要经过2-3次的扩繁，每次扩繁的培养时间为5-10天)；对于无法进行人工培养的野生食用菌更是束手无策；本发明直接采用子实体的菌柄部位进行原生质体制备，省去了菌丝培养的时间，可以直接对市场采购或者野生采集的食用菌开展原生质体制备并用于后续的细胞学等研究。

附图说明

图1为本发明制备的金针菇超大原生质体显微观察结果图，其中放大倍数为400x，箭头所示的圆球状物体为原生质体；

图2为本发明制备的杏鲍菇超大原生质体显微观察结果图，其中放大倍数为400x，箭头所示的圆球状物体为原生质体；

图3为现有常规方法制备的金针菇原生质体显微观察结果图，其中放大倍数为400x，箭头所示的圆球状物体为原生质体；

图4为现有常规方法制备的杏鲍菇原生质体显微观察结果图，其中放大倍数为400x，箭头所示的圆球状物体为原生质体。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

因此，以下对提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本例提供一种长柄类大型真菌的超大原生质体的制备方法，以金针菇为例，具体包括以下步骤：

1、酶解液的配置：将0.02g溶壁酶(广东微生物研究所生产)用1mL无菌的0.6mol/L的甘露醇充分溶解，制备成质量体积比为2％酶解液；

2、酶解液过滤除菌：用无菌注射器吸取步骤1中配好的酶解液，先用0.45nm孔径的一次性无菌针式滤头过滤，再用0.22nm孔径的一次性无菌针式滤头过滤，备用；

3、样品的选择与预处理：取处于伸长期的新鲜健壮金针菇子实体(全长8cm)，用无菌解剖刀在离菌盖3cm位置横切取下0.2cm长的菌柄区段，将取下的区段纵切成多份细条型的样品组织块；

4、样品的酶解：将步骤3中取下的样品组织块置于无菌的5mL离心管中(每个离心管装5个区段的组织块)，加入1mL步骤2所得的质量体积比为2％酶解液；涡旋振荡1分钟，使样品组织块充分悬浮于2％酶解液中；将离心管固定于浮板上，置于恒温摇床中，于28℃，150rpm酶解3小时；

5、过滤：将步骤4中酶解后的样品用带有无菌擦镜纸的漏斗过滤到新的5mL无菌离心管中，用1mL无菌的0.6mol/L的甘露醇冲洗擦镜纸2次，使擦镜纸上残留的原生质体充分流入新的离心管中；

6、离心去除酶解液：将装有滤液的新离心管置于10℃预冷后的离心机中，设置离心力为3000g，离心10分钟；用移液枪缓慢移除上清液，得到原生质体沉淀；

7、重悬与镜检：向步骤6所得的原生质体沉淀加入200μL的0.6mol/L的甘露醇进行重悬，并吸取10μL悬液在光学显微镜下(10x目镜和40x物镜)观察原生质体大小，所得的原生质体的镜检结果见附图1。

本例制得的原生质体的直径为42μm。

实施例2

本例提供一种长柄类大型真菌的超大原生质体的制备方法，与实施例1的区别在于：以杏鲍菇为例，其余步骤及参数均相同。

本例制得的原生质体的直径为24μm，镜检结果见附图2。

对比例1

本例提供一种食用菌原生质体的制备方法(即现有常规中通过菌丝的制备原生质体的方法)，具体按照专利号CN107083337A的实施例2所述方法进行制备，并将所得的金针菇原生质体于显微镜下观察，所得原生质体的直径为5μm左右(与实施例1相同放大倍数，400x)见附图3。

对比例2

本例提供一种食用菌原生质体的制备方法(即现有常规中通过菌丝的制备原生质体的方法)，具体按照专利号CN107083337A的实施例2所述方法进行制备，并将所得的杏鲍菇原生质体于显微镜下观察，所得原生质体的直径为5μm左右(与实施例2相同放大倍数，400x)见附图4。

综上所述，本发明提供了一种长柄类大型真菌的超大原生质体及其制备方法，本发明制得的原生质体直径可达20-50μm，是常规方法制备的原生质体的4～10倍，有效解决了现有技术中存在原生质体直径小和显微操作困难的问题，可以充分保障显微操作技术的顺利开展，实现现代细胞生物学技术在金针菇、杏鲍菇等长柄类食用菌上的应用，拓展食用菌的基础生物学研究领域。

以上内容仅仅是对本发明结构所作的举例和说明，所属本领域的技术人员不经创造性劳动即对所描述的具体实施例做的修改或补充或采用类似的方式替代仍属本专利的保护范围。