一种敲除p300基因的BCBL1细胞系及其构建方法与应用
阅读说明：本技术 一种敲除p300基因的BCBL1细胞系及其构建方法与应用 (BCBL1 cell line with p300 gene knockout function as well as construction method and application thereof ) 是由 卢杰 孙传凯 郭祎珍 于 2020-05-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种敲除p300基因的BCBL1细胞系及其构建方法与应用,属于生物技术领域。本发明提供的特异性靶向p300基因的sgRNA,可通过CRISPR/Cas9技术构建p300基因敲除的细胞系。通过本发明方法可以得到稳定敲除p300的BCBL1细胞系。本发明所提供的p300基因敲除细胞系能够为卡波西肉瘤相关疱疹病毒在宿主细胞中复制的研究提供细胞模型,也能够为p300基因与肿瘤的发生机制和药物治疗研究提供细胞模型。本发明构建方法还可以为其他悬浮细胞系得到稳定敲除的细胞株提供经验。(The invention discloses a BCBL1 cell line with a p300 gene knocked out and a construction method and application thereof, belonging to the technical field of biology. The sgRNA specifically targeting the p300 gene can construct a p300 gene knockout cell line by using a CRISPR/Cas9 technology. The method can obtain the BCBL1 cell line with stably knocked-out p 300. The p300 gene knockout cell line provided by the invention can provide a cell model for research of replication of Kaposi sarcoma-associated herpesvirus in host cells, and can also provide a cell model for research of a generation mechanism and drug therapy of p300 gene and tumor. The construction method can also provide experience for obtaining stably knocked-out cell strains of other suspension cell lines.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种敲除p300基因的BCBL1细胞系及其构建方法与应用。
背景技术
转录共激活因子p300是腺病毒癌蛋白质E1A的核结合靶点，分子量大小为300kDa，所以被命名为p300。p300功能结构域依次包括：N端核受体相互作用域(NRID)、转录适配器锌指1(TAZ1)和激酶诱导的CREB相互作用区(KIX)一起；其次是溴结构域(BD)，该结构域是行使转录辅助功能的关键，以及RING和植物同源结构域(PHD)的组合；紧接着HAT结构域，其对于转录复合物的形成很重要；最后是ZZ型锌指结构域，TAZ2结构域和IBiD结构域。
p300的作用机制主要有3种。第一种是p300可以连接基因特异性的转录因子与转录复合物等，充当桥梁作用；第二种是p300由于包含多个结构域可以与不同的蛋白质结合形成复合物，从而有利于蛋白质之间以及蛋白质和DNA之间的相互作用；最后一种是p300作为组蛋白乙酰转移酶(HAT)家族的成员之一，具有组蛋白乙酰转移酶活性，可以乙酰化组蛋白或非组蛋白(主要是一些转录因子)从而增强基因的活性，起到辅助转录的作用。
鉴于p300的作用机制，p300是具有多种功能的转录适配器。它不仅参与染色体易位、基因突变，还可以作为参与致瘤途径中蛋白质的转录辅助因子；DNA的复制和修复、细胞周期阻滞和细胞凋亡也都需要p300的参与；p300也可以被一些不具有乙酰化作用的蛋白质和转录因子招募发挥促进或者抑制作用。此外，p300在调节细胞生长和分裂以及抑制肿瘤增生方面具有重要作用。通常p300的异常表达会引起一系列现象，例如肿瘤细胞增殖和病毒基因表达的变化，并且还影响其上游或下游基因的活性。
原发性渗出性淋巴瘤(PEL)是一种罕见的人类免疫缺陷病毒HIV相关的非霍奇金淋巴瘤，是发生在液体腔性的克隆性的B细胞起源的肿瘤，多见于HIV感染者，主要的临床表现是恶性的渗出所出现的胸腔积液、腹腔积液。PEL发病与卡波氏肉瘤(KS)相关的疱疹病毒(KSHV)感染有关，具体分子机制尚未确定。治疗上采取CHOP方案化疗和抗逆转录病毒治疗联用，预后差，有待进一步发现更特异的治疗靶点。
CRISPR/Cas9作为一项新兴技术，能够实现对基因组的特异性和精确敲除，与传统的ZFN和TALEN技术相比，具有原理简单、编辑效率高、设计过程简单易操作和可与多种技术结合等优点，已成为医药、农药、环保等领域的热门技术。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种靶向敲除p300基因的sgRNA序列。
本发明的另一目的在于提供一种敲除p300基因的BCBL1细胞系的构建方法。
本发明的再一目的在于提供一种敲除p300基因的BCBL1细胞系。
本发明的目的通过如下方法制备得到：
一种靶向敲除p300基因的sgRNA序列，其核苷酸序列为：5’-GCGGCCTAAACTCTCATCTC-3’。
上述靶向敲除p300基因的sgRNA序列在制备敲除p300基因的细胞系中的应用。
所述的细胞系优选为BCBL1细胞系。
一种敲除p300基因的BCBL1细胞系的构建方法，包括如下步骤：
(1)根据上述靶向敲除p300基因的sgRNA序列，在其5’端加上CACCG得到正向寡核苷酸链，同时根据上述靶向敲除p300基因的sgRNA序列获得其对应的DNA互补链，在其5’端加上AAAC、3’端加上C得到反向寡核苷酸链，将合成的正向寡核苷酸链和反向寡核苷酸链退火形成双链；
(2)将步骤(1)制得的双链与Cas9载体连接，得到重组敲除表达载体；
(3)将步骤(2)制得的重组敲除表达载体与慢病毒包装系统质粒共转染到细胞包装制备慢病毒，然后收获病毒纯化并浓缩，得到病毒颗粒浓缩液；
(4)将步骤(3)制得的病毒颗粒浓缩液感染BCBL1细胞，培养，筛选稳转细胞，得到敲除p300基因的BCBL1细胞系。
步骤(2)中所述的Cas9载体优选为lentiCRISPR v2载体。
步骤(3)中所述的细胞优选为HEK 293T细胞。
步骤(3)中所述的慢病毒包装系统质粒优选为pMD2.G和psPAX2。
步骤(3)中所述的共转染的方法优选为脂质体转染法。
所述的脂质体转染法所用的脂质体优选为Lipofectamin 3000。
步骤(3)中所述的纯化优选为通过聚偏氟乙烯(PVDF)针式滤器实现；更优选为通过孔径为0.45μm的聚偏氟乙烯针式滤器实现。
步骤(3)中所述的浓缩优选为通过超高速冷冻离心机实现。
所述的超高速冷冻离心机优选设置条件为转速15000～25000rpm，时间2～4h；更优选为转速20000rpm，时间3h。
步骤(4)中所述的BCBL1细胞优选为处于对数生长期的BCBL1细胞；最优选为通过如下方法培养得到的BCBL1细胞：取冻存的BCBL1细胞，在含有10％v/vFBS和1％w/v青链双抗的RPMI1640完全培养基中进行培养，待细胞长满后进行传代，得到生长状态良好的BCBL1细胞。
步骤(4)中所述的培养所用的培养基优选为含终浓度为7～9μg/mL的聚凝胺(polybrene)的RPMI1640完全培养基；更优选为含终浓度为8μg/mL的聚凝胺的RPMI1640完全培养基。
步骤(4)中所述的培养的条件优选为37℃、5％CO2培养箱培养。
步骤(4)中所述的筛选优选为嘌呤霉素筛选。
所述的嘌呤霉素的浓度优选为2～4ug/mL。
一种敲除p300基因的BCBL1细胞系，通过上述构建方法构建得到。
上述敲除p300基因的BCBL1细胞系在KSHV复制机制和/或致瘤机制研究中的应用。
上述敲除p300基因的BCBL1细胞系在制备治疗和/或预防原发性渗出性淋巴瘤药物中的应用。
上述敲除p300基因的BCBL1细胞系在调控KSHV裂解复制和/或病毒粒子产生中的应用。
p300基因在调控KSHV裂解复制和/或病毒粒子产生中的应用。
p300基因作为靶分子在制备原发性渗出性淋巴瘤诊断试剂和/或治疗药物中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明提供的特异性靶向p300基因的sgRNA，可通过CRISPR/Cas9技术构建p300基因敲除的细胞系，尤其是p300敲除的BCBL1细胞系。经过抗性筛选得到稳定敲除p300的细胞系，经过western blot实验方法验证敲除p300基因。
(2)本发明所提供的p300基因敲除BCBL1细胞系能够为KSHV在宿主细胞中复制的研究提供细胞模型，也能够为p300基因与肿瘤，尤其是KSHV等相关病毒引起的B细胞淋巴瘤的发生和药物治疗的研究提供细胞模型。由于KSHV主要在体内感染内皮细胞和B细胞，且它对内皮细胞的致病机制已被广泛研究，而KSHV感染B细胞致病的机制一直都还没有阐明，对于PEL原发性渗出性淋巴瘤目前尚无有效的治疗方法，稳定敲除p300基因的BCBL1细胞系的构建为KSHV感染相关的PEL的发病机制的研究提供了材料和研究方向，有助于深入了解肿瘤的发生机制。
(3)本发明构建方法可以为其他悬浮细胞系得到稳定敲除的细胞株提供经验。
(4)敲除BCBL1细胞系p300后，TPA/SB处理120h后KSHV裂解DNA复制和病毒粒子显著减少，KSHV裂解DNA复制减少了50％，病毒产生减少了约80％。p300对KSHV裂解复制的激活和病毒粒子的产生起重要的作用。
附图说明
图1是lentiCRISPR v2质粒结构图。
图2是质粒载体酶切检测图；其中，泳道M为marker，泳道1为对照组，泳道2、3为酶切后质粒。
图3是重组质粒电泳检测图；其中，泳道M为marker，泳道1为对照组，泳道2为重组质粒lentiCRISPRv2-sgp300-1，泳道3为重组质粒lentiCRISPRv2-sgp300-2，泳道4为重组质粒为lentiCRISPRv2-sgp300-3。
图4是重组质粒测序结果图。
图5是Western Blot检测结果图；其中，泳道1为野生型BCBL1细胞，泳道2为sgctrl-BCBL1细胞，泳道3为sgp300-1-BCBL1细胞，泳道4为sgp300-2-BCBL1细胞，泳道5为sgp300-3-BCBL1细胞。
图6是验证p300在KSHV DNA复制和病毒产生中的作用实验结果图；其中，A为RTA和K8的mRNA表达水平测定结果，B为细胞内KSHV基因组拷贝评估结果，C为标准曲线，D为上清中KSHV基因组拷贝评估结果。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
实施例1p300基因敲除的BCBL1细胞系构建
(1)sgRNA的设计：
以待敲除的p300基因全序列(GeneID:2033)为基础，利用sgRNA设计网站(http://cr ispr-era.stanford.edu和http：//crispr.mit.edu)在CDS区设计了3个靶向p300的sgRNA，sgR NA序列分别为：sgp300-1：5’-GCGGCCTAAACTCTCATCTC-3’(SEQ ID NO.1)、sgp300-2：5’-GACTGCGTAGGACCCTGATT-3’(SEQ ID NO.2)、sgp300-3：5’-GTTCAATTGGAGCAGGCCGA-3’(SEQ ID NO.3)，分别在5’端加上CACCG得到正向寡核苷酸链，同时根据sgRNA序列获得其对应的DNA互补链，在其5’端加上AAAC、3’端加上C得到反向寡核苷酸链，并委托上海生工生物公司合成，具体寡核苷酸链序列信息如下：
sgp300-1F：5’-CACCGGCGGCCTAAACTCTCATCTC-3’(SEQ ID NO.4)
sgp300-1R：5’-AAACGAGATGAGAGTTTAGGCCGCC-3’(SEQ ID NO.5)
sgp300-2F：5’-CACCGGACTGCGTAGGACCCTGATT-3’(SEQ ID NO.6)
sgp300-2R：5’-AAACAATCAGGGTCCTACGCAGTCC-3’(SEQ ID NO.7)
sgp300-3F：5’-CACCGGTTCAATTGGAGCAGGCCGA-3’(SEQ ID NO.8)
sgp300-3R：5’-AAACTCGGCCTGCTCCAATTGAACC-3’(SEQ ID NO.9)；
(2)引物退火：将合成的正向寡核苷酸链和反向寡核苷酸链退火形成双链，反应体系以及实验程序如下：
反应体系：
实验程序：(PCR仪中进行)
(3)lentiCRISPR v2质粒酶切：用BsmaI酶切lentiCRISPR v2质粒，反应体系以及实验程序如下：
反应体系：
将所有成分依次加入，轻轻混匀后，置于55℃水浴锅中酶切15min。
(4)酶切鉴定与胶回收
将质粒DNA酶切产物与10×loading buffer混匀后，用1％琼脂糖凝胶电泳1h，200mA，使用凝胶成像系统紫外拍摄功能进行酶切鉴定，以未酶切的lentiCRISPR v2质粒作为对照，结果如图2所示；然后使用胶回收试剂盒进行胶回收。
(5)重组质粒连接和转化
①将上述退火产物用无菌水稀释200倍后与50ng载体混合，加入适量的T4 DNA连接酶，PCR仪中16℃控温，过夜连接，得到三种重组质粒，分别命名为lentiCRISPR v2-sgp300-1、lentiCRISPR v2-sgp300-2、lentiCRISPR v2-sgp300-3。
②重组质粒的转化
将冻存的Stable3感受态细胞取出，冰上解冻；取适量过夜连接产物加入感受态细胞，轻弹混匀，置于冰上，静置至少30min；42℃热激90s，迅速置于冰中，静置3min；向离心管中加入800μL LB液体培养基，220rpm、30℃复苏菌种1h；取适量摇好的菌液，均匀涂布于含含100μg/ml氨苄霉素的LB固体琼脂培养基上，待菌液被充分吸收后，将平板倒置于37℃培养箱中，过夜培养16h左右；次日挑取单菌落于LB液体培养基中(含100μg/ml氨苄霉素)，37℃、220rpm恒温振荡摇床过夜摇菌，提取无内毒素质粒，以lentiCRISPR v2质粒作为对照，分别进行重组质粒电泳检测和测序鉴定。结果如图3和图4所示。
(6)慢病毒的制备与稳定细胞系的筛选
①慢病毒的制备和浓缩
复苏冻存的HEK 293T细胞，用DMEM(含10％v/vFBS和1％w/v青链双抗)培养，将其传代培养至细胞状态良好后进行后续实验；用0.25％w/v胰酶消化293T后进行计数，以5×106个细胞接种于10cm2培养皿，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，使细胞汇合率达到70％左右；在进行转染前30min，用4mL Opti-MEM培养基更换旧的培养基进行饥饿处理；质粒DNA的配制：将重组质粒和包装质粒按照以下比例以此加入1.5mL离心管中，即：10μg重组质粒，7.5ug psPAX2，5ug pMD2.G以及45uL P3000，并用Opti-MEM培养基稀释至500μL；脂质体的稀释：取30μL Lipofectamin 3000试剂于1.5mL离心管中，用Opti-MEM培养基稀释为500μL；将配制好的质粒DNA逐滴加入到稀释好的脂质体混合液中，轻轻混合后，室温孵育20min；将质粒DNA-脂质体复合物轻轻加入培养皿中，4～6h后补加完全培养基5mL；转染48h和72h后分别收集病毒上清。收集的慢病毒上清液是用孔径0.45μm的聚偏氟乙烯PVDF针式滤器(与20mL针管组合使用)过滤去除细胞碎片，然后用超高速冷冻离心机浓缩，20000rpm离心3h获得高滴度的病毒，然后悬浮并用于靶细胞的转染。
②稳定细胞系的筛选
复苏冻存的BCBL1细胞，将细胞转移到含有10％v/v FBS和1％w/v青链双抗的RPMI1640完全培养基中进行培养，待细胞长满后进行传代，传代培养至细胞状态较好时，进行后续的实验；使用细胞计数板对长势较好的BCBL1细胞进行计数，以每孔5×105个细胞浓度分别接种于两个6孔板中，并标记实验组和对照组；实验组接种慢病毒，加入含终浓度为8μg/mL的聚凝胺(polybrene)的RPMI1640完全培养基，体积为1mL；对照组不接种慢病毒，其余条件相同；感染慢病毒后4～6h，分别补加1mL RPMI1640完全培养基(无polybrene)，置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养；感染24h后及时更换新的培养基；感染48h后，使用含终浓度为4μg/mL的嘌呤霉素(puromycin)的RPMI1640完全培养基替换旧的培养基，进行初筛，然后降低浓度到2μg/mL直到对照组细胞全部死掉，实验组存活下来的细胞即为感染成功，并进行后续验证，分别命名为sgp300-1-BCBL1、sgp300-2-BCBL1、sgp300-3-BCBL1。
(7)Western Blot实验验证
分别取2mL BCBL1野生型和突变型细胞悬浮液，离心弃掉上清液；加入1mL预冷的PBS重复清洗2次；加入100μL裂解液(含1×蛋白酶抑制剂)，裂解收集蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳后转PVDF膜。封闭后，相应一抗(Rabbit polyclonal to KAT3B/p300和Rabbitpolyclonal to beta actin，abcam)4℃孵育过夜，二抗(Donkey Anti-Rabbit IgG H&；L(Alexa 488)，abcam)室温1h。双色红外系统照胶仪成像，以lentiCRISPR v2质粒感染的BCBL1细胞作为对照(sgctrl-BCBL1)，结果如图5所示。结果显示，sgp300-1-BCBL1细胞无p300蛋白表达，可见sgp300-1的打靶效率与其它位点相比具有显著性差异，能够实现高效打靶。选取构建成功的sgp300-1-BCBL1细胞进行后续试验。
(8)细胞内和细胞外病毒DNA的测定
①用佛波酯/丁酸钠(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate/sodiumbutyrate，TPA/SB)分别诱导(TPA的工作浓度为20μg/mL，SB的工作浓度为0.3M)sgctrl-BCBL1细胞和sgp300-1-BCBL1细胞，激活KSHV裂解复制。分别在诱导后48h和72h使用RT-qPCR测定RTA和K8 mRNA水平；在0h、48h、72h、120h，收集细胞和上清，提取细胞内和上清中KSHV基因组DNA，并用针对潜伏基因LANA的特异性引物分别进行RT-qPCR相对定量和绝对定量分析，结果如图6所示。
②相对荧光定量PCR
提取RNA后进行反转录或将相应DNA产物进行qRT-PCR鉴定，在冰上按照下列成分进行PCR反应液的配制，然后分装到反应管中，快速离心到管底，在LightCycler 96系统上进行qPCR，其循环参数为：95℃30s，随后依次为95℃5s，60℃30s，95℃5s，65℃60s，50℃30s。在运行结束时，用熔融曲线分析引物的特异性和扩增产物的纯度，并根据2-Δct方法计算相对定量值，并以GAPDH基因作为内参，对样品进行归一化处理。每个样本进行三次处理，实验至少独立重复三次。所用引物的序列如下：
K8-F：5’-CCTGGACGCTCTCTCACACA-3’(SEQ ID NO.10)
K8-R：5’-GGATCTGCGAGTTGGAAGCT-3’(SEQ ID NO.11)
RTA-F：5’-CAGTAATCACGGCCCCTTGA-3’(SEQ ID NO.12)
RTA-R：5’-AGACCCGGCGTTTATTAGTACGT-3’(SEQ ID NO.13)
LANA-F：5’-TTACCTCCACCGGCACTCTT-3’(SEQ ID NO.14)
LANA-R：5’-GGATGGGATGGAGGGATTG-3’(SEQ ID NO.15)
GAPDH-F：5’-ACTTCAACAGCGACACCCACTC-3’(SEQ ID NO.16)
GAPDH-R：5’-TCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGCT-3’(SEQ ID NO.17)；
反应体系：
③qPCR绝对定量和标准曲线的建立
提取包含LANA基因(GeneID：4961527)的质粒pEGFP-LANA(以BCBL-1的cDNA为模板扩增得到LANA基因片段，连接到pEGFP-C2的ECOR I和Kpn I酶切位点之间得到)作为模板，并检测其浓度。梯度稀释质粒pEGFP-LANA，得到浓度为8×107，8×106，8×105，8×104，8×103拷贝/μL的模板进行qPCR绝对定量。以Cq值为纵坐标，初始浓度的对数为横坐标绘制标准曲线。拷贝数的计算公式如下：每μL质粒拷贝数＝[质粒浓度(ng/μL)×1μL]×10-9/[(质粒分子量+插入片段分子量)×660]×(6.02×1023copies/mol)。
此外，来自培养基的细胞外病毒后代还通过定量衣壳化的病毒DNA来确定(图6D)。结果表明，敲除p300后，TPA/SB处理120h后KSHV裂解DNA复制和病毒显著减少(图6B和图6D)，KSHV裂解DNA复制减少了50％，病毒产生减少了约80％。以上结果表明p300对KSHV激活和病毒粒子的产生起重要的作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 暨南大学
<120> 一种敲除p300基因的BCBL1细胞系及其构建方法与应用
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> sgp300-1
<400> 1
gcggcctaaa ctctcatctc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> sgp300-2
<400> 2
gactgcgtag gaccctgatt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> sgp300-3
<400> 3
gttcaattgg agcaggccga 20
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> sgp300-1F
<400> 4
caccggcggc ctaaactctc atctc 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> sgp300-1R
<400> 5
aaacgagatg agagtttagg ccgcc 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> sgp300-2F
<400> 6
caccggactg cgtaggaccc tgatt 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> sgp300-2R
<400> 7
aaacaatcag ggtcctacgc agtcc 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> sgp300-3F
<400> 8
caccggttca attggagcag gccga 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> sgp300-3R
<400> 9
aaactcggcc tgctccaatt gaacc 25
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> K8-F
<400> 10
cctggacgct ctctcacaca 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> K8-R
<400> 11
ggatctgcga gttggaagct 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> RTA-F
<400> 12
cagtaatcac ggccccttga 20
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> RTA-R
<400> 13
agacccggcg tttattagta cgt 23
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LANA-F
<400> 14
ttacctccac cggcactctt 20
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LANA-R
<400> 15
ggatgggatg gagggattg 19
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> GAPDH-F
<400> 16
acttcaacag cgacacccac tc 22
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> GAPDH-R
<400> 17
tctcttcctc ttgtgctctt gct 23
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