重组大肠杆菌表达L-天冬氨酸-α-脱羧酶的载体和方法
阅读说明：本技术 重组大肠杆菌表达L-天冬氨酸-α-脱羧酶的载体和方法 (Vector and method for expressing L-aspartic acid-alpha-decarboxylase by recombinant escherichia coli ) 是由 蒋泰隆 刘文杰 邱贵森 于 2021-09-16 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种在重组大肠杆菌表达L-天冬氨酸-α-脱羧酶的载体,以及使用相应载体的表达L-天冬氨酸-α-脱羧酶的方法。所述方法能够在减少包涵体产物形成的同时,保证目标蛋白的表达量。适用于工业化大规模生产,降低成本。(The invention provides a vector for expressing L-aspartate-alpha-decarboxylase in recombinant escherichia coli, and a method for expressing the L-aspartate-alpha-decarboxylase by using the corresponding vector. The method can reduce the formation of inclusion body products and ensure the expression quantity of target protein. Is suitable for industrial large-scale production and reduces the cost.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及一种在重组大肠杆菌表达L-天冬氨酸-α-脱羧酶时减少包涵体的方法。
背景技术
β-丙氨酸(3-氨基丙酸)广泛应用于医药、食品、化工等领域，目前主要是以丙烯腈或β-氨基丙腈为底物进行化学合成。随着环境问题日益引起人们的关注，传统的化学方法将逐渐被生物方法所取代，包括酶转化法、全细胞催化法和发酵法。
目前β-丙氨酸的合成主要以化学法为主，化学合成法是目前生产β-丙氨酸的主要方法，但是其存在工艺条件苛刻、耗能多及环境不友好等缺点。
生物酶法是以L-天冬氨酸为底物，加入L-天冬氨酸-α-脱羧酶(ADC)，脱羧生成β-丙氨酸，生物酶法具有环境友好，工艺简单，绿色环保等优点，未来逐步成为生产β-丙氨酸的主要工艺，近几十年来受到越来越多的关注。关于细菌来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶的研究较多，包括来源于大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌和枯草芽孢杆菌等。但是大部分细菌来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶都是小分子蛋白，酶活不够稳定，用重组大肠杆菌表达的来源于微生物的L-天冬氨酸-α-脱羧酶小分子目的蛋白需要后续蛋白自剪切产生活性亚基才有催化能力，发酵过程中小分子蛋白容易被蛋白酶降解等缺点致使生物合成法一直未能产业化。
昆虫赤拟谷盗(Tribolium castaneum)是常用L-天冬氨酸-α-脱羧酶的来源，但源自赤拟谷盗的L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因在大肠杆菌中表达很容易形成蛋白错误折叠的包涵体。
专利CN 108660102A和CN 11110561C提到降低目的蛋白包涵体的方法，共表达其它可溶性蛋白，通过其它可溶性蛋白来抑制目的蛋白的包涵体。虽然在抑制包涵体方面确实有一定的作用，但是发明人尝试同样构建可溶比较强的分子伴侣蛋白和常用的融合标签蛋白再和目的蛋白共表达后发现：目的蛋白确实减少了很大量的包涵体，是目的蛋白的表达量同样也减少了。分析原因是其它可溶性蛋白虽然辅助了目的蛋白包涵体的减少，但是占有了一半左右的蛋白表达空间。这也是目前使用大肠杆菌表达的矛盾所在：减少包涵体的同时，难以保证蛋白表达量不会减少。
现有技术中，解决包涵体的常用方法有以下几种：
第一，降低培养和诱导温度，减低蛋白表达速率使目的蛋白正确折叠，不容易形成包涵体。但降温后大肠杆菌的生长速率受到很大影响，最终产品的生物量减少，且在工业化大规模生产中降温需要更多的能耗，成本较高。
第二，构建可溶性较强的分子伴侣蛋白和常用的融合标签蛋白，与目的蛋白共表达。该方法在不降低温度的基础上有效地减少包涵体，但目的蛋白的表达量被分子伴侣蛋白和常用的融合标签蛋白占据了一部分，目的蛋白的表达量减少。因此该方法不能在减少包涵体的同时，保证目的蛋白的表达量。
第三，大肠杆菌诱导时添加某些化学物质(例如抗氧化剂和还原剂等)以减少包涵体。该方法的弊端是很多化学物质对大肠杆菌生长和蛋白表达有抑制作用。
因此，本领域仍需要一种在减少目的蛋白包涵体的同时，不会降低目的蛋白表达量，且无需添加化学物质或增加发酵能耗的方法。
发明内容
本发明由此提供了一种在较少目的蛋白包涵体的同时，不会降低目的蛋白表达量，且无需添加化学物质或增加发酵能耗的方法。
本发明选择来源于昆虫赤拟谷盗的L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因，分别插入到含有不同抗性的大肠杆菌载体pET32a(氨苄抗性)和pCDFDuet-1(链霉素抗性)中，得到含有目的基因的质粒pET32a-ADC和pCDFDuet-ADC。同时，将这两段质粒分别转入宿主菌BL21(DE3)中，得到共表达双质粒菌种pET32a-pCDFDuet-ADC-BL21(DE3)。由于pCDFDuet-1是共表达载体，两种质粒可以共存，在获得的共表达双质粒菌种发酵诱导蛋白表达后发现：目的蛋白的包涵体大大减少，但目的蛋白的总量并未减少。基于此原理，类似地，同时将得到含有目的基因的质粒pET32a-ADC，pET28a-ADC和pCDFDuet-ADC。同时将这三段质粒分别转入宿主菌BL21(DE3)中，得到共表达三质粒菌种pET28a-pET32a-pCDFDuet-ADC-BL21(DE3)，在获得的共表达三质粒菌种发酵诱导蛋白表达后发现：目的蛋白包涵体大大减少，而且相比双质粒包涵体更少，但同时可溶性目的蛋白总量也比双质粒共表达略少。
本发明方法成功地解决了既减少包涵体又保证目的蛋白的表达量技术问题。其原因可能是两种不同抗性质粒的存在，在表达蛋白时存在竞争作用，目的蛋白的表达速率被降低，因而包涵体也减少；而两种质粒表达的都是目的蛋白，由此目的蛋白表达量得到了一定的叠加作用。由此，本发明方法成功解决了包涵体和目的蛋白总量的矛盾。
在本发明的上下文中，术语“包涵体”是指，外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与胞质中其他成分有明显区别。包涵体形成比较复杂，与胞质内蛋白质生成速率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体。此外，包涵体的形成还被认为与宿主菌的培养条件，如培养基成分、温度、pH值、离子强度等因素有关。细胞中的生物学活性蛋白质常以可溶性或分子复合物的形式存在，功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性。
如本文所用的术语“包含”、“包括”、“含有”“具有”及相应的同义词是指，“包括但不限于”。术语“基本上由……组成”是指组合、方法等可包括其他成分和/或步骤，只要所述其他成分和/或步骤不会实质上地改变相应的组合或方法及其特征。
如本文所使用，“一个”或“一种”、“该”以及“所述”包括相应指代物的“复数”形式。例如，可包括多个或多种，也包括多种的混合形式。
术语“表达”是指将序列信息转变成相应表达产物，包括直接转录产物(例如mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、核酶、结构RNA或任何其他类型的RNA)或通过mRNA翻译产生的蛋白质。
术语“编码”指DNA多核苷酸序列可转录为翻译蛋白质的RNA(mRNA)；或可转录为不翻译蛋白质的RNA(tRNA、rRNA等非编码RNA)；或可翻译成蛋白质的RNA多核苷酸序列。
术语“DNA”、“RNA”或“核酸”或“核酸片段”或“多核苷酸”是指多核苷酸或构建体中存在的任何一个或多个核酸区段。可以线性(例如mRNA)或环状(例如质粒)形式，以及双链或单链形式提供核酸或其片段。“分离”的核酸或多核苷酸表示已从其天然环境中分离获得的核酸分子、DNA或RNA。例如，本发明上下文中，所述载体中所含的重组多核苷酸即分离的。分离的多核苷酸的其它实例包括异源宿主细胞中维持的重组多核苷酸或者溶液中的纯化多核苷酸等。
“基因”是指包含编码功能性分子的核苷酸的多核苷酸，所述功能性分子包括由仅由转录产生的功能性分子(生物活性RNA)或通过转录和翻译产生的功能性分子(例如多肽)。术语“基因”包含cDNA和基因组DNA核酸，还指表达特定RNA、蛋白质或多肽的核酸片段，其包含编码序列前(5’非编码序列)和后(3’非编码序列)的调控序列。“天然基因”是指在自然界中发现的、具有其自身调控序列的任何基因。“嵌合基因”是指非天然基因的、包含非天然共同存在的调控和/或编码序列的任何基因。“内源基因”是指位于生物体基因组中其天然位置的天然基因。“外源基因”或“异源基因”是指通常不在宿主中而通过基因转移引入宿主的基因。
术语“多肽”、“肽”、和“蛋白质”在本发明中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。
如本文所用，术语“重组”核酸是指非天然存在的核酸，例如通过人工干预将原本分开的核酸片段连接在一起以产生具有目的功能的组合核酸片段。人工的组合常通过化学合成手段或通过人工操作核酸的区段(例如通过基因工程化技术)来完成。
术语“载体”指在基因工程技术中将外源核酸片段转移至受体细胞的一种能自我复制的核酸分子，例如质粒、噬菌体、病毒或粘粒。“表达载体”是指，在转化进宿主后表达所插入核酸序列的载体、质粒或运载体。通常将所克隆基因(即所插入的核酸序列)置于调控元件(例如启动子、最小启动子、增强子等)的控制下。
本文中，术语“质粒(plasmid)”是指染色体外元件，其常携带不作为细胞核心代谢机制部分的基因，且通常是环状双链DNA分子的形式。这些元件可以是任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，线性、环状或超螺旋的单链或双链DNA或RNA。通常，质粒含有在宿主细胞(例如大肠杆菌)中有功能的复制起点，以及用于检测包含该质粒的宿主细胞的选择标记。在一些实施方案中，质粒是闭环DNA分子。“共表达质粒”是指不同类型质粒在同一宿主菌里均可表达。
术语“调控序列”是指存在于编码序列内部或旁侧(5’或3’端)序列中调节转录、RNA加工或稳定性、翻译的特异性核酸序列。调控序列包括但不限于：启动子、增强子、内含子、转录调控元件、多聚腺苷酸化信号、RNA加工信号、翻译增强元件等。
术语“可操作地连接”指调控元件(例如但不限于，启动子序列、转录终止序列等)与核酸序列(例如，编码序列或开放读码框)连接，使得核苷酸序列的转录和翻译被所述调控元件控制和调节。
术语“启动子”是能够结合RNA聚合酶并且启动下游(3’方向)编码或者非编码序列的转录的DNA调节区，指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。
“导入”或“引入”细胞是指将核酸分子(例如质粒、线性核酸片段、RNA等)或蛋白质通过包括但不限于农杆菌转化、基因枪轰击、电穿孔、PEG转化等多种方法转化至细胞，使得所述核酸或蛋白质在细胞中能够发挥功能。
首先，在本发明的第一方面，本发明提供了一种重组大肠杆菌可溶性表达系统，所述系统包含至少两种表达载体，其中每个所述表达载体分别包含L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因序列，且可溶性表达L-天冬氨酸-α-脱羧酶；其中所述表达载体中至少一个为共表达质粒。
在一些实施方案中，其中所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因来自昆虫赤拟谷盗。
在进一步的实施方案中，所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经替换、缺失或增加一个或多个核苷酸获得的变体序列，其中所述变体序列编码相同功能的L-天冬氨酸-α-脱羧酶；或者所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示或由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经替换、缺失或增加一个或多个氨基酸获得的变体序列。
在一些实施方案中，所述表达系统中，表达载体选自质粒、粘粒或噬菌体，在优选的实施方案中，表达载体选自质粒。
在进一步的实施方案中，所述表达载体为质粒，选自下组的两种或以上：原核表达载体，如pQE系列(如pQE2、pQE9、pQE30/31/32、pQE40、pQE70、pQE80L、pQETirs system等)；pET系列(如pET3a、pET3d、pET11a、pET12a、pET14b、pET15b、pET16b、pET17b、pET19b、pET20b、pET21a/b/d、pET22b、pET23a、pET23b、pET24a/b、pET25b、pET26b、pET27b、pET28a/b、pET29a、pET30a、pET31b、pET32a、pET35b、pET38b、pET39b、pET40b、pET41a/b、pET42a、pET43.1a/b、pET44a、pET49b、pET302、pET303、pETHis、pETDsb、pETGST、pET Trx)，Pet-GST，pGEX系列(含GST标签)，pMAL系列(如pMAL-c2x、-c4x、-c4e、-c5x、-p5x)，pBAD，pBADHis，pBADmycHis系列，pTrc99a，pTrcHis系列，pBV220、221、222，pTXB系列，pLLP-ompA，pIN-III-ompA(分泌型表达系列)，pQBI63(原核表达带荧光)，pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C，pGEX4T-1/2/3/6p-1/6p-2/2tk/3c，pBV220/221/222，pTrx HisA/B/C，pBAD24/34/43，pBAD HisA/B/C，pPinPoint-Xa1/2/3，pGEM Ex1，pGEM7ZF(+)，pTrc99A，pTwin1，pEZZ18，pkk232-8，pkk233-3，pACYC184，pBR332，pUC119，pTYB1，pTYB2，pTYB4，pTYB11，pBlueScript SK(+)/(-)，pLLPompA，pMBP-P，pMBP-c；大肠杆菌冷激质粒：pColdI，pColdII，pColdIII，pColdTF；pACYCduet-1，pETduet-1，pCDFduet-1，pRSFduet-1，pG-KJE8。优选pET32a、pCDFDuet-1、pET24a、pET21a、pET28a、pACYCDuet-1,pTrcHisA。
在优选的实施方案中。其中所述表达系统为双质粒表达系统，其中所述质粒选自pET32a和pCDFDuet-1。
在进一步优选的实施方案中，其中所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因位于质粒酶切位点EcoRI/HindIII。
在本发明的另一方面，还提供一种宿主细胞，其包含本发明所述的表达系统，其中所述宿主细胞为重组大肠杆菌。在优选的实施方案中，所述大肠杆菌为BL21(DE3)。
在本发明的另一方面，还提供本文所述的表达系统或大肠杆菌宿主细胞在用于表达L-天冬氨酸-α-脱羧酶中的用途。
在本发明的另一方面，还提供本文所述的表达系统或大肠杆菌宿主细胞在用于在大肠杆菌表达L-天冬氨酸-α-脱羧酶过程中减少包涵体的用途。
在本发明的另一方面，还提供一种大肠杆菌表达系统表达L-天冬氨酸-α-脱羧酶蛋白的方法，其包括以下步骤：
1)构建本发明上文所述的重组大肠杆菌表达系统；
2)用所述表达系统转化大肠杆菌宿主细胞；
3)发酵培养经转化的大肠杆菌宿主细胞。
在一些实施方案中，所述大肠杆菌宿主细胞为BL21(DE3)、BW25113、BL21、Rosetta-origami2(DE3)、BL21(DE3)-star等。
在优选的实施方案中，其中所述表达方法还包括步骤4)分离纯化所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶蛋白。
在本发明的另一方面，还提供了一种在大肠杆菌表达L-天冬氨酸-α-脱羧酶过程中减少包涵体的方法，其包括以下步骤：
1)构建本发明上文所述的重组大肠杆菌表达系统；
2)用所述表达系统转化大肠杆菌宿主细胞；
3)发酵培养经转化的大肠杆菌宿主细胞。
在一些实施方案中，所述大肠杆菌宿主细胞为BL21(DE3)。
在优选的实施方案中，其中所述表达方法还包括步骤4)分离纯化所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶蛋白。
本发明的技术效果：
1)本发明双质粒共表达菌种pET32a-pCDFDuet-BL21(DE3)的包涵体明显少于pET32a-BL21(DE3)和pCDFDuet-BL21(DE3)；共表达菌种的可溶性目的蛋白量也远多于pET32a-BL21(DE3)或pCDFDuet-BL21(DE3)。共表达菌种的酶活比pET32a-BL21(DE3)和pCDFDuet-BL21(DE3)的酶活分别高出95.1％和123.2％。在有效地减少重组大肠杆菌表达目的蛋白包涵体的基础上，提高了可溶性目的蛋白量。
2)本发明三质粒共表达菌种pET28a-pET32a-pCDFDuet-BL21(DE3)的包涵体明显少于单质粒菌种pET32a-BL21(DE3)，pCDFDuet-BL21(DE3)以及双质粒共表达菌种pET32a-pCDFDuet-BL21(DE3)；三质粒共表达菌种的可溶性目的蛋白量略少于双质粒共表达菌种pET32a-pCDFDuet-BL21(DE3)。
3)本发明方法无需降温，减少了能耗。
4)本发明未使用化学物质来减少包涵体，因而未抑制菌种生长，不会为后续的分离纯化引入杂质。
附图说明
结合以下本发明的附图和实施例可更容易地理解本发明内容。除非另有说明，本文中使用的所有技术和术语与本发明所属技术领域的技术人员通常理解的含义相同。除非特别说明，本文应用和涵盖的技术是本发明所属技术领域的技术人员熟知的标准方法。所述材料、方法和实施例仅用作说明目的，而不以任何方式限制本发明的保护范围。
图1：pET32a质粒图谱；
图2：pET28a质粒图谱；
图3：pCDFDuet-1质粒图谱；
图4：共表达菌种pET32a-pCDFDuet-ADC-BL21(DE3)和单质粒菌种pET32a-ADC-BL21(DE3)发酵后电泳图对比；
图5：共表达菌种pET32a-pCDFDuet-ADC-BL21(DE3)和单质粒菌种pCDFDuet-ADC-BL21(DE3)发酵后电泳图对比；
图6：共表达菌种pET28a-pET32a-pCDFDuet-ADC-BL21(DE3)和双质粒菌种pET32a-pCDFDuet-ADC-BL21(DE3)发酵后电泳图对比。
具体实施方式
1、实验材料
1.1菌种与质粒
本实验研究采用的大肠杆菌宿主菌为BL21(DE)3(可商购)，宿主菌于发明人实验室液氮保存。表达载体为pET28a(卡那霉素抗性)、pET32a(氨苄抗性)和pCDFDuet-1(链霉素抗性)(购自金斯瑞生物科技股份有限公司)。目的基因来源于昆虫赤拟谷盗的L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因(ADC)(SEQ ID NO:1)，序列全基因合成委托金斯瑞生物科技股份有限公司提供，以构建表达载体pET32a-ADC，pET28a-ADC和pCDFDuet-ADC(由金斯瑞生物科技股份有限公司构建)。得到质粒后同时转化大肠杆菌BL21(DE)3得到双质粒共表达菌种pET32a-pCDFDuet-ADC-BL21(DE3)和三质粒共表达菌种pET28a-pET32a-pCDFDuet-ADC-BL21(DE3)，菌种液氮保存。
1.2培养基
LB一级种子培养基：10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母浸粉；LB固体培养基：10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母浸粉，20g/L琼脂粉；TB摇瓶发酵培养基：24g/L酵母浸粉，12g/L蛋白胨，4g/L甘油。
2、质粒转化
2.1宿主菌BL21(DE3)感受态的制备
2.1.1将宿主菌在琼脂培养基平板上划线，37℃培养16～20小时；
2.1.2从平板中取出1个单菌落，移至装有50ml LB培养基的250ml三角瓶中，37℃，220rpm振荡培养过夜；
2.1.3往50ml LB培养基中加入1ml的2.1.2中培养过夜的培养液，于37℃摇床220rpm培养3小时；
2.1.4将培养液装入已预冷的50ml无菌离心管中，于冰上5～10分钟，4℃4,000rpm离心7分钟，弃上清；
2.1.5沉淀用10ml冰冷的CaCl2溶液重悬，4℃4,000rpm离心5分钟，弃上清；
2.1.6沉淀加入30ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2悬浮细胞，冰浴30分钟，于4℃以4000rpm离心5分钟，弃上清；
2.1.7用3ml冰冷的0.1mol/L CaCl2悬浮细胞，加入1.0ml预冷的80％甘油溶液，分装至已预冷的1.5ml无菌eppendorf管中，每管200μl，置于-60℃以下冻存，作为感受态细胞。
2.2双质粒共表达菌种pET32a-pCDFDuet-ADC-BL21(DE3)的制备
液氮中取质粒pET32a-ADC(氨苄抗性)和pCDFDuet-ADC(链霉素抗性)和感受态细胞BL21(DE)3，迅速放入冰浴中，准备转化步骤：
2.2.1无菌条件下分别取1μL质粒缓慢加入到含有100μL感受态细胞的离心管中，迅速冰浴30分钟，操作过程中一定要轻拿轻放，不要晃动，感受态细胞比较脆弱，容易影响转化效率；
2.2.2冰浴30分钟后，取出放入42℃，循环水浴锅中热激90秒，取出冰浴2分钟后取出，无菌条件下离心管中加入不带抗性的LB液体培养基400μL，摇床复苏培养，培养条件为37℃，160RPM，60分钟；
2.2.3复苏结束后取培养液50μL无菌条件下，涂布加有氨苄抗性和链霉素抗性的LB固体培养基平板于培养箱过夜37℃培养；
2.2.4挑取单菌落转接10mL LB加入氨苄抗性和链霉素抗性液体培养基，37℃，180RPM培养6小时后加入15％甘油保种，得到工程菌种pET32a-pCDFDuet-ADC-BL21(DE3)，放液氮保藏。
2.3三质粒共表达菌种pET28a-pET32a-pCDFDuet-ADC-BL21(DE3)的制备
液氮中取质粒pET32a-ADC(氨苄抗性)，pET28a-ADC(卡那霉素抗性)和pCDFDuet-ADC(链霉素抗性)和感受态细胞BL21(DE)3，迅速放入冰浴中，准备转化步骤：
2.2.1无菌条件下分别取1μL质粒缓慢加入到含有100μL感受态细胞的离心管中，迅速冰浴30分钟，操作过程中一定要轻拿轻放，不要晃动，感受态细胞比较脆弱，容易影响转化效率；
2.2.2冰浴30分钟后，取出放入42℃，循环水浴锅中热激90秒，取出冰浴2分钟后取出，无菌条件下离心管中加入不带抗性的LB液体培养基400μL，摇床复苏培养，培养条件为37℃，160RPM，60分钟；
2.2.3复苏结束后取培养液50μL无菌条件下，涂布加有氨苄抗性，卡那霉素抗性和链霉素抗性的LB固体培养基平板于培养箱过夜37℃培养；
2.2.4挑取单菌落转接10mL LB加入氨苄抗性，卡那霉素抗性和链霉素抗性液体培养基，37℃，180RPM培养6小时后加入15％甘油保种，得到工程菌种pET28a-ADC-pET32a-pCDFDuet-ADC-BL21(DE3)，放液氮保藏。
2.4菌种PET32a-ADC-BL21(DE3)的制备
液氮中取质粒pET32a-ADC(氨苄抗性)和感受态细胞BL21(DE)3，迅速放入冰浴中，准备转化步骤：
2.3.1无菌条件下分别取1μL质粒缓慢加入到含有100μL感受态细胞的离心管中，迅速冰浴30分钟，操作过程中一定要轻拿轻放，不要晃动，感受态细胞比较脆弱，容易影响转化效率；
2.3.2冰浴30分钟后，取出放入42℃，循环水浴锅中热激90秒，取出冰浴2分钟后取出，无菌条件下离心管中加入不带抗性的LB液体培养基400μl，摇床复苏培养，培养条件为37℃，160RPM，60分钟；
2.3.3复苏结束后取培养液50μL无菌条件下，涂布加有氨苄抗性和链霉素抗性的LB固体培养基平板于培养箱过夜37℃培养；
2.3.4挑取单菌落转接10mL LB加入氨苄抗性液体培养基，37℃，180RPM培养6小时后加入15％甘油保种，得到工程菌种pET32a-ADC-BL21(DE3)，放液氮保藏。
2.5菌种pCDFDuet-ADC-BL21(DE3)的制备
液氮中取质粒pCDFDuet-ADC(链霉素抗性)和感受态细胞BL21(DE3)，迅速放入冰浴中，准备转化步骤：
2.4.1无菌条件下分别取1μL质粒缓慢加入到含有100μL感受态细胞的离心管中，迅速冰浴30分钟，操作过程中一定要轻拿轻放，不要晃动，感受态细胞比较脆弱，容易影响转化效率；
2.4.2冰浴30分钟后，取出放入42℃，循环水浴锅中热激90秒，取出冰浴2分钟后取出，无菌条件下离心管中加入不带抗性的LB液体培养基400μL，摇床复苏培养，培养条件为37℃，160RPM，60分钟；
2.4.3复苏结束后取培养液50μL无菌条件下，涂布加有氨苄抗性和链霉素抗性的LB固体培养基平板于培养箱过夜37℃培养；
2.4.4挑取单菌落转接10mL的LB加入链霉素抗性液体培养基，37℃，180RPM培养6小时后加入15％甘油保种，得到工程菌种pCDFDuet-ADC-BL21(DE3)，放液氮保藏。
3、菌种摇瓶发酵
实验器材：超净工作台，摇床，培养箱，灭菌锅，移液枪，离心机，超声破碎仪，微波炉，振荡器，蛋白电泳仪，电子天平，液氮罐。
实施例1：
1)双质粒共表达菌种pET32a-pCDFDuet-ADC-BL21(DE3)和单质粒菌种pET32a-ADC-BL21(DE3)摇瓶细胞发酵对比培养
共表达pET32a-pCDFDuet-ADC-BL21(DE3)：甘油管100μL→10mL试管LB液体培养基(加入100mg/L的氨苄和50mg/L的链霉素)，30℃，150RPM过夜培养，转接5mL→500mL的TB摇瓶发酵培养基装液量200mL(加入100mg/L的氨苄和50mg/L的链霉素)，37℃，180RPM培养6小时→加入10g/L的α-乳糖诱导，诱导温度30℃→诱导17小时结束离心收集细胞→取1g离心湿细胞加入10g去离子水混匀→超声破碎离心，取破碎上清和破碎液沉淀，加去离子水稀释十倍重置液，分别跑蛋白电泳SDS-PAGE检测蛋白表达量。
pET32a-ADC-BL21(DE3)：甘油管100μL→10mL试管LB液体培养基(加入100mg/L的氨苄)，30℃，150RPM过夜培养，转接5mL→500mLTB摇瓶发酵培养基装液量200mL(加入100mg/L的氨苄)，37℃，180RPM培养6小时→加入10g/L的α-乳糖诱导，诱导温度30℃→诱导17小时结束离心收集细胞→取1g离心湿细胞加入10g去离子水混匀→超声破碎离心，取破碎上清和破碎液沉淀，加去离子水稀释十倍重置液，分别跑蛋白电泳SDS-PAGE检测蛋白表达量。
2)酶学性质测定
取100μL酶液于1.5mL离心管中，加入终浓度100mmol/L的L-天冬氨酸钠，PLP终浓度1mmol/L，于37℃，pH 6.5条件下反应30min检测酶活。
酶活定义：在37℃，pH 6.5的条件下，每小时转化L-天冬氨酸钠生成1mmolβ-丙氨酸所需酶量为一个酶活力单位U。
比酶活定义：每克蛋白所含的酶活力单位数。
实施例2：
1)双质粒共表达菌种pET32a-pCDFDuet-ADC-BL21(DE3)和单质粒菌种pCDFDuet-ADC-BL21(DE3)摇瓶细胞发酵对比培养
pET32a-pCDFDuet-ADC-BL21(DE3)：甘油管100μL→10mL试管LB液体培养基(加入100mg/L的氨苄和50mg/L的链霉素)，30℃，150RPM过夜培养，转接5mL→500mL的TB摇瓶发酵培养基装液量200mL(加入100mg/L的氨苄和50mg/L的链霉素)，37℃，180RPM培养6小时→加入10g/L的α-乳糖诱导，诱导温度30℃→诱导17小时结束离心收集细胞→取1g离心湿细胞加入10g去离子水混匀→超声破碎离心取破碎上清和破碎液沉淀加去离子水稀释十倍重置液分别跑蛋白电泳SDS-PAGE检测蛋白表达量。
pCDFDuet-ADC-BL21(DE3)：甘油管100μL→10mL试管LB液体培养基(50mg/L的链霉素)，30℃，150RPM过夜培养，转接5mL→500mLTB摇瓶发酵培养基装液量200mL(50mg/L的链霉素)，37℃，180RPM培养6小时→加入10g/L的α-乳糖诱导，诱导温度30℃→诱导17小时结束离心收集细胞→取1g离心湿细胞加入10g去离子水混匀→超声破碎离心取破碎上清和破碎液沉淀加去离子水稀释十倍重置液分别蛋白电泳SDS-PAGE检测蛋白表达量。
2)酶学性质测定
取100μL酶液于1.5mL离心管中，加入终浓度100mmol/LL-天冬氨酸钠，PLP终浓度1mmol/L，于37℃，pH 6.5条件下反应30min检测酶活。
酶活定义：在37℃，pH 6.5的条件下，每小时转化L-天冬氨酸钠生成1mmol的β-丙氨酸所需酶量为一个酶活力单位U。
实施例3：
1)三质粒共表达菌种pET28a-pET32a-pCDFDuet-ADC-BL21(DE3)和双质粒菌种pET32a-pCDFDuet-ADC-BL21(DE3)摇瓶细胞发酵对比培养
双质粒共表达pET32a-pCDFDuet-ADC-BL21(DE3)：甘油管100μL→10mL试管LB液体培养基(加入100mg/L的氨苄和50mg/L的链霉素)，30℃，150RPM过夜培养，转接5mL→500mL的TB摇瓶发酵培养基装液量200mL(加入100mg/L的氨苄和50mg/L的链霉素)，37℃，180RPM培养6小时→加入10g/L的α-乳糖诱导，诱导温度30℃→诱导17小时结束离心收集细胞→取1g离心湿细胞加入10g去离子水混匀→超声破碎离心，取破碎上清和破碎液沉淀，加去离子水稀释十倍重置液，分别跑蛋白电泳SDS-PAGE检测蛋白表达量。
三质粒共表达pET28a-pET32a-pCDFDuet-ADC-BL21(DE3)：甘油管100μL→10mL试管LB液体培养基(加入100mg/L的氨苄，50mg/L的链霉素和卡那霉素)，30℃，150RPM过夜培养，转接5mL→500mLTB摇瓶发酵培养基装液量200mL(加入100mg/L的氨苄，50mg/L的链霉素和卡那霉素)，37℃，180RPM培养6小时→加入10g/L的α-乳糖诱导，诱导温度30℃→诱导17小时结束离心收集细胞→取1g离心湿细胞加入10g去离子水混匀→超声破碎离心，取破碎上清和破碎液沉淀，加去离子水稀释十倍重置液，分别跑蛋白电泳SDS-PAGE检测蛋白表达量。
2)酶学性质测定
取100μL酶液于1.5mL离心管中，加入终浓度100mmol/L的L-天冬氨酸钠，PLP终浓度1mmol/L，于37℃，pH 6.5条件下反应30min检测酶活。
酶活定义：在37℃，pH 6.5的条件下，每小时转化L-天冬氨酸钠生成1mmol的β-丙氨酸所需酶量为一个酶活力单位U。
4、酶活检测和SDS-PAGE电泳结果
实施例1和2中样品进行蛋白电泳SDS-PAGE，上样编号以及酶活检测结果如下所示：
电泳结果：共表达pET32a-pCDFDuet-ADC-BL21(DE3)与仅表达pET32a-ADC-BL21(DE3)或pCDFDuet-ADC-BL21(DE3)得到的破碎液上清和沉淀的SDS-PAGE结果见图4和图5。
从电泳图条带可见，共表达pET32a-pCDFDuet-ADC-BL21(DE3)的破碎液上清部分中蛋白含量明显比仅表达pET32a-ADC-BL21(DE3)或pCDFDuet-ADC-BL21(DE3)的更高；而共表达菌种pET32a-pCDFDuet-ADC-BL21(DE3)目的蛋白包涵体明显少于单质粒菌种pET32a-ADC-BL21(DE3)和pCDFDuet-ADC-BL21(DE3)。
三质粒(图6)与双质粒共表达相比，双质粒共表达菌种pET32a-pCDFDuet-ADC-BL21(DE3)可溶性目的蛋白总量高于三质粒共表达菌种pET28a-pET32a-pCDFDuet-ADC-BL21(DE3)，即双质粒共表达表达效果优于三质粒共表达，但三质粒共表达的包涵体少于双质粒共表达，即质粒越多降解包涵体的效果越明显，但总蛋白量也随之减少。
上述结果表明本发明的共表达方法确实起到了抑制目的蛋白包涵体的作用，更关键的是共表达菌种的可溶性目的蛋白表达量要多于单质粒菌种，即本发明的共表达菌种在减少包涵体的同时还提高了可溶性目的蛋白的表达总量。
本发明巧妙地将同一种目的基因插入到两种不同类型的大肠杆菌载体pET32a和pCDFDuet上；两种类型的载体可在大肠杆菌共存，并将这两种接有目的基因的载体同时转入。实现了在减少目的蛋白包涵体的同时，不会降低目的蛋白表达量，且无需添加化学物质或增加发酵能耗。
需要说明的是，虽然已通过以上实施例阐明了本发明的一些特征，但不能用于限制本发明。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的构思和原则之内，还可做出若干简单替换，这些均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
＜110＞广安摩珈生物科技有限公司
＜120＞重组大肠杆菌表达L-天冬氨酸-α-脱羧酶的载体和方法
＜130＞CID210064
＜160＞2
＜170＞PatentIn version 3.5
＜210＞1
＜211＞1623
＜212＞DNA
＜213＞Tribolium castaneum
＜400＞1
atgccggcca caggcgaaga ccaagacctg gtgcaagacc tcatcgagga gcccgccacc 60
ttcagcgacg ccgtcctctc ctccgacgag gaactcttcc accagaagtg ccccaaaccc 120
gcccccattt actccccggt ctcgaaaccg gtctccttcg agagcctccc caacaggcgc 180
ctccacgagg agttcctccg cagctcggtg gacgtcctcc tccaggaggc ggtgttcgag 240
ggaacgaacc gcaagaaccg ggtgctgcaa tggcgggagc cggaggagtt gaggcgtctg 300
atggactttg gggtgcggag tgcgccctcc acgcacgagg agttgttgga ggtgttgaag 360
aaggttgtaa cttattcggt taaaaccgga catccgtact tcgtgaacca gttgttctcg 420
gcggtggatc cgtacggttt ggtggcacaa tgggccacgg atgcgctcaa tccgagtgtt 480
tacacctacg aggtttcgcc ggtttttgtt ctgatggagg aagtggtttt gagggagatg 540
agggccattg tggggttcga ggggggaaag ggcgatggga ttttttgccc aggagggtcc 600
attgccaatg gatatgccat cagttgtgcc agatacaggt ttgtgcccga tattaagaaa 660
aaaggcctcc actctctccc ccgtttggtc ctcttcacct ctgaagatgc ccactattcc 720
atcaaaaaac tcgcctcttt ccaaggcatc ggcaccgaca acgtctactt gatacgaacg 780
gacgcccgag gtcgcatgga cgtctcgcac ctggtggagg aaatcgagcg ttcgctccgt 840
gaaggcgccg ctcctttcat ggtcagtgcc accgctggaa ccacagtgat tggtgccttt 900
gaccccatcg aaaaaatcgc agatgtgtgc caaaaataca aactgtggtt gcacgtggat 960
gccgcctggg gaggtggcgc gcttgtctct gccaaacacc gccacctcct caaagggatt 1020
gagagggccg actcggtcac ctggaaccct cacaaactcc taacagcccc ccagcaatgt 1080
tccacacttt tactgcgaca tgagggtgtc ctcgccgagg cgcattccac gaacgccgct 1140
tacctcttcc aaaaagacaa attctacgac accaaatacg acacgggcga caagcacatc 1200
cagtgcggcc gcagggccga cgtcctcaag ttctggttca tgtggaaggc gaagggaaca 1260
tcagggttgg agaaacacgt cgataaagtg ttcgaaaatg cgagattttt caccgattgt 1320
ataaaaaatc gggaagggtt tgaaatggtg atagcggagc ccgaatacac aaacatctgc 1380
ttttggtacg tgccgaagag tctgaggggg cgcaaggacg aagccgatta caaagacaag 1440
ctgcataagg tggcccccag gattaaggag aggatgatga aggagggctc catgatggtc 1500
acgtaccagg cgcaaaaggg acacccgaat tttttcagga ttgtgttcca gaattcgggg 1560
cttgacaagg ctgatatggt gcaccttgtt gaggagattg agcggttggg gagcgatctt 1620
tga 1623
＜210＞2
＜211＞540
＜212＞PRT
＜213＞Tribolium castaneum
＜400＞2
Met Pro Ala Thr Gly Glu Asp Gln Asp Leu Val Gln Asp Leu Ile Glu
1 5 10 15
Glu Pro Ala Thr Phe Ser Asp Ala Val Leu Ser Ser Asp Glu Glu Leu
20 25 30
Phe His Gln Lys Cys Pro Lys Pro Ala Pro Ile Tyr Ser Pro Val Ser
35 40 45
Lys Pro Val Ser Phe Glu Ser Leu Pro Asn Arg Arg Leu His Glu Glu
50 55 60
Phe Leu Arg Ser Ser Val Asp Val Leu Leu Gln Glu Ala Val Phe Glu
65 70 75 80
Gly Thr Asn Arg Lys Asn Arg Val Leu Gln Trp Arg Glu Pro Glu Glu
85 90 95
Leu Arg Arg Leu Met Asp Phe Gly Val Arg Ser Ala Pro Ser Thr His
100 105 110
Glu Glu Leu Leu Glu Val Leu Lys Lys Val Val Thr Tyr Ser Val Lys
115 120 125
Thr Gly His Pro Tyr Phe Val Asn Gln Leu Phe Ser Ala Val Asp Pro
130 135 140
Tyr Gly Leu Val Ala Gln Trp Ala Thr Asp Ala Leu Asn Pro Ser Val
145 150 155 160
Tyr Thr Tyr Glu Val Ser Pro Val Phe Val Leu Met Glu Glu Val Val
165 170 175
Leu Arg Glu Met Arg Ala Ile Val Gly Phe Glu Gly Gly Lys Gly Asp
180 185 190
Gly Ile Phe Cys Pro Gly Gly Ser Ile Ala Asn Gly Tyr Ala Ile Ser
195 200 205
Cys Ala Arg Tyr Arg Phe Val Pro Asp Ile Lys Lys Lys Gly Leu His
210 215 220
Ser Leu Pro Arg Leu Val Leu Phe Thr Ser Glu Asp Ala His Tyr Ser
225 230 235 240
Ile Lys Lys Leu Ala Ser Phe Gln Gly Ile Gly Thr Asp Asn Val Tyr
245 250 255
Leu Ile Arg Thr Asp Ala Arg Gly Arg Met Asp Val Ser His Leu Val
260 265 270
Glu Glu Ile Glu Arg Ser Leu Arg Glu Gly Ala Ala Pro Phe Met Val
275 280 285
Ser Ala Thr Ala Gly Thr Thr Val Ile Gly Ala Phe Asp Pro Ile Glu
290 295 300
Lys Ile Ala Asp Val Cys Gln Lys Tyr Lys Leu Trp Leu His Val Asp
305 310 315 320
Ala Ala Trp Gly Gly Gly Ala Leu Val Ser Ala Lys His Arg His Leu
325 330 335
Leu Lys Gly Ile Glu Arg Ala Asp Ser Val Thr Trp Asn Pro His Lys
340 345 350
Leu Leu Thr Ala Pro Gln Gln Cys Ser Thr Leu Leu Leu Arg His Glu
355 360 365
Gly Val Leu Ala Glu Ala His Ser Thr Asn Ala Ala Tyr Leu Phe Gln
370 375 380
Lys Asp Lys Phe Tyr Asp Thr Lys Tyr Asp Thr Gly Asp Lys His Ile
385 390 395 400
Gln Cys Gly Arg Arg Ala Asp Val Leu Lys Phe Trp Phe Met Trp Lys
405 410 415
Ala Lys Gly Thr Ser Gly Leu Glu Lys His Val Asp Lys Val Phe Glu
420 425 430
Asn Ala Arg Phe Phe Thr Asp Cys Ile Lys Asn Arg Glu Gly Phe Glu
435 440 445
Met Val Ile Ala Glu Pro Glu Tyr Thr Asn Ile Cys Phe Trp Tyr Val
450 455 460
Pro Lys Ser Leu Arg Gly Arg Lys Asp Glu Ala Asp Tyr Lys Asp Lys
465 470 475 480
Leu His Lys Val Ala Pro Arg Ile Lys Glu Arg Met Met Lys Glu Gly
485 490 495
Ser Met Met Val Thr Tyr Gln Ala Gln Lys Gly His Pro Asn Phe Phe
500 505 510
Arg Ile Val Phe Gln Asn Ser Gly Leu Asp Lys Ala Asp Met Val His
515 520 525
Leu Val Glu Glu Ile Glu Arg Leu Gly Ser Asp Leu
530 535 540
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