一种大肠杆菌突变体的构建方法及外膜囊泡的制备方法
阅读说明：本技术 一种大肠杆菌突变体的构建方法及外膜囊泡的制备方法 (Construction method of escherichia coli mutant and preparation method of outer membrane vesicle ) 是由 沈锡辉 杨亚东 王瑶 孙宇 唐亚楠 肖志博 于 2021-09-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种大肠杆菌突变体的构建方法及外膜囊泡的制备方法。其包括大肠杆菌外膜囊泡高产突变体的构建和外膜囊泡的提取,所述突变体是通过CRISPR-Cas9系统同时敲除大肠杆菌Tol-pal内膜系统蛋白(如SEQ ID NO:1所示)和外膜磷脂积累相关蛋白(如SEQ ID NO:2所示)进行构建。所述外膜囊泡的提取包括：将菌株培养于LB液体培养基,将培养上清过滤除菌、超滤浓缩和超速离心,最终获得外膜囊泡。本发明中双基因的缺失发挥了协同作用,与现有单双基因突变株相比,不仅可显著提高外膜囊泡产量,较原始菌株提高了约180倍,而且所得外膜囊泡具有高纯度、粒径大小适当等特点,是一种低廉、高效的制备方法,解决了外膜囊泡产量不足的问题,展现了其良好的应用前景。(The invention discloses a construction method of an escherichia coli mutant and a preparation method of an outer membrane vesicle. The method comprises the construction of high-yield mutants of the outer membrane vesicles of the escherichia coli and the extraction of the outer membrane vesicles, wherein the mutants are constructed by simultaneously knocking out proteins (shown as SEQ ID NO: 1) of an inner membrane system of the escherichia coli Tol-pal and proteins (shown as SEQ ID NO: 2) related to the accumulation of outer membrane phospholipids through a CRISPR-Cas9 system. The extraction of the outer membrane vesicles comprises: culturing the strain in LB liquid culture medium, filtering culture supernatant for sterilization, ultrafiltering, concentrating and ultracentrifuging to obtain outer membrane vesicle. The deletion of double genes plays a synergistic role, compared with the existing single-double gene mutant strain, the double-gene mutant strain not only can obviously improve the yield of the outer membrane vesicles and improve the yield by about 180 times compared with the original strain, but also has the characteristics of high purity, proper particle size and the like, is a cheap and efficient preparation method, solves the problem of insufficient yield of the outer membrane vesicles, and shows good application prospect.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种大肠杆菌突变体的构建方法及外膜囊泡的制备方法。
背景技术
细菌外膜囊泡(outer membrane vesicles，OMVs)主要是革兰氏阴性菌在生长过程中产生的囊泡，其粒径为20-300nm。OMVs有很多病原相关分子模式，包括脂多糖、免疫调节蛋白、细菌DNA，能与宿主的模式识别受体结合而诱导免疫反应，同时这些OMVs成分可以作为Toll样受体(toll-like receptor，TLR)的配体，使OMVs成为很好的免疫佐剂，其具有内源性的生物功能，作为生物膜递送系统能够靶向进入细胞并与其相互作用。研究表明，OMVs作为细菌的主要信号传递载体，可保护并通过表面配体将效应分子准确无误地递送至目标地点，完成信息在细菌-细菌，细菌-宿主间的物质交换，因此OMVs又被称为细菌的0型分泌系统(T0SS)。
OMVs分泌系统具有诸多经典分泌系统所不具有的优点，与经典的细菌I-VI型分泌系统(T1SS-T6SS)相比，其可以在不依赖于细胞接触的条件下，作为一种纳米级载体，通过长距离靶向运输提供给远端细胞，并可保护其装载的蛋白和核酸等货物免受外部环境的破坏和影响。迄今研究过的所有革兰氏阴性细菌均可释放OMVs。由于OMVs无生命活性，且能有效激活免疫系统，产生保护性免疫反应，同时作为一种天然纳米系统，OMVs独特的生理特性使其具有人工合成纳米材料载体所不具有的独特优势，并可通过基因工程操作同时呈递多种外源蛋白，因此已成为疫苗研发的热门。例如B型脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)OMVs疫苗(商品名Bexsero)已在欧美上市，基于OMVs预防其他传染性疾病的疫苗研究工作也已在进行中。
细菌外膜囊泡作为新型递呈载体已进行了大量的研究工作，主要集中在OMVs的分泌量、安全性和递呈效率等方面，以使其能够成为更好的安全高效的递呈载体系统。Bernadac等将大肠杆菌Tol-pal内膜系统不同单基因突变体组合缺失构建筛选出双基因突变体JC8031，可使OMVs的产量得到了明显提高，奠定了OMVs的应用基础。近年来，细菌外膜囊泡作为药物递送系统受到广泛关注和研究，OMVs作为生物来源的纳米载体，具有生物可降解性、能够逃避宿主天然免疫反应、能够携带不同药物运用其生物相容性很好的到达作用靶点，提高药物的渗透性及作用敏感性。Gujrati等研究表明，大肠杆菌分泌的OMVs可通过电转使其内腔携带siRNA，同时表面表达人表皮生长因子受体2(HER2)特异性亲合体作为肿瘤细胞靶向配体治疗癌症，显示出了良好的作用效果，展现出了良好的应用前景。
细菌外膜囊泡的有效提取是OMVs上述研究及应用的基础，但野生型大肠杆菌OMVs的产量在广泛应用中依然受限，如何获得高产且高纯度的OMVs显得尤为重要。因此，能够获得大量分泌OMVs的高产大肠杆菌菌株以及可行的提取方法已成为本领域亟待解决的关键问题。
发明内容
本发明的目的在于解决外膜囊泡在广泛应用中产量不足的问题，提供了一种大肠杆菌突变体的构建方法及外膜囊泡的制备方法，不仅可显著提高外膜囊泡的产量，而且所得到的外膜囊泡具有纯度高、粒径大小适当等特点，展现了其良好的应用前景。
本发明解决技术问题所采用的技术方案：
一种大肠杆菌突变体的构建方法，包括：敲除大肠杆菌的Tol-pal内膜系统蛋白和外膜磷脂积累相关蛋白构建；Tol-pal内膜系统蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；外膜磷脂积累相关蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
具体的，通过CRISPR-Cas9系统敲除大肠杆菌的Tol-pal内膜系统蛋白和外膜磷脂积累相关蛋白构建。
可选的，所述的CRISPR-Cas9系统是将携带Cas9蛋白的pCas温敏质粒导入大肠杆菌，将携带sg20以及目标基因上下游同源臂的重组敲除质粒pTargetF同时导入大肠杆菌，通过Cas9蛋白的切割以及目标基因上下游同源臂的同源重组交换，获得敲除目标基因的大肠杆菌突变体。
可选的，所述的pCas温敏质粒在50mM L-arabinose诱导下表达Cas9蛋白，0.5mMKmr的LB固体培养基上，30℃正常培养；在37℃培养8-12h消除pCas温敏质粒。
可选的，所述的重组敲除质粒pTargetF转录形成的sgRNA引导Cas9蛋白切割大肠杆菌染色体，通过同源重组替换断裂的DNA；在0.25mM IPTG诱导下，Cas9蛋白对pTargetF的pMB1复制子切割破坏，消除重组敲除质粒pTargetF。
可选的，编码Tol-pal内膜系统蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；编码外膜磷脂积累相关蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
一种大肠杆菌突变体，采用本发明所述的大肠杆菌突变体的构建方法获得。
一种外膜囊泡的制备方法，以本发明所述的大肠杆菌突变体为培养对象，于培养上清中提取外膜囊泡；培养条件为：LB液体培养基37℃、200r/min培养20～24h。
可选的，所述的培养上清分别应用8000rpm离心5min和6000rpm离心15min去除菌体；上清再通过分子截留和离心获得外膜囊泡。
一种外膜囊泡的制备方法，包括：(1)大肠杆菌高产突变体的构建：通过CRISPR-Cas9系统敲除大肠杆菌的Tol-pal内膜系统蛋白和外膜磷脂积累相关蛋白构建；Tol-pal内膜系统蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；外膜磷脂积累相关蛋白的氨基酸序列如SEQID NO:2所示；
(2)于(1)中得到的大肠杆菌高产突变体的培养上清中提取得到外膜囊泡：培养条件为：LB液体培养基37℃、200r/min培养20～24h。
本发明所述的外膜囊泡的制备方法制备得到的外膜囊泡用于制备疫苗、免疫增强剂或纳米递呈载体的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过CRISPR-Cas9基因工程改造技术，可以很容易实现工程大肠杆菌的制备，获得高产外膜囊泡的大肠杆菌突变体，操作简单易行；本发明构建的大肠杆菌突变体，不需要抗生素维持，且具有遗传稳定性，可在工业生产中大量培养；
本发明获得的大肠杆菌双基因突变体与现有的Bernadac等已报道的其他不同单基因突变体组合缺失的双基因突变体JC8031相比，外膜囊泡产量显著增加，较原始菌株的产量提高了约180倍，能够很好的解决外膜囊泡在临床应用中产量低的弊端，显著降低了生产成本。本发明中通过分子截留量大小为100KDa的切向流膜包仪可以实现对大量培养上清过滤液的持续浓缩，可在工业生产中广泛应用，且可获得高纯度，粒径大小适当的外膜囊泡。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的
具体实施方式
一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1是本发明中大肠杆菌Δb0783Δb3149双基因突变体构建过程示意图；
图2是本发明中大肠杆菌Δb0783Δb3149双基因突变体构建结果示意图；
图3野生型大肠杆菌与其他突变体生长趋势示意图；
图4通过粒径分析(Nanosight)各菌株粒径大小的粒径图；
图5通过透射电子显微镜(TEM)观察提取的外膜囊泡；
图6通过主要外膜蛋白的SDS-PAGE检测野生型菌株与突变体菌株外膜囊泡产量。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施方案对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
本发明中，大肠杆菌突变体是通过CRISPR-Cas9系统敲除大肠杆菌Tol-pal内膜系统蛋白(如SEQ ID NO:1所示)和外膜磷脂积累相关蛋白(如SEQ ID NO:2所示)构建。
本发明中，编码Tol-pal内膜系统蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明中，编码外膜磷脂积累相关蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明中，所述CRISPR-Cas9系统是将携带Cas9蛋白的pCas温敏质粒导入大肠杆菌，将携带sg20以及目标基因上下游同源臂的重组敲除质粒pTargetF同时导入大肠杆菌，通过Cas9蛋白的切割以及目标基因上下游同源臂的同源重组交换，获得敲除目标基因的大肠杆菌外膜囊泡高产突变体。
本发明中，pCas温敏质粒在50mM L-arabinose诱导下表达Cas9蛋白，0.5mM Kmr的LB固体培养基上，30℃正常培养。在37℃培养8-12h消除pCas温敏质粒。
本发明中，重组敲除质粒pTargetF转录形成的sgRNA引导Cas9蛋白切割大肠杆菌染色体，通过同源重组替换断裂的DNA。在0.25mM IPTG诱导下，Cas9蛋白对pTargetF的pMB1复制子切割破坏，消除重组敲除质粒pTargetF。
本发明中，所述细菌培养上清中外膜囊泡的提取采用以下步骤：
(1)将大肠杆菌在LB液体培养基37℃、200r/min培养20-24h。分别应用8000rpm离心5min，6000rpm离心15min去除菌体，培养上清经0.45μm滤膜过滤后用于浓缩；
(2)通过分子截留量大小为100KDa的切向流膜包仪对上述过滤液进行浓缩，将浓缩液经Beckman Coulter超速离心机Type 70Ti转子以150000g超速离心2h，获得细菌外膜囊泡。
本发明的大肠杆菌外膜囊泡产量的制备方法，所述制备方法具体如下：(1)大肠杆菌外膜囊泡高产突变体的构建；(2)细菌培养上清中外膜囊泡的提取。
本发明中获得的细菌外膜囊泡可在疫苗制备及免疫增强剂中应用，并且可在药物及其他小分子中作为纳米递呈载体进行应用。
实施例1：大肠杆菌Δb0783Δb3149双基因突变体构建
该实施例提供了运用CRISPR-Cas9系统敲除大肠杆菌中的目标基因，目标基因分别命名为b0783和b3149，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。分别构建了大肠杆菌Δb0783单基因突变体、大肠杆菌Δb3149单基因突变体和大肠杆菌Δb0783Δb3149双基因突变体，其中Δb0783Δb3149双基因突变体是在Δb0783单基因突变体基础上进一步敲除b3149，方法一致。
实施方案以Δb0783单基因突变体为例描述突变体构建的具体过程，构建过程如图1所示，步骤如下：
(1)材料
大肠杆菌DH5α购买自天根生物科技北京有限公司，大肠杆菌Nissle 1917购自中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2017345，pTargetF质粒和pCas质粒以及各种限制性内切酶购自宝生物工程(大连)有限公司；
LB液体培养基：0.01g/mLNaCl，0.01g/mL胰蛋白胨，0.005g/mL酵母浸出物；LB固体培养基：0.01g/mLNaCl，0.01g/mL胰蛋白胨，0.005g/mL酵母浸出物，0.015g/mL琼脂；各培养基根据需要加入终浓度为50μg/mL的卡那霉素，25μg/mL的氯霉素。
(2)引物设计
根据GenBank上已公布的大肠杆菌K-12MG1655株(GenBank No.U00096.3)基因序列，设计目标基因b0783上下游同源臂引物，用引物PA/PB扩增b0783基因的上游同源臂AB，用引物PC/PD扩增出下游同源臂CD。PE/PF为敲除质粒pTargetF中sg20的上游引物和下游引物。
a)引物序列如下：
PA:5'-CCGAGTCGGTGCTTTTTTTGAACCGGAAGCCGTAGTGGAA-3'；
PB:5'-GCAAGGGAAACGCAGATGTTGGACTTGAGATCGCGACGAC-3'；
PC:5'-GTCGTCGCGATCTCAAGTCCAACATCTGCGTTTCCCTTGC-3'；
PD:5'-GGTAATAGATCTAAGCTTCTGCAGGTCGACCCTCTTCCGCTTGCTTCTG-3'；
PE:5'-AGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATACTAGTCCAGTGATTGTTGAAGTGTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3'；
PF:5'-TTCCACTACGGCTTCCGGTTCAAAAAAAGCACCGACTCGG-3'。
b)扩增体系见表1：
表1各基因片段PCR扩增体系
c)反应程序为：
预变性95℃，5min；(变性95℃，30s；退火50℃，30s；延伸72℃，1min/kb)×10个循环；(变性95℃，30s；退火52℃，30s；延伸72℃，1min/kb)×20个循环；最后72℃延伸10min；16℃保温。结束后将PCR产物进行电泳检测。
(3)重组敲除质粒的制备
参照天根质粒回收试剂盒说明书，回收各基因片段产物，再通过重叠PCR构建sg20与目标基因b0783上下游同源臂的融合基因片段AF；参照天根质粒提取试剂盒，提取敲除质粒pTargetF。
a)酶切反应体系和条件见表2：
表2双酶切反应体系
涡旋混匀之后，置于37℃培养箱酶切8～12h；酶切完成后进行DNA回收。
b)连接反应体系和条件见表3：
表3连接反应体系
置于50℃连接仪，连接1h。
c)克隆的筛选和鉴定：将连接产物转化至大肠杆菌DH5α，将其涂布在含有氯霉素的LB固体平板上，通过菌落PCR验证和序列测定得到阳性克隆pTargetF-AF。
(4)b0783基因缺失株的制备
①参照天根质粒提取试剂盒，提取表达Cas9蛋白的PCas质粒，采用热激法将该质粒转化到对应的大肠杆菌Nissle 1917中。
②含有PCas质粒的大肠杆菌感受态细胞的制备，将过夜培养的大肠杆菌转接到含有50mM L-ArG的LB液体培养基中，30℃摇至对数期，无菌ddH2O洗涤3次，每次5000rpm，4℃离心5min，最后加入适当ddH2O混匀后100μL/管分装，用于电转。
③突变体的筛选，将验证正确的重组敲除质粒pTargetF-AF电转至上述感受态细胞，30℃复苏后涂布于含有50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的LB固体培养皿中，过夜培养后运用同源上臂的上游引物PA和同源下臂的下游引物PD对突变体进行鉴定，获得含有pTargetF和PCas质粒的突变体菌株。
④质粒的消除，将上述获得的含有pTargetF和PCas质粒的突变体菌株培养于含有0.25mM IPTG的LB液体培养基中，在诱导下，Cas9蛋白对pTargetF的pMB1复制子切割破坏，消除重组敲除质粒pTargetF。然后再将只含有PCas质粒的突变体菌株在37℃培养8-12h消除pCas温敏质粒，最终获得大肠杆菌Δb0783单基因突变体。
(5)大肠杆菌Δb3149单基因突变体和Δb0783Δb3149双基因突变体的构建
大肠杆菌Δb3149单基因突变体的构建与b0783基因缺失株的构建方法一致，其中Δb0783Δb3149双基因突变体是在Δb0783单基因突变体基础上进一步敲除b3149，方法与b0783基因缺失株的构建方法一致，构建鉴定结果如图2所示，成功获得了大肠杆菌Δb3149和Δb0783单基因突变体以及Δb0783Δb3149双基因突变体。
实施例2：菌株的培养和外膜囊泡的制备
(1)将上述获得的大肠杆菌Δb0783单基因突变体、Δb3149单基因突变体和Δb0783Δb3149双基因突变体划线接种于LB固体培养基，37℃培养过夜，挑取单菌落接种于LB液体培养基作为母液用于扩大培养。将母液以体积比1:100转接至含有1L的LB液体培养基的锥形瓶中，在37℃、200rpm/min振荡培养20～24h。
(2)将上述培养后的菌液分别应用8000rpm离心5min，6000rpm离心15min去除菌体，培养上清经0.45μm滤膜过滤后用于浓缩；通过分子截留量大小为100KDa的切向流膜包仪对上述过滤液进行浓缩，将浓缩液经Beckman Coulter超速离心机Type70Ti转子以150000g超速离心2h收集外膜囊泡，然后再用50mM HEPES(pH 8.0)悬浮，接着在Millipore100-kDa超滤管中用50mM HEPES(pH 8.0)洗两次，用50mM HEPES(pH 8.0)悬浮OMV后，通过0.22μm滤膜过滤除菌，获得细菌外膜囊泡，保存于-80℃。
实施例3：大肠杆菌突变体高产外膜囊泡的鉴定
(1)各菌株生长情况的测定，将各菌株在LB液体培养基中37℃培养过夜，无菌生理盐水连续10倍稀释，取100μL适当稀释度菌液均匀涂布于LB固体平板上，每个稀释度做3个重复，37℃培养过夜，计数，取平均值计算原液的CFU。然后以终浓度约为106CFU/mL转接于相同液体培养基，200r/min、37℃培养，于24h时取样通过OD600测定菌落生长情况，结果如图3所示，与原始菌株相比，敲除Δb3149或Δb0783单基因均可影响菌株的生长状态，同时敲除Δb3149和Δb0783双基因影响最为显著。
(2)各菌株外膜囊泡粒径检测，取外膜囊泡样品，用过滤的PBS按照1:10、1:100、1:1000的比例稀释，用纳米激光粒度仪检测各菌株产生囊泡的粒径，至仪器检测结果Pdl值不超过0.5且result quality评估为good。检测样品工作体积为1～1.5mL，置于比色皿中混匀，放入仪器进行检测，仪器会自动进行3次重复检测。结果如图4所示，各菌株所产外膜囊泡的粒径大小没有明显差异，且均集中在100nm左右。
(3)各菌株提取外膜囊泡的透射电镜检测，采用负染法，取适量外膜囊泡样品滴于具有支持膜的铜网上，静置5min，滤纸吸去多余悬液，置于透射电镜进行观察。结果如图5所示，所获得的囊泡具有典型的双层膜结构，且具有高纯度、粒径大小均一等特征。
(4)各菌株外膜囊泡产量的检测，根据外膜囊泡主要外膜蛋白的含量，通过ImageJ软件对SDS-PAGE后的主要蛋白条带亮度进行评估，结果如图6所示，与Δb3149或Δb0783单基因突变体以及现有的Bernadac等已报道的其他不同单基因突变体组合缺失的双基因突变体JC8031相比，本发明中的Δb3149和Δb0783双基因突变体显著的提高了外膜囊泡的产量。
本发明通过CRISPR-Cas9基因工程改造技术，可以很容易实现工程大肠杆菌的制备，获得高产外膜囊泡的大肠杆菌突变体，操作简单易行；本发明构建的大肠杆菌突变体，不需要抗生素维持，且具有遗传稳定性，可在工业生产中大量培养；本发明获得的大肠杆菌双基因突变体与现有的Bernadac等已报道的其他不同单基因突变体组合缺失的双基因突变体JC8031相比，外膜囊泡产量显著增加，较原始菌株的产量提高了约180倍，能够很好的解决外膜囊泡在临床应用中产量低的弊端，显著降低了生产成本。本发明中通过分子截留量大小为100KDa的切向流膜包仪可以实现对大量培养上清过滤液的持续浓缩，可在工业生产中广泛应用，且可获得高纯度，粒径大小适当的外膜囊泡。
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
核苷酸序列表电子文件
<110>西北农林科技大学
<120>一种大肠杆菌突变体的构建方法及外膜囊泡的制备方法
<160>4
<170>SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211>142
<212> PRT
<213>人工序列（Artificial sequence），大肠杆菌Tol-pal内膜系统蛋白
<400> 1
Met Ala Arg Ala Arg Gly Arg Gly Arg Arg Asp Leu Lys Ser Glu Ile Asn IleVal Pro 20
Leu Leu Asp Val Leu Leu Val Leu Leu Leu Ile Phe Met Ala Thr Ala Pro IleIle Thr 40
Gln Ser Val Glu Val Asp Leu Pro Asp Ala Thr Glu Ser Gln Ala Val Ser SerAsn Asp 60
Asn Pro Pro Val Ile Val Glu Val Ser Gly Ile Gly Gln Tyr Thr Val Val ValGlu Lys 80
Asp Arg Leu Glu Arg Leu Pro Pro Glu Gln Val Val Ala Glu Val Ser Ser ArgPhe Lys 100
Ala Asn Pro Lys Thr Val Phe Leu Ile Gly Gly Ala Lys Asp Val Pro Tyr AspGlu Ile 120
Ile Lys Ala Leu Asn Leu Leu His Ser Ala Gly Val Lys Ser Val Gly Leu MetThr Gln 140
Pro Ile 142
<210>2
<211>260
<212>PRT
<213>人工序列（Artificial sequence），大肠杆菌外膜磷脂积累相关蛋白
<400>2
Met Leu Leu Asn Ala Leu Ala Ser Leu Gly His Lys Gly Ile Lys Thr Leu ArgThr Phe 20
Gly Arg Ala Gly Leu Met Leu Phe Asn Ala Leu Val Gly Lys Pro Glu Phe ArgLys His 40
Ala Pro Leu Leu Val Arg Gln Leu Tyr Asn Val Gly Val Leu Ser Met Leu IleIle Val 60
Val Ser Gly Val Phe Ile Gly Met Val Leu Gly Leu Gln Gly Tyr Leu Val LeuThr Thr 80
Tyr Ser Ala Glu Thr Ser Leu Gly Met Leu Val Ala Leu Ser Leu Leu Arg GluLeu Gly 100
Pro Val Val Ala Ala Leu Leu Phe Ala Gly Arg Ala Gly Ser Ala Leu Thr AlaGlu Ile 120
Gly Leu Met Arg Ala Thr Glu Gln Leu Ser Ser Met Glu Met Met Ala Val AspPro Leu 140
Arg Arg Val Ile Ser Pro Arg Phe Trp Ala Gly Val Ile Ser Leu Pro Leu LeuThr Val 160
Ile Phe Val Ala Val Gly Ile Trp Gly Gly Ser Leu Val Gly Val Ser Trp LysGly Ile 180
Asp Ser Gly Phe Phe Trp Ser Ala Met Gln Asn Ala Val Asp Trp Arg Met AspLeu Val 200
Asn Cys Leu Ile Lys Ser Val Val Phe Ala Ile Thr Val Thr Trp Ile Ser LeuPhe Asn 220
Gly Tyr Asp Ala Ile Pro Thr Ser Ala Gly Ile Ser Arg Ala Thr Thr Arg ThrVal Val 240
His Ser Ser Leu Ala Val Leu Gly Leu Asp Phe Val Leu Thr Ala Leu Met PheGly Asn 260
<210>3
<211>426
<212>DNA
<213>人工序列（Artificial sequence），大肠杆菌Tol-pal内膜系统蛋白
<400>3
atggccagag cgcgtggacg aggtcgtcgc gatctcaagt ccgaaatcaa cattgtaccg 60
ttgctggacg tactgctggt gctgttgctg atctttatgg cgacagcgcc catcatcacc 120
cagagcgtgg aggtcgatct gccagacgct actgaatcac aggcggtgag cagtaacgat 180
aatccgccag tgattgttga agtgtctggt attggtcagt acaccgtggt ggttgagaaa 240
gatcgtctgg agcgtttacc accagagcag gtggtggcgg aagtgtccag ccgtttcaag 300
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attaaagcac tgaacttgtt acatagtgcg ggtgtgaaat cggttggttt aatgacgcag 420
cctatc 426
<210>4
<211>780
<212>DNA
<213>人工序列（Artificial sequence），大肠杆菌外膜磷脂积累相关蛋白
<400>4
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cactcgtctc tggctgttct ggggctggat tttgtgctga ccgcattgat gtttgggaat 780
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